שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

Summary

באמצעות מספר זוויות לחתוך את מוח גור עכבר, אנחנו לשפר פרוסת מוח חריפה שתואר אשר לוכדת את הקשרים בין רוב מבני המוח התיכון והמוח הקדמי השמיעתיים המרכזיים.

Abstract

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Introduction

במערכת השמיעה, אם כי יש עיבוד משמעותי של מידע בין הפריפריה החושית וcolliculus הנחות, יש עיבוד נוסף רב לפני שהוא מגיע לקליפת המוח השמיעתי. אנחנו יודעים מעט מאוד על איך העיבוד שנעשה ולכן קצת על איך שינוי שמאפשר למוח לפרש מידע חושי. למעט חוש ריח, כל אחד מהחושים יש ארגון דומה מאוד עם אותות היקפיים בתחילה שהעבירו עם איכות גבוהה שיורדת כאות עולה לקליפת המוח. הקליפה לאחר מכן שולחת תחזיות למבנים נמוכים יותר לווסת את המידע הנכנס נוסף. מערכת מורכבת זו נחקרה במגוון הדרכים in vivo, כמו גם במספר ההכנות במבחנה. בעבר, כל החיבורים שלמים, המאפשרים לחוקר לחקור כל מערכת של קשרים, תוך שליטה על הקלט החושי ומדידהתפוקה בכל אזור נתון. עם גישה זו, יש לא מעט שליטה על המגוון הרחב של תשומות אחרות, כוללים תשומות אחרות חושיות, עוררות, ותשומת לב, והוליד פלט עוצמה מורכב. במבחנה, פרוסות המוח קוצצו כדי ללכוד או קבוצה אחת של תחזיות, או שני אזורים במוח מקושרים, שתאפשרנה לחוקרים כדי לעורר ולהעריך שונים afferents או אזורים במוח. אלה הם בדרך כלל פרוסות או thalamocortical או tectothalamic בי או הקלט לתלמוס או התלמוס והתפוקה שלה לקליפת המוח נשמרים ^2-5. הכנות אלו מאפשרות מגוון רחב של מניפולציות תרופתיות, חשמל, וoptogenetic. עם זאת רק עם שני אזורים במוח, הם בעיקר להעריך את העברת המידע וחוסר היכולת להעריך את הפיכתו של המידע כפי שהוא עובר דרך התלמוס. גם ההקרנה reticulo-התלמוס, שעשוי לשחק תפקיד באפנון תשומת לב היא ^6-9 יחסי ציבורesent בפרוסה זו. כאן אנו מדגימים שיפורים על ההכנה הקודמת שלנו ^1, המאפשרת שליטת חוקר תשומות שונות להתלמוס לתת נקודת מבט ייחודית של איך מידע שערי התלמוס ומסננים. אנחנו זוג הכנה זה רומן עם פרוסת ההדמיה autofluorescence flavoprotein להערכת קישוריות פרוסה וניתוח הפעלה בקנה מידה גדולה, הדמיה סידן בתלמוס לניתוח אוכלוסייה עצבית, והקלטת תא בודדת כדי למדוד את ההשפעה של התשומות השונות ברמה תא בודדת.

כדי לסייע בשמירה על קשרים ענפים אלה יש לנו גם פיתחו מספר השינויים של עוגן פרוסה הרגיל (aka "נבל") לקיום פרוסת המוח במקום וגשר לרומם את הפרוסה לזלוף משופר. הנבל מעוצב בצורת פרסה שונה כדי להקיף את הפרוסה ולאפשר לנקודות מצורפים להתאמה אישית למייתרי הנבל. שלושה מייתריםמצורף כזה ש) אחד טמון אופקי לאורך הקצה המדיאלי של הפרוסה, ii) אחד משתרע מקצה הזנב של IC לקצה הזנב של AC וiii) אחד משתרע באלכסון מהקצה המדיאלי של הפרוסה לאזור מקורי לAC (ראה איור 1 א). חריצים קטנים במסגרת הדבקה (עם דבק cyanoacrylate) של נבל מיתרים לאפשר לסכום ירידה של לחץ על הפרוסה כדי לעזור לשמור על שלמות פרוסה (ראו איור 1). על ידי שימוש בשלושה ממדי הדפסה, אנו מסוגלים נבלי עיצוב מותאמים אישית למפרטים שלנו הייחודיים, כמו גם גשרים המאפשרים זרימה אידיאלית של נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF) מעל ומתחת לרקמה. זה גם שומר על שטחים גדולים לאור לחדור לרקמות לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת אילינוי. כל בעלי החיים שוכנו במתקני טיפול בבעלי החיים אושרו על ידי האגודה האמריקנית להסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים. כל נעשה ניסיון לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים ולהפחית את סבל בכל שלבי המחקר.

1. הכנה ולהסרה של מוח מהעכבר לחיתוך

1. היכונו לזלוף ודגירה פרוסה.
   1. כ 30 דקות לפני חיתוך, להכין פתרון גבוה סוכרוז חיתוך וaCSF סידן הנמוך לדגירה של הפרוסה לפני הקלטה או הדמיה.
   2. הנח את כל הכלים הדרושים (מספריים גדולים בוטים סוף, מספריים אביב קטנים, מלקחיים אנטומיים, מספריים או הגיליוטינה גדולים, איריס מספריים, מלקחיים תכשיטנים, מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27G x 1/2 אינץ ', חתיכה קטנה של 1 סנטימטר מסנן x 2 סנטימטר נייר, ונשבר פיפטה פסטר הטתה לslקרח העברה) לזלוף וחיתוך, ולהכין מגש טפטוף.
   3. הגדרה דוגרות קאמרי עם aCSF מחומצן באמבט המים C 32 ^O ומנת תרבות מלא בחיתוך פתרון.
2. הכן חיתוך במה לחיתוך.
   1. חותכים חתיכה קטנה של אגר 3% כ 1 סנטימטר ³ להשתמש כבלימה למוח ושל 1.5 סנטימטרים X 1.5 מ"מ x 3 מ"מ לבליטה לשמש כדי לתמוך IC.
   2. מדביקים את הבלימה לבמה עם דבק cyanoacrylate כמו גם הבליטה בצד ימין של הבלימה כך שהם יוצרים זווית 80 ^o.
3. הסר את המוח.
   1. עמוק להרדים P12-P20 עכבר (באופן אידיאלי p14-18) עם קטמין 100 מ"ג / קילוגרם וxylaxine 3 מ"ג / קילוגרם (הליך או אישר ועדת אתיקה דומה).
      הערה: ודא רמת הרדמה נכונה באמצעות חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. כבעלי החיים נמצאים תחת הרדמה לזמן קצר, משחת עיניים הוא מיותר.
   2. שימוש בוטהבסופו של מספריים, לחשוף את בית החזה מתהליך xiphoid לצוואר.
      1. מצא את תהליך xiphoid, ולעשות חתך אופקי של כ -1.5 סנטימטר.
      2. שני חתכים אנכיים מקצות החתך האופקי הקודם לכתפיים, כ -1.5 סנטימטרים כל אחת.
   3. לחתוך דרך הסרעפת וצומת costochondral כדי לחשוף את הלב.
   4. עם מספריים באביב קטנים, לעשות מ"מ לחתוך בעלייה הימנית קטן, 2-5, מהגחון לצד הגבה של הלב.
   5. באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27G x 1/2 אינץ ', להזריק החדר השמאלי וינקב את החיה עם פתרון חיתוך סוכרוז גבוה במהירות.
   6. ברגע שהדם מפעיל ברור, להשתמש במספריים גדולים כדי להסיר את הראש.
      הערה: יש לנו לא באופן שיטתי להעריך את התועלת של זלוף. עם זאת, בניסיון שלנו, זלוף transcardiac בעכברים צעירים זה יכול להיעשות בהצלחה כמעט 100%, ויש לי היתרון של ביטול BL האדוםתאי OOD, אשר יכול לזרוח ולהפריע להדמיה.
   7. חותך את העור כלפי מטה את קו האמצע לחשוף את הגולגולת.
   8. בעזרת המספריים איריס הכפופה, לחתוך את הגולגולת בין העיניים, ואז החל מהחתך בין העיניים, לחתוך בזהירות מקדמית לאחוריים לאורך טיפול לקיחת תפר קו האמצע שלא לפגוע במוח מתחת.
      הערה: הדורה בדרך כלל מגיעה מעם הגולגולת. אם יש צורך, להסיר את הדורה לפני הסרת המוח בזהירות.
   9. בעזרת מלקחיים תכשיטנים, לפתוח את הגולגולת ובזהירות להסיר את המוח, ואז למקם את המוח בחיתוך פתרון. דואג כדי למנוע נזק לקליפת המוח.

2. הכנת המוח לחיתוך

1. הכנת מוח להרכבה על vibratome שלב.
   1. באמצעות שקופיות מסומנות בשני קווים ב -90 ^o וקו אלכסוני על 17 ^o מהחלק העליון משמאל לימין תחתון, מצטלב בו שתי השורות לעמוד, הנח את צד גב המוח עד, באמצעותסכין גילוח, להסיר 2-4 מ"מ של מוח הסוף מקורי יצירת משטח שטוח.
   2. הנח את צד הזנב המוח על המשטח השטוח החדש שנוצר, וליישר את פני השטח הגבי של המוח עם אופקי וקו האמצע של המוח עם הקו האנכי.
   3. יישר את סכין הגילוח עם קו 17 ^O, להטות את התער בזווית של 30 ^O ולהסיר כ 3 מ"מ של זכות הקליפה בחתך אלכסוני כפול (17 ^o ממישור אופקי ו -60 ^o מהעטרה).
2. הרכבה מוח על vibratome שלב.
   1. מניחים חתיכה קטנה של נייר סינון 1 ס"מ על 2 סנטימטר בצד הגחוני של המוח, כך שממד הזמן הוא בניצב לקו האמצע.
   2. זהירות להחיל כמות קטנה של דבק cyanoacrylate לאזור מול הבלימה (ומהשמאל לבליטה).
   3. הנח את המוח לחתוך באלכסון הכפול על לדבק כך שחלק הזנב של המוח והמוח האחורי הם יחסי ציבורopped על הבליטה והצד הימני של המוח הוא נגד הבלימה.
   4. לחץ כלפי מטה בעדינות על המוח, על מנת להבטיח שכל השטח הוא במגע עם תא החיתוך.

3. קבלת Colliculo-thalamocortical Slice

1. במהירות לקחת את שלב החיתוך והמקום בvibratome, למלא את הבמה עם חיתוך פתרון.
2. יישר את הלהב עם הראש (צד הגחון) של המוח.
3. הסר 1-1.5 מ"מ מהחלק העליון של המוח, להסיר 300-500 מיקרומטר פרוסות ולהעריך עומק לאחר ההסרה.
   הערה: כאשר IC, מג"ב, וגרעין רוחב ברך (LGN) כל ​​גלוי, והרכס המשונן יוצר צורה "C" לקחת 1-2 600 מיקרומטר פרוסות. ראה איור 3 א.
4. פרוסות מקום בתא מחומם (32 ^מעלות צלסיוס) מחזיק.

4. הדמיה של הפרוסה

1. הכנה להדמיה autofluorescence flavoprotein.
   1. הכן aCSF לטפטוף של הפרוסה בתא הקלטת אלקטרו סטנדרטי, aCSF בועה עם 95% O CO _{2/5% 2.}
   2. משוך אלקטרודת זכוכית לגירוי. שים לב שאלקטרודות מרובות שונות המגרה ותצורות (זכוכית, טונגסטן, סיבי פחמן, monopolar, דו-קוטבית) כל העבודה טובה מאוד בשילוב עם ההדמיה autofluorescence flavoprotein.
   3. הפעל את המחשב, מצלמה, micromanipulator, מקור אור, תוכנת גירוי, תוכנה ללכידת תמונה.
   4. Perfuse חדר ההקלטה עם aCSF מחומצן, למקם גשר מותאם אישית (עיצוב זמין בחומרים נוספים) כדי להעלות את הפרוסה בתא.
      הערה: שיעור זלוף יכול להשתנות עם כל אדם להגדיר; 5-15 מיליליטר / דקה משמשת כאן.
   5. מניחים פרוסה בתא, להפחית את רמת הנוזל בתא כדי למנוע את הפרוסה מההרמה מהגשר תוך שימת נבל שנבנה במיוחד על פרוסה, לטפל כדי למנוע הצבת מיתרי נבל על מסלולים של היתרest (איור 1 א). הגדל את רמת נוזל לכ 1-2 מ"מ מעל הפרוסה כדי לשמור על זרימת aCSF מעל ומתחת פרוסה.
      הערה: אם יש צורך המיצוב מחדש, להשתמש בפיפטה פסטר הסוף נשברה או לאפשר רמת aCSF לעלות ולהשתמש במלקחיים בזהירות רבה.
   6. הכנס אלקטרודה כלוריד כסף לאלקטרודת זכוכית מלאה בaCSF, הכנס את אלקטרודת הזכוכית לתוך micromanipulator ולהתחבר לגירוי מבודד, ולמקם את אלקטרודת זכוכית בIC / חומר לבן המוביל לתלמוס בזהירות (ראה איור 1 א).
2. Flavoprotein רכישת תמונת autofluorescence.
   1. לאסוף תמונות ב 4 הרץ (באמצעות אובייקטיבי מאקרו-תיקן אינסוף 2X (NA 0.13)) ומצלמה ל105 שניות בזמן גירוי חשמלי (כל גירוי מורכב משניות 1 של רקמת פולסים 2 אלפיות שנייה 40 הרץ ב0.05 הרץ חמש פעמים) ואילו מאיר הרקמה עם ננומטר תכלת 470-490 ולכידה מעל 515 ננומטר. ודא שהתמונה היא לא לאיור ראה o כהה, ולא פוצץ את 3 עזב טור להתייחסות.
      הערה: זמן אוסף, תדירות אוסף, ותדירות גירוי ניתן לשנות כדי שיתאימו לניסוי, התכנית המותאמת אישית כלולה בחומרים משלימים יכול להיות שונה כאמור.
   2. יצוא תמונות לMatlab, ובאמצעות התכנית שנכתבה בהתאמה אישית בחומרים משלימים לנתח כוח רפאים של התמונות ב0.05 הרץ. התמונה המתקבלת תציג מסלולים מחוברים.
      הערה: התכנית המותאמת אישית משתמשת פורייה מהיר לשנות את ערכי פיקסל בסדרת הזמן כדי לייצר את התמונה.
3. הכנה להדמיה סידן.
   1. הכן תא דגירה קטן באמצעות צלחת תרבות 3 סנטימטר וקרום התרבות העלה לאפשר aCSF להגיע גם חלק עליון ותחתון של הפרוסה, ומקום על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה בכ 32 ^{מעלות צלסיוס}
   2. מלא תא דגירה קטן עם aCSF החם ולאט בועה עם 95% O_2/5% CO _2.
   3. לערבב 2 μl של חומצת F-127 pluronic ו -50 מיקרוגרם של הפורע-2:00 מומסים בμl 48 של DMSO.
   4. פרוסת מקום בתא דגירה קטנה בקרום גדל ובאמצעות micropipette בזהירות להוסיף תערובת צביעה ישירות מעל מג"ב (או מבנה אחר של עניין).
   5. לכסות פרוסות כדי למנוע הלבנה לפני ההדמיה, ולאפשר פרוסות כדי לדגור על 45 דק '- שעה 1.
   6. הסר פרוסות לתא החזקה מחוממת למשך 10-15 דקות כדי לשטוף את החומר עודף.
   7. עקוב 4.1.1 צעדים ל4.1.6 להכנה כדי לעורר ותמונה הפרוסה colliculo-thalamocortical.
4. רכישת תמונת סידן.
   1. לאסוף תמונות ב 10 הרץ (באמצעות אובייקטיבי 20x טבילה במים) במשך 25 שניות בזמן הגירוי חשמלי (כל גירוי מורכב מדופק 2 אלפיות שני אחת) רקמה על 0.2 הרץ חמש פעמים תוך מאיר את הרקמה עם 365 ננומטר אור ולכידת הקרינה מעל 510 ננומטר.
   2. יצוא תמונות לMatlab ושימוש בתכנית אישית בכתב זמינה בחומרים משלימים לנתח כוח רפאים של התמונות על 0.2 הרץ. התמונה המתקבלת תציג תאים פעילים.

תוצאות

דוגמא של פרוסת מוח עכבר colliculo-thalamocortical שהתקבלה בעכבר P15 מוצגת באיור 2. פרוסה האידיאלית תכיל ארבעה מבנים גדולים והמוח תיכונים המוח הקדמי שמיעתיים IC, מג"ב, טורנירים, וAC, כל שמופעלים כאשר IC מגורה (איור 2 א). באמצעות ניתוח פורייה, כוח הרפאים נמדד בתדירות ה...

Discussion

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35 x10 mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems