Ein vereinfachtes System zur Bewertung der Zell Mechanosensing und Durotaxis<em&gt; In-vitro-</em

Zusammenfassung

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Zusammenfassung

Die Zusammensetzung und die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix sind sehr variabel zwischen Gewebetypen. Diese Bindegewebsstroma Vielfalt großen Einfluss auf das Zellverhalten normalen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zellproliferation, Differenzierung, Adhäsion Signalisierung und gerichtete Migration zu regulieren. In dieser Hinsicht ist die angeborene Fähigkeit von bestimmten Zelltypen, auf eine steifere oder weniger nachgiebig Matrixsubstrat wird als durotaxis bezeichnet migrieren. Dieses Phänomen spielt eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Invasion von Krebszellen. Hier beschreiben wir einen einfachen Test zur durotaxis studieren, in vitro, mit Polydimethylsiloxan (PDMS) Substraten. Herstellung der beschriebenen durotaxis Kammern schafft eine Steifigkeit Schnittstelle zwischen dem relativ weichen PDMS-Gel und einem starren Deckglas. Im vorliegenden Beispiel haben wir diese durotaxis Kammern verwendet, um eine Rolle des cdc42 demonstrieren / Rac1 GTPase aktivierende Protein, cdGAP, in mechanosensing und durotaxis Regulierung im menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen. Dieser Test ist leicht an andere Zelltypen und / oder Zuschlags anderer Proteine ​​von Interesse, ihre jeweiligen Rollen in mechanosignaling und durotaxis erkunden.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (ECM) besteht aus einer komplexen Reihe von strukturellen und Vernetzungsproteinen einschließlich Kollagen, Fibronectin und Laminin besteht. Es ist zwar bekannt, dass die ECM liefert wichtige strukturelle Unterstützung für Zellgewebe gibt es zunehmend Hinweise darauf, daß Zellen, aktiv auf physikalische Veränderungen zu reagieren in der ECM-Umgebung zu unterschiedlichen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellüberlebens, der Differenzierung und der Zellmigration regulieren. Beispielsweise können Unterschiede in der Steifigkeit der ECM mesenchymalen Stammzellen gegenüber verschiedenen Linien fahren, mit weicher Substrate (~ 1 kPa) Förderung neurogene Linien während steife (~ 25 kPa) Substrate fördern osteogene Differenzierung ^1. Ähnlich kann eine Erhöhung der Steifigkeit Stromamatrix wurde gezeigt, dass Brust Epithelzelle Tumorigenese und Invasion in das umliegende Gewebe ^2,3 fördern.

Ein besonders interessanter Aspekt dieser mechanosignaling Aktivität resultiert in einem Verfahren, wie durotaxis, bei dem Zellen wandern bevorzugt in Richtung eines starren Substrats ^4,5 bekannt. Zellen ständig erfassen die physikalischen Eigenschaften ihrer extrazellulären Umgebung durch Integrin-Rezeptor-Bindung an den ECM. Dies wiederum fördert die Ansammlung von zahlreichen strukturellen und Signalproteinen, ihre zytoplasmatischen Domänen, die Bildung von Klebstoff fokalen Adhäsionen oder fokalen Kontakten ^6,7 bekannten Strukturen zu fahren. Da Integrine haben keine inhärente enzymatische Aktivität werden Signale von der ECM durch diese Hilfsproteine ​​übertragen, um die Antwort der Zelle auf ihre sich verändernden Umwelt ⁸ koordinieren. Dementsprechend ist die Identifizierung und Charakterisierung der Schlüsselproteinen regulieren mechanosignaling und durotaxis involviert ein wichtiges Forschungsgebiet.

Verschiedene Modellsysteme entwickelt worden, um zu studieren durotaxis in vitro, aber die meisten habenverwendet kollagenbeschichteten Polyacrylamid ^Substrate 4. Jedoch kann die Vorbereitung der Polyacrylamid Substrate technisch anspruchsvoll sein und das Kollagen in diesen Assays verwendet werden, müssen chemisch vernetzt mit dem Substrat ⁹ ist. Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrate wurde gezeigt, dass vergleichbare mechanische Eigenschaften wie die Polyacrylamid ^Substrate 10 aufweisen. Jedoch PDMS Substraten durch einfaches Mischen ein Verhältnis der Base zu Vernetzer hergestellt, und diese Substrate können mit ECM-Proteine ​​ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung beschichtet werden, wodurch eine einfachere PDMS Werkzeug, um die Wirkungen der Steifheit auf das Zellverhalten zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie eine einfache durotaxis Kammer, in der ein weiches PDMS-Substrat mit einem starren Deckglas integriert vorzubereiten.

Der Test, wie unten beschrieben, bietet eine schnelle und einfache Methode, um durotaxis studieren. Für diese Studie menschlichen U2OS Osteosarkom-Zellen in Kombination mit siRNA-vermittelten verwendeten wirKnockdown von cdGAP, um die Rolle dieser focal adhesion protein in durotaxis ¹¹ zu studieren. Wichtiger ist, daß dieses Protokoll leicht den individuellen Bedürfnissen angepasst werden. Andere Zelltypen können für die U2OS-Zellen ersetzt werden und jedes Protein kann abgerissen oder überexprimiert wird, um die Auswirkungen auf das Zellverhalten während durotaxis bestimmen. Weiterhin kann das Protokoll angepasst ist, um fluoreszent markierte Proteine ​​enthalten, um ihre Dynamik und das Verhalten mit FRAP oder FRET Ansätze analysiert werden.

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Protokoll

1. Herstellung von Durotaxis Chambers

1. Einem 6-Loch-Gewebekulturplatte herzustellen, tarieren Sie die Waage mit einem 50-ml konischen Röhrchen. Man wiegt etwa 10 g des PDMS-Grundlösung in der 50-ml-Tube (die Lösung ist ziemlich viskos).
2. Für ein 90: 1 Substrat (Einhaltung von ~ 1 kPa), unterteilen das gemessene Gewicht des PDMS-Grundlösung in der Röhre um 90, um die richtige Menge an Vernetzer-Lösung benötigt bestimmen. Die berechnete Menge des PDMS-Vernetzer-Lösung auf die gleiche Röhre.
   Beispiel: 10 g / 90 = 0,11 g. In 0,11 g des PDMS-Vernetzer-Lösung auf den PDMS-Basislösung.
   HINWEIS: Die Basis und Vernetzungslösungen werden sowohl in der PDMS-Kit zur Verfügung gestellt.
3. Kräftig mischen die PDMS-base / Vernetzer-Mischung für 5 min bei RT mit einem kleinen Spachtel. In diesem Stadium wird die Mischung einer großen Anzahl von Luftblasen enthält.
4. Zentrifugieren Sie die PDMS-Substrat in einer Tischzentrifuge 5 min bei 50 × g bei RT, die bub entfernenbles. Wenn es noch Blasen nach 5 min, Zentrifuge erneut.
5. Pipette 1 ml 90: 1 PDMS Substrat in jede Vertiefung der Gewebekultur behandelten Platte mit 6 Vertiefungen. Eventuell verbleibende Luft in den PDMS vorhanden Blasen können in dieser Phase durch knallen sie mit einer 21 G-Nadel beseitigt werden. Ermöglichen, dass die PDMS für 30 min in der gut verteilen.
6. Boil 12 mm Glas # 1 Deckgläser in destilliertem Wasser für 5 min. Wiederholen Sie zweimal, und speichern Sie die Deckgläser in destilliertem Wasser.
7. Legen Sie ein, getrocknet Deckglas in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte durch leichtes Berühren einer Seite des Deckglases in die PDMS-Lösung fallen dann das Deckglas auf die PDMS. Als das Deckglas gelegt hat, wird die PDMS beginnen, um die Kanten des Deckglases über eingreifen, aber nicht vollständig abdecken. Dies wird eine Schnittstelle zwischen den PDMS und Glas nach dem Härten erzeugen (siehe 1A, B).
8. Die Platte bei 70 ° C in einem Ofen für 16 Stunden, um zu heilen (verhärten) die PDMS. Setzen Sie den plate in einer Zellkultur Kapuze und UV Sterilisation für 10 Minuten.
   HINWEIS: Am besten ist es, um die Platten innerhalb von ein paar Tagen der Anwendung zu machen. Jedoch können die Platten in Parafilm ohne Puffer eingewickelt und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen ohne nennenswerten Qualitätsminderung gelagert werden.

2. Zell Plating

HINWEIS: Wenn die Untersuchung der Wirkung von siRNA-vermittelten Knockdown, führen Sie die Zuschlags mit den Anweisungen des Herstellers oder des optimierten Protokoll für den Zelltyp der Wahl.

1. Mantel jeweils durotaxis Kammer mit 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin in PBS ohne Calcium und Magnesium für 1 h bei 37 ° C. Alternativ kann das Fibronektin kann den Tag vor der Analyse durch Inkubation der PDMS mit 10 ug / ml Fibronektin in PBS für 16 Stunden bei 4 ° C angewendet werden. Sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Fibronektin in PBS-Lösung eingetaucht.
2. Bereiten hitzedenaturierte 1% BSA. Wiege 0,5 g BSA und löst ihn in 50 ml PBS.Filter sterilisiert die Lösung durch ein 0,22 um Filter und Hitze bei 80 ° C für 12 min.
   Hinweis: Diese Lösung ist der Tag vor dem Beschichten und bei 4 ° C Zelle.
3. Saugen Sie das Fibronektin-Lösung und wäscht 3 mal mit PBS. 1 ml der hitzedenaturierten BSA in PBS in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT.
4. Trypsinize und zählen Zellen der Wahl, während die durotaxis Kammern sind mit der Hitze denaturiert BSA blockiert.
5. Platte 1 x ¹⁰ 5 Zellen in einem Volumen von 2 ml in jede Vertiefung der durotaxis Kammer mit dem für den jeweiligen Zelltyp der Wahl erforderlichen Medien. Damit sich die Zellen anhaften und verteilt auf dem Substrat für 4 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit _5% CO 2.
   HINWEIS: U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 10 IU / ml Penicillin, 10 ug / ml Streptomycin ergänzt.
   HINWEIS: Die Zellzahl in diesem Beispiel verwendet wird, für eine optimierteU2OS-Zellen. Optimierung für andere Zelltypen erforderlich sein können. Diese Dichte verleiht den Zellen genügend Platz, um ohne signifikante Wechselwirkungen mit anderen Zellen wandern.

3. Bildgebung lebender Zellen

1. Führen Sie Live Cell Imaging auf einem inversen Mikroskop mit Phasenkontrast mit einer 10X-Objektiv. Das Mikroskop ist mit einem geschlossenen ökologischen, feuchten Kammer eingebaut werden und ermöglicht die Steuerung der Temperatur bei 37 ° C und 5% _CO 2 während einer Langzeitbildgebung.
2. Nachdem die Zellen für ca. 3,5 Stunden verteilt, montieren Sie die Platte in das Mikroskop Kammer. Die Probe (n) in die Kammer für 30 Minuten äquilibrieren.
3. Up automatisierte Multi-Point-Besuch auf dem Mikroskop falls vorhanden eingestellt. Konzentrieren Sie sich auf der Schnittstelle zwischen den 90: 1 PDMS und dem Deckglas, und wählen Sie Punkte für Bild in der ganzen Oberfläche mit durchschnittlich 40 Punkte pro durotaxis Kammer. Bild die Zellen alle 10 min bis zu 16 h.
   HINWEIS: Die WiederRegion von Interesse wird als zwei Zeilen angezeigt wird, mit der Außenleitung, die dem Rand des Deckglases und der Innenleitung entsprechend der tatsächlichen Grenzfläche zwischen den PDMS und dem Deckglas. Siehe Abbildung 1B.

4. Datenanalyse

1. Erzeugen Sie eine Tabelle wie in Tabelle 1.
2. Zählen die Anzahl der Durchgangsereignisse aus den PDMS auf der Glasoberfläche und umgekehrt von jedem Film erzeugt. Notieren Sie die Anzahl der Durchgangsereignisse in der entsprechenden Spalte in der Excel-Tabelle.
   HINWEIS: Ein Durchgangsereignis wird als der Zellkern, der über die Grenze zwischen dem PDMS und Glas in jede Richtung definiert.
3. Um mehrere Übergänge zu quantifizieren, zu zählen, wie oft die Zelle überquerte die Schnittstelle. Diese Nummer in dem Excel-Spalte entsprechend dem Substrat, auf dem die Zelle an dem Ende des Films angeordnet sind, aufgenommen werden. Wiederholen Sie die Analyse für jede Zelle, die die Schnittstelle in t durchquerter Film. Zellen, die während der Bilderzeugung aus dem Sichtfeld zu migrieren auszuschließen.
   Anmerkung: Es ist auch wichtig, um zu verifizieren, die durch Zellzählung zu Beginn des Experiments, dass die Zellen der Lage sind, auch für die fibronektinbeschichtete PDMS und Deckglas Oberflächen haften.
4. Wird der Prozentsatz an Zellen, die aus PDMS auf der Glasoberfläche (dh unterzog durotaxis) migriert. Hinzufügen der Anzahl der Durchgangsereignisse von weich bis hart und den mehreren Durchgangsereignisse, die auf harte und Dividieren durch die Gesamtzahl der Durchgangsereignisse beendet.
5. Berechnung des Prozentsatzes der mehrfachen Durchgänge durch Teilen der Anzahl von Mehrfachdurchgängen durch die Gesamtzahl von Übergängen.

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Ergebnisse

Ein Schema des durotaxis Kammer ist in 1A gezeigt. Weichen PDMS-Substrat (eine 90: 1 Mischung von PDMS Basis Lösungen Vernetzer) in einer 6 Well-Platte verteilt und ein Deckglas wird oben auf den PDMS, die dann teilweise die obere Oberfläche des Deckglases abdeckt angeordnet, wodurch eine Schnittstelle schaffen zwischen den beiden Substraten unterschiedlicher Compliance. Die Steifigkeit des weichen PDMS Substrat ~ 1 kPa, vergleichbar mit der typischen Einhaltung des Hirngewebes ist, während die Steif...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine einfache Test um durotaxis in migrierenden Zellen zu studieren. Eine große Stärke dieses Tests ist die Leichtigkeit der Herstellung der durotaxis Kammern mit PDMS. Die Steifigkeit der Substrate können leicht durch Ändern des Verhältnisses der PDMS-Basislösung zu Vernetzer, das Studium der verschiedenen Steifigkeiten im Assay ermöglicht manipuliert werden. Allerdings ist eine potenzielle Beschränkung des Systems, dass die Zellen nur auf eine einzige Änderung in der Steifigkeit Substrat ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96