Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

Özet

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Özet

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Giriş

Duyusal çevresi ve alt colliculus arasında bilgi ehemmiyetli işlem olmasına rağmen, bu işitsel korteks ulaşmadan önce işitsel sistemde, önemli ölçüde ek bir işlem vardır. Biz işlem yapılması ve bu dönüşüm beyin gelen duyusal bilgileri yorumlamak için izin verir nasıl bu nedenle çok az nasıl hakkında çok az şey biliyoruz. Olfaction hariç, duyuların her biri başlangıçta sinyal korteks yükselir olarak düşmektedir yüksek sadakat ile yönlendirilen periferik sinyaller ile çok benzer bir organizasyona sahiptir. Korteks daha sonra gelen bilgiyi modüle alt yapılarına projeksiyonlar gönderir. Bu karmaşık sistem in vivo hem de in vitro olarak preparatlar bir dizi çeşitli yollarla çalışılmıştır. Eski, tüm bağlantıların duyusal girdileri kontrol ve ölçüm yaparken, bağlantıların herhangi bir set incelemek için araştırmacı sağlayan bozulmamışherhangi bir alanda çıktı. Bu yaklaşımla, yoğun karmaşık çıkış sebebiyet veren, diğer duyusal girdilerin, uyarılma ve dikkat gibi diğer girdilerin, çok çeşitli hiçbir kontrole çok az var. In vitro beyin dilimleri tek bir set ya yakalamak için kesilmiş Araştırmacılar uyarmak ve afferentler veya beyin bölgelerinin çeşitli değerlendirmek için izin projeksiyonlar, ya da iki bağlı beyin alanları,. Bunlar genellikle talamus giriş veya talamus ve korteks onun çıkış ya ^2-5 korunur talamokortikal veya tectothalamic ya dilimleri vardır. Bu preparatlar, farmakolojik, elektrik ve Optogenetic manipülasyon geniş bir çeşitliliği için izin verir. Bununla birlikte, sadece iki beyin bölgeleri, esas olarak bilgi aktarımı değerlendirmek ve talamus geçerken bilgi dönüşümünü değerlendirmek için kabiliyetinden yoksundur. Ayrıca dikkat modülasyonunda rol oynayabilir retikülo-talamik projeksiyon, ^6-9 prBu dilim ESENT. Burada nasıl talamus kapıları ve filtreler bilgi benzersiz bir perspektif vermek için talamus çeşitli girdilerin araştırmacı kontrolü sağlar önceki hazırlık ^1, üzerine iyileştirmeler göstermektedir. Biz çift tek hücre düzeyinde çeşitli girdilerin etkisini ölçmek için dilim bağlantısı ve büyük ölçekli aktivasyon analizi, nöronal nüfus analizi için talamus kalsiyum görüntüleme ve tek bir hücre kayıt değerlendirmek için flavoprotein otofloresans görüntüleme ile bu yeni dilim hazırlanması.

Bu yaygın bağlantıları sürdürmek yardımcı olmak için biz de gelişmiş perfüzyon için dilim yükseltmek için yerinde beyin dilim ve bir köprü tutmak için, normal dilim çapa (aka "harp") olarak değişiklikler bir dizi geliştirdik. Arp dilim çevreleyen ve arp dizeleri için özelleştirilebilir bağlantı noktaları için izin vermek için modifiye edilmiş at nalı şeklinde dizayn edilmiştir. Üç dizeleriEkli i) bir ii) bir AC kaudal kenarına IC kaudal kenarından uzanır ve iii) bir bir alana dilimin iç kenarına gelen diyagonal bir biçimde uzanır, dilim medial kenarı boyunca yatay olarak yer alacağı şekilde AC rostralinde (Şekil 1A bakınız). Dizeleri dilim bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için dilim bir basınç azalması miktarı izin arp (siyanoakrilat yapıştırıcı) ile yapıştırma çerçevede Küçük çentikler (Şekil 1B bakınız). Üç boyutlu baskı kullanarak, dokusu üstünde ve altında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ideal akışı için izin benzersiz özellikler, yanı sıra köprülere özel tasarım arp edebiliyoruz. Bu aynı zamanda yama kelepçe elektrofizyoloji için doku nüfuz ışık geniş alanları korur.

Protokol

Tüm işlemler Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Bütün hayvanlar Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği tarafından onaylanan hayvan bakım tesislerinde yerleştirildiler. Her girişimi kullanılan hayvanların sayısını en aza indirmek ve çalışmanın her aşamasında acıları azaltmak için yapıldı.

Ve Dilimleme için Mouse Beyin çıkarılması 1. Hazırlık

1. Perfüzyon ve dilim inkübasyon için hazırlayın.
   1. Yaklaşık 30 dakika dilimleme önce, kayıt veya görüntüleme öncesinde dilim kuluçka için yüksek sakaroz kesim çözümü ve düşük kalsiyum aCSF hazırlar.
   2. Gerekli tüm araçları (büyük kör uç makas, küçük yaylı makas, anatomik forseps, büyük makas ya da giyotin, iris makas, kuyumcular forseps, 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga, 1 cm x 2 cm filtresi küçük bir parça dışarı Lay Kağıt ve sl için bir kırık uçlu Pasteur pipetiperfüzyon ve dilimleme ve perfüzyon tepsisini hazırlamak için buz transferi).
   3. 32 ^{o C} su banyosunda ve çözüm kesim ile dolu bir kültür çanak oksijenli aCSF odasını kuluçka ayarlayın.
2. Dilimleme için sahne kesme hazırlayın.
   1. Yaklaşık 1 cm ³ yumru bir beyin için Geri döndürmez ve 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm olarak kullanmak için% 3 agar küçük bir parça kesin IC desteklemek için kullanılacak.
   2. Siyanoakrilat yapıştırıcı ile sahneye yanı sıra onlar 80 ^o açı oluşturacak şekilde döndürmez kilidin sağ tarafındaki yumru üzerine geri fren Tutkal.
3. Beyin çıkarın.
   1. Derinden bir p12-P20 ketamin 100 mg / kg ve xylaxine 3 mg / kg (veya benzer etik kurul onaylı prosedür) ile (ideal p14-18) fare uyutmak.
      Not: ayak tutam yanıt eksikliği yoluyla uygun anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvan anestezi kısaca altında olduğundan, göz merhem gereksizdir.
   2. Künt kullanmamakas sona boyun kılıç şeklinde süreci göğüs kafesi maruz.
      1. Kılıç şeklinde sürecini bulun ve yaklaşık 1,5 cm yatay kesim yapmak.
      2. Omuzlar önceki yatay kesilmiş uçlarından iki dikey keser, yaklaşık 1.5 cm Her olun.
   3. Diyafram ve kostokondral birleşme kesti kalbini ortaya çıkarmak.
   4. Küçük yaylı makas ile, kalp tarafını dorsal ventral gelen, sağ atrium kesilmiş küçük, 2-5 mm yapın.
   5. 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga kullanarak, sol ventrikül enjekte ve hızlı bir şekilde yüksek sakaroz kesim çözümü ile hayvan serpmek.
   6. Kan net çalışır kez baş kaldırmak için büyük makas kullanın.
      Not: Biz sistematik perfüzyon yararını değerlendirildi değil. Ancak, bizim deneyim, bu genç farelerde transkardiyak perfüzyon neredeyse% 100 başarı ile yapılabilir ve kırmızı bl ortadan kaldırarak fayda varfloresan ve görüntüleme ile müdahale OOD hücreleri.
   7. Kafatası açığa çıkarmak için orta hat cilt azaltın.
   8. Bükülmüş iris makas kullanarak, daha sonra gözleri arasındaki kesim, dikkatle altına beyin zarar vermemeye orta hat dikiş alma bakımı boyunca posterior anterior kesilmiş başlayarak, gözler arasındaki kafatası kesti.
      Not: Dura genellikle kafatası ile kapalı geliyor. Gerekirse, dikkatlice beyni çıkarmadan önce dura kaldırın.
   9. Kuyumcular forseps kullanarak, manivela kafatası açın ve dikkatlice beyin kaldırmak, sonra çözüm kesme beyin yerleştirin. Korteks zarar vermemek için özen gösterin.

2. Dilimleme için Beyin hazırlanması

1. Vibratome sahnede montaj için beyin hazırlamak.
   1. 90 ^o iki çizgi ile işaretlenmiş bir slayt ve alt soldan sağa doğru yukarıdan 17 ^o da diyagonal bir çizgi kullanarak, iki satır buluştuğu kullanarak, yukarı beyin dorsal yüzü koyun kesenBir jilet, düz bir yüzey oluşturarak rostral ucu beynin 2-4 mm kaldırın.
   2. Yeni oluşturulan düz bir yüzeye beyin kaudal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve yatay ve dikey çizgi ile beynin orta hat ile beyin dorsal yüzeyini hizalayın.
   3. 17 ^o hattı ile tıraş bıçağı hizalayın 30 ^o açıyla jilet yatırmak ve bir çift diyagonal kesim (koronal 17 yatay düzleme gelen ^o ve 60 ^o) sağ korteks yaklaşık 3 mm kaldırın.
2. Vibratome sahnede beyin Montaj.
   1. Uzun boyut orta hatta dik olacak şekilde filtre kağıdı beynin ventral tarafta 1 cm x 2 cm küçük bir parça yerleştirin.
   2. Dikkatlice geri dönme kilidi (ve yumru sol) önündeki alanda siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar uygulanır.
   3. Beyin ve Beyin kaudal parçası böylece pr tutkal çift çapraz kesilmiş beyin yüzünü yerleştirinyumru üzerine op ve beynin sağ tarafı Geri döndürmez aykırıdır.
   4. Ince tüm yüzey dilimleme odası ile temas halinde olmasını sağlamak, beyinde bastırın.

3. Colliculo-talamokortikal Dilim Edinme

1. Çabuk, vibratome kesme sahne ve gerçekleşecek çözümü kesme sahne doldurun.
2. Beynin üst (ventral tarafı) ile bıçağını aynı hizaya getirin.
3. Beynin üst 1-1,5 mm çıkarın 300-500 mikron dilim çıkarın ve kaldırıldıktan sonra derinliğini değerlendirmek.
   Not: IC, MGB ve lateral genikulat nükleus (LGN) tüm görünür ve dentat girus bir 'C' şeklinde iki 600 mikron dilim almak bir oluşturduğu zaman. Şekil 3A bakınız.
4. Holding (32 ^{° C)} ısıtılmış odasında Yeri dilimleri.

Dilim 4. Görüntüleme

1. Flavoprotein otofloresans görüntüleme için hazırlık.
   1. standart elektrofizyolojik kayıt odasındaki dilim perfüzyon için aCSF hazırlayın,% 95 _O 2 /% 5 _CO 2 ile kabarcık aCSF.
   2. Uyarılması için cam elektrot çekin. O çok farklı uyarıcı elektrotlar ve yapılandırmaları (cam, tungsten, karbon fiber, monopoler, bipolar) flavoprotein otofloresans görüntüleme ile tüm iş çok iyi de birlikte unutmayın.
   3. Bilgisayar, kamera, mikromanipülatör, ışık kaynağı, stimülasyon yazılımı, görüntü yakalama yazılımı açın.
   4. Odasında dilim yükseltmek için özel köprü (Yan Malzeme kullanılabilir tasarım) yerleştirin oksijenli aCSF ile kayıt odasına serpmek.
      Not: Perfüzyon oranı kurmak herhangi bir birey ile değişebilir; 5-15 ml / dakika burada kullanılmıştır.
   5. Inter yollar üzerinde arp dizeleri yerleştirerek önlemek için özen, dilim üzerinde özel olarak inşa harp yerleştirerek köprüden kaldırma gelen dilim önlemek için odasındaki sıvı seviyesini düşürmek, odasında dilim yerleştirinest (Şekil 1A). Dilim yukarıda ve aşağıda aCSF akışını korumak için dilim üzerinde yaklaşık 1-2 mm sıvı seviyesini artırın.
      Not: konumlandırma gerekiyorsa, kırık uç Pasteur pipet kullanın veya aCSF seviyesi yükselir ve çok dikkatli forseps kullanmanıza izin verir.
   6. (Şekil 1A bakınız), aCSF ile dolu cam elektrot içine gümüş klorür elektrot yerleştirin mikromanipülatör içine cam elektrot yerleştirin ve izolatör uyarıcı bağlanmak ve dikkatle talamus giden IC / beyaz cevher cam elektrot yerleştirin.
2. Otofloresans görüntü elde etme flavoprotein.
   1. (Sonsuzluk düzeltilmiş 2X makro objektif kullanılarak (NA 0.13)) 4 Hz görüntüleri ve 105 saniye boyunca bir kamera elektriksel uyarıcı olurken (her uyarım 0,05 Hz 40 Hz 2 msn bakliyat doku 1 sn beş kez oluşur) aydınlatırken toplayın mavi ışık 470-490 nm ve 515 nm üstünde yakalayan doku. Görüntü için ne olduğundan emin oluno karanlık, ne de dışarı üflenir bkz Şekil 3 başvuru için sütun bıraktı.
      Not: Toplama zamanı, toplama sıklığı ve stimülasyon frekansı deney gibi modifiye edilebilir ek materyalleri dahil özel bir program uyacak şekilde değiştirilebilir.
   2. Matlab ve ek materyalleri mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0,05 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü Bağlı yollar gösterecektir.
      Not: Özel bir program görüntü üretmek için bir hızlı Fourier zaman serisinde piksel değerlerinin dönüşümü kullanır.
3. Kalsiyum görüntüleme için hazırlık.
   1. ACSF yaklaşık ³² o C sıcaklığı korumak için bir ısıtma pedi üzerinde üst ve dilimin alt ve yeri hem de ulaşmasını sağlamak için bir 3 cm kültür çanak ve yükseltilmiş kültür membran kullanılarak küçük kuluçka odasına hazırlayın
   2. % 95 O sıcak aCSF ve yavaş yavaş balonu ile küçük kuluçka odasına doldurun₂ /% 5 CO _2.
   3. 2 pluronik F-127 asit ul DMSO içinde 48 ul içinde çözülmüş, Fura-2AM 50 ug karıştırın.
   4. Yükseltilmiş zarı ve dikkatli bir mikropipet kullanarak küçük kuluçka odasında Yeri dilim boyama doğrudan MGB yukarıdaki karışımı (veya diğer ilgi yapısını) ekleyin.
   5. 1 saat - önce görüntüleme beyazlatma önlemek ve dilimler 45 dakika süre ile inkübe izin dilimleri örtün.
   6. Fazla malzeme yıkayın 10-15 dakika ısıtılmış tutma odasına dilim çıkarın.
   7. Uyarmak için hazırlık ve görüntü colliculo-talamokortikal dilim için 4.1.6 adımlar 4.1.1 izleyin.
4. Kalsiyum görüntü elde etme.
   1. 365 nm ışık ile doku aydınlatıcı ve 510 nm üstünde floresan çekerken elektriksel 0.2 Hz'de (her uyarım biri 2 msn darbe oluşur) beş kez dokusunu uyarma sırasında 25 saniye boyunca (bir 20X suya daldırma hedefi kullanarak) 10 Hz'de görüntüleri toplayın.
   2. Matlab ve yardımcı malzeme mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0.2 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü, aktif hücrelerin gösterecektir.

Sonuçlar

P15 fare elde colliculo talamokortikal fare beyin dilim bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. İdeal bir dilim IC uyarıldığında etkinleştirilmiş tüm dört ana orta beyin ve ön beyin işitsel yapılar IC MGB, TRN ve AC içerecektir (Şekil 2A). Fourier analizi kullanarak, spektral güç periyodik ve stimülasyon frekansı ¹⁰ sürüklenen olan aktiviteyi gösteren bağlı beyin bölgeleri, elektrik stimülasyonu frekansında ölçülür. Bu protokol, özellikl...

Tartışmalar

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems