تعديل لColliculo-مهادية قشرية ماوس الدماغ شريحة، دمج الطباعة 3-D من مكونات الغرفة ومتعدد المقاييس التصوير الضوئي

Summary

باستخدام زوايا متعددة لقطع دماغ الفأر الجرو، نحسن على شريحة الدماغ الحادة التي سبق وصفها، الذي يجسد الروابط بين أكثر من المخ الأوسط والدماغ الأمامي الهياكل السمعية الكبرى.

Abstract

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Introduction

في النظام السمعي، على الرغم من أن هناك معالجة كبير من المعلومات بين المحيط الحسي وأكيمة السفلي، هناك معالجة إضافية كبيرا قبل أن تصل إلى القشرة السمعية. نحن نعرف القليل جدا حول كيفية يتم ذلك تجهيز وبالتالي قليلا حول كيفية هذا التحول يسمح للدماغ لتفسير المعلومات الحسية الواردة. باستثناء الشم، كل من الحواس لديه منظمة مشابهة جدا مع إشارات هامشية في البداية يتم ترحيل مع الدقة العالية التي ترفض كما يصعد إشارة إلى القشرة. القشرة ثم يرسل التوقعات إلى الهياكل السفلية لزيادة تعدل المعلومات الواردة. وقد تمت دراسة هذا النظام المعقد في مجموعة متنوعة من الطرق في الجسم الحي، وكذلك في عدد من التحضيرات في المختبر. في السابق، كافة الاتصالات سليمة، مما يمكن الباحث للتحقيق في أي مجموعة من الاتصالات، مع التحكم في المدخلات الحسية وقياسالناتج في أي منطقة معينة. مع هذا النهج، هناك قليل من دون السيطرة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من المدخلات الأخرى، بما في ذلك مدخلات أخرى الحسية، والإثارة، والاهتمام، مما أدى إلى إخراج معقدة بشكل مكثف. في المختبر، وقد تم قطع شرائح الدماغ لالتقاط أي مجموعة واحدة من الإسقاطات، أو منطقتين في المخ متصلة، والتي تسمح للباحثين لتحفيز وتقييم afferents أو مناطق الدماغ المختلفة. هذه غالبا ما تكون شرائح إما مهادية قشرية أو سقفي مهادي حيث يتم الاحتفاظ إما مساهمة في المهاد أو المهاد وانتاجها إلى القشرة ^2-5. هذه الاستعدادات تسمح لمجموعة واسعة من التلاعب الدوائية والكهربائية، وoptogenetic. ولكن مع مناطق الدماغ اثنين فقط، فإنها تقيم في المقام الأول على نقل المعلومات وتفتقر إلى القدرة على تقييم تحول المعلومات لأنها تمر عبر المهاد. أيضا إسقاط الشبكي مهادي، والتي قد تلعب دورا في الانتباه تعديل ^6-9 والعلاقات العامةESENT في هذه الشريحة. نحن هنا لشرح التحسينات عليها لدينا إعداد السابق ^1، التي تتيح التحكم محقق من المدخلات المختلفة إلى المهاد لإعطاء منظور فريد من كيف بوابات المهاد والمرشحات من المعلومات. نحن زوجين هذا التحضير شريحة الرواية مع التصوير بروتين فلافيني تألق ذاتي لتقييم الربط شريحة والتحليل بالتنشيط على نطاق واسع، والتصوير الكالسيوم في المهاد لتحليل السكان الخلايا العصبية، وتسجيل خلية واحدة لقياس تأثير المدخلات المختلفة على مستوى خلية واحدة.

للمساعدة في الحفاظ على هذه الاتصالات على نطاق واسع وضعنا عددا من التعديلات على شريحة مرساة العادي (ويعرف أيضا باسم "القيثارة") لعقد شريحة الدماغ في مكان وجسر لرفع شريحة لتعزيز نضح. تم تصميم القيثارة في شكل حدوة حصان تعديل لتطويق شريحة والسماح لنقاط التعلق قابلة للسلاسل القيثارة. ثلاث سلاسل هيالمرفقة بحيث ط) واحدة تقع أفقيا على طول الحافة وسطي من شريحة والثاني) واحد يمتد من الحافة الذيلية من IC إلى الحافة الذيلية للAC والثالث) واحد يمتد قطريا من الحافة وسطي من شريحة إلى منطقة منقاري إلى AC (انظر الشكل 1A). الفجوات الصغيرة في إطار لعلامة (مع الغراء cyanoacrylate) من القيثارة سلاسل تسمح لكمية انخفض الضغط على شريحة للمساعدة في الحفاظ على سلامة شريحة (انظر الشكل 1B). باستخدام ثلاث الطباعة ثلاثية الأبعاد، ونحن قادرون على العيدان تصميم مخصص لدينا مواصفات فريدة من نوعها، فضلا عن الجسور التي تسمح لتدفق مثالي من السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) فوق وتحت الأنسجة. هذا يحافظ أيضا مساحات واسعة للضوء لاختراق الأنسجة لالمشبك التصحيح الكهربية.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة إلينوي. وتم إيواء جميع الحيوانات في مرافق الرعاية الحيوانية التي وافقت عليها الجمعية الأمريكية لاعتماد المختبرات رعاية الحيوان. تم بذل كل محاولة لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة وتقليل المعاناة في جميع مراحل الدراسة.

1. إعداد لوإزالة الدماغ من الماوس لالتقطيع

1. الاستعداد لنضح وشريحة الحضانة.
   1. حوالي 30 دقيقة قبل التقطيع، وإعداد عالية الحل قطع السكروز وانخفاض ACSF الكالسيوم للحضانة من شريحة مسبقة لتسجيل أو تصوير.
   2. وضع جميع الأدوات اللازمة (مقص كبيرة حادة النهاية، مقص الربيع الصغيرة، وملقط التشريحية، مقص كبير أو المقصلة، قزحية مقص، ملقط المجوهرات، 10 مل المحاقن مع 27G س 1/2 بوصة الإبرة، وقطعة صغيرة من 1 سم × 2 سم مرشح ورقة، وكسر الرؤوس ماصة باستور لSLنقل الثلج) لنضح والتقطيع، وإعداد صينية الارواء.
   3. انشاء احتضان الغرفة مع الاوكسيجين ACSF في 32 ^س C حمام الماء وطبق الثقافة مليئة قطع حل.
2. إعداد قطع مرحلة تشريح ل.
   1. قطع قطعة صغيرة من 3٪ أجار حوالي 1 سم ³ لاستخدام باعتبارهم حاجزا وقائيا للدماغ و 1.5 سم × 1.5 مم × 3 مم للعثرة لاستخدامها لدعم وIC.
   2. الغراء مساندة على خشبة المسرح مع لاصقة cyanoacrylate فضلا عن نتوء على الجانب الأيمن من مساندة بحيث أنها تشكل زاوية ⁸⁰ درجة.
3. إزالة الدماغ.
   1. عميق تخدير-P20 P12 (p14-18 المثالية) الفأر مع الكيتامين 100 ملغ / كغ وxylaxine 3 ملغ / كغ (أو لجنة الأخلاق قابلة للمقارنة الإجراء المعتمد).
      ملاحظة: تأكيد مستوى التخدير السليم عن طريق عدم الاستجابة لقرصة أخمص قدميه. كما الحيوان تحت التخدير لفترة وجيزة، مرهم للعين غير ضروري.
   2. باستخدام كليلةإنهاء مقص، وفضح القفص الصدري من عملية الخنجري في الرقبة.
      1. العثور على عملية الخنجري، وجعل قطع الأفقي من حوالي 1.5 سم.
      2. جعل اثنين من التخفيضات العمودية من نهايات القطع الأفقي السابق إلى الكتفين، حوالي 1.5 سم لكل منهما.
   3. قطع من خلال الحجاب الحاجز وتقاطعات ضلعي غضروفي لفضح القلب.
   4. مع مقص الربيع صغيرة، وجعل الصغيرة، 2-5 قطع في الأذين الأيمن ملم، من بطني لالظهرية الجانبية للقلب.
   5. باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 27G س 1/2 بوصة، وضخ البطين الأيسر وبسرعة يروي الحيوان مع ارتفاع الحل قطع السكروز.
   6. مرة واحدة يتم تشغيل الدم واضح، استخدم مقص أكبر لإزالة الرأس.
      ملاحظة: ليس لدينا تقييم منهجي فائدة الارواء. ومع ذلك، في تجربتنا، ونضح transcardiac في الفئران هذا الشباب يمكن القيام به مع نجاح ما يقرب من 100٪، ولا يستفيدون من القضاء BL الأحمرخلايا العود، والتي يمكن أن يتألق وتتداخل مع التصوير.
   7. قطع الجلد أسفل خط الوسط لفضح الجمجمة.
   8. عن طريق قزحية عازمة مقص، وقطع الجمجمة بين العينين، ثم بدءا من قطع بين العينين، وقطع بعناية من الأمامي إلى الخلفي على طول خط الوسط خياطة مع الحرص على عدم تلف الدماغ تحتها.
      ملاحظة: الجافية عادة ما تأتي قبالة مع الجمجمة. إذا لزم الأمر، وإزالة الجافية قبل إزالة بعناية الدماغ.
   9. باستخدام ملقط المجوهرات، حدق فتح الجمجمة وإزالة بعناية الدماغ، ثم وضع الدماغ في خفض الحل. الحرص على تجنب إتلاف القشور.

2. إعداد الدماغ لالتقطيع

1. إعداد الدماغ للتركيب على vibratome المرحلة.
   1. باستخدام شريحة ملحوظ مع خطين في 90 ^س وخط قطري في 17 ^س من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين، المتقاطعة حيث يلتقي الخطان، ضع الجانب الظهري الدماغ يصل، وذلك باستخدامشفرة حلاقة، وإزالة 2-4 ملم من نهاية الدماغ منقاري خلق سطح مستو.
   2. وضع الجانب الذيلية الدماغ حتى على سطح مستو التي أنشئت حديثا، ومحاذاة السطح الظهري من المخ مع الأفقي وخط الوسط من الدماغ مع الخط العمودي.
   3. محاذاة شفرة حلاقة مع خط 17 ^س، إمالة الحلاقة في 30 ^س زاوية وإزالة حوالي 3 ملم من القشرة الحق في قطع قطري مزدوج (17 ^س من المستوى الأفقي و 60 ^س من الاكليلية).
2. تركيب الدماغ على vibratome المرحلة.
   1. ضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح 1 سم × 2 سم على الجانب البطني من الدماغ بحيث البعد الطويل هو عمودي على خط الوسط.
   2. تطبيق بعناية على كمية صغيرة من لاصقة cyanoacrylate إلى المنطقة أمام مساندة (وإلى اليسار من عثرة).
   3. وضع مزدوج الوجه الدماغ قطع قطريا على لالغراء بحيث الجزء الذيلية من الدماغ والدماغ المؤخر والعلاقات العامةأوب (OPPED) على عثرة والجانب الأيمن من الدماغ هو ضد وقائيا.
   4. اضغط بدقة أسفل على الدماغ، وضمان كامل السطح على اتصال مع غرفة التشريح.

3. الحصول على Colliculo-مهادية قشرية شريحة

1. بسرعة اتخاذ مرحلة القطع ومكان في vibratome، وملء خشبة المسرح مع قطع حل.
2. محاذاة شفرة مع الجزء العلوي (الجانب البطني) من الدماغ.
3. إزالة 1-1.5 ملم من الجزء العلوي من الدماغ، وإزالة 300-500 ميكرون شرائح وتقييم عمق بعد الإزالة.
   ملاحظة: عندما يكون IC، وMGB، والنواة الركبية الجانبية (LGN) كلها مرئية، والتلفيف المسنن يشكل شكل 'C' تأخذ 1-2 600 ميكرون شرائح. انظر الشكل 3A.
4. شرائح مكان في غرفة ساخنة (32 ^{درجة مئوية)} عقد.

4. التصوير من شريحة

1. التحضير لتصوير بروتين فلافيني تألق ذاتي.
   <لى> إعداد ACSF للنضح من شريحة في غرفة تسجيل الكهربية القياسية، فقاعة ACSF مع 95٪ O _2/5٪ CO _2.
   1. سحب الزجاج الكهربائي لتحفيز. لاحظ أنه متعددة الأقطاب محفزة مختلفة وتكوينات (زجاج، التنغستن، ألياف الكربون، أحادي القطب، ثنائي القطب) كل عمل جيد جدا بالتزامن مع التصوير بروتين فلافيني تألق ذاتي.
   2. بدوره على جهاز الكمبيوتر، وكاميرا، micromanipulator، مصدر للضوء، برنامج التحفيز، والتقاط الصور البرمجيات.
   3. يروي غرفة تسجيل مع الاوكسيجين ACSF، ضع جسر مخصص (تصميم المتاحة في المواد التكميلية) لرفع شريحة في الغرفة.
      ملاحظة: معدل الإرواء يمكن أن تختلف مع أي فرد اقامة؛ 5-15 مل / دقيقة ويستخدم هنا.
   4. وضع شريحة في الغرفة، وانخفاض مستوى السائل في غرفة لمنع شريحة من رفع قبالة الجسر في حين وضع القيثارة التي شيدت خصيصا على شريحة، مع الحرص على تجنب وضع سلاسل القيثارة على مسارات بينمؤسسة (الشكل 1A). زيادة مستوى السائل إلى ما يقرب من 1-2 مم فوق شريحة للحفاظ على تدفق ACSF فوق وتحت شريحة.
      ملاحظة: إذا تموضع ضروري، استخدم نهاية ماصة باستير كسر أو السماح مستوى ACSF أن ترتفع واستخدام ملقط مع الحذر الشديد.
   5. إدراج قطب كلوريد الفضة في القطب زجاجية مملوءة ACSF، إدراج الزجاج الكهربائي في micromanipulator والاتصال التحفيز المعزل، ووضع بعناية الزجاج الكهربائي في IC / المادة البيضاء مما يؤدي إلى المهاد (انظر الشكل 1A).
2. بروتين فلافيني الحصول على الصور تألق ذاتي.
   1. جمع الصور في 4 هرتز (باستخدام 2X الهدف الكلي تصحيح ما لا نهاية (NA 0.13)) وكاميرا لمدة 105 ثانية في حين تحفيز كهربائيا (يتكون كل التحفيز من 1 ثانية من 40 هرتز 2 ميللي ثانية البقول الأنسجة في 0.05 هرتز خمس مرات)، في حين إلقاء الضوء الأنسجة مع اللون الأزرق الفاتح 470-490 نانومتر، والتقاط فوق 515 نانومتر. تأكد من أن الصورة ليست لس الظلام، ولا تخرج انظر الشكل 3 يقم العمود لتكون مرجعا.
      ملاحظة: الوقت جمع وتيرة جمع، وتردد التحفيز يمكن تغييرها لتتناسب مع التجربة، وبرنامج مخصص تضمينها في المواد التكميلية يمكن تعديلها على هذا النحو.
   2. تصدير الصور إلى مطلب، واستخدام برنامج مكتوب مخصصة متاح في المواد التكميلية لتحليل القدرة الطيفية من الصور في 0.05 هرتز. فإن الصورة الناتجة تظهر مسارات متصلة.
      ملاحظة: يستخدم برنامج مخصص لتحويل فورييه السريع للقيم بكسل في السلسلة الزمنية لإنتاج الصورة.
3. التحضير لتصوير الكالسيوم.
   1. إعداد غرفة الحضانة صغيرة باستخدام صحن الثقافة 3 سم وغشاء ثقافة أثار السماح ACSF للوصول إلى كل من أعلى وأسفل شريحة، ومكان على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة حوالي 32 ^{درجة مئوية.}
   2. ملء غرفة الحضانة صغيرة مع ACSF الحار وفقاعة ببطء مع 95٪ O_05/02٪ CO _2.
   3. خلط 2 ميكرولتر من pluronic F-127 حامض و 50 ميكروغرام من FURA-02:00 المذاب في 48 ميكرولتر من DMSO.
   4. شريحة مكان في غرفة الحضانة صغيرة على الغشاء المطروحة وبعناية باستخدام micropipette إضافة خليط تلطيخ مباشرة فوق MGB (أو بنية أخرى من الفائدة).
   5. تغطية شرائح لمنع تبييض قبل التصوير، والسماح للشرائح لاحتضان لمدة 45 دقيقة - 1 ساعة.
   6. إزالة شرائح لغرفة ساخنة عقد لمدة 10-15 دقيقة ليغسل المواد الزائدة.
   7. اتبع الخطوات 4.1.1 إلى 4.1.6 للإعداد لتحفيز وصورة شريحة colliculo مهادي قشري.
4. الحصول على الصور الكالسيوم.
   1. جمع الصور في 10 هرتز (باستخدام الهدف الغمر 20X الماء) لمدة 25 ثانية في حين تحفيز كهربائيا (يتكون كل تحفيز نبضة واحدة 2 ميللي ثانية) الأنسجة عند 0.2 هرتز خمس مرات أثناء إلقاء الضوء على الأنسجة مع 365 ضوء نانومتر، والتقاط مضان فوق 510 نانومتر.
   2. تصدير الصور إلى مطلب واستخدام برنامج مكتوب مخصصة متاح في المواد التكميلية لتحليل القدرة الطيفية للصور عند 0.2 هرتز. فإن الصورة الناتجة تظهر خلايا نشطة.

النتائج

ويرد مثال على شريحة مخ الفأر-colliculo مهادي قشري التي تم الحصول عليها في P15 الماوس في الشكل 2. وسيتضمن شريحة المثالي أربعة مبان السمعية الدماغ المتوسط ​​والدماغ الأمامي الرئيسية IC، MGB، TRN، وAC، والتي يتم تنشيط جميع عندما يتم تحفيز IC (الشكل 2A). با?...

Discussion

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems