جيل من سرطان البروستاتا المريض المشتقة نماذج طعم أجنبي من تعميم الخلايا السرطانية

Summary

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Abstract

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Introduction

المريض xenografts المشتقة هي نماذج تجريبية شعبية متزايدة المستخدمة لأبحاث السرطان. أنها يمكن أن تستخدم لتوصيف المؤشرات الحيوية والمسارات البيولوجية، وتقييم ما قبل السريرية من فعالية الدواء، وخلق الآلهة لعلاجات السرطان شخصية ^1،2. سابقا، وقد وضعت مجموعات بحثية أخرى نماذج PDX إما عن طريق زرع أو حقن واحدة تعليق خلية الورم أو إإكسبلنتس الورم كله في المناعة الفئران ^1. هذه PDX نماذج تتطلب جمع الجراحي للورم صلب جديد، استسقاء الخبيثة أو الانصباب الجنبي من مريض يخضع لعملية جراحية والتي هي على حد سواء مكلفة ويعرض المريض لخطر متزايد من الإصابة بالأمراض علاجي المنشأ.

ومن التطورات الهامة التي حدثت مؤخرا في أبحاث السرطان والكشف والعزلة وتوصيف تعميم الخلايا السرطانية. هذه الخلايا السرطانية الهروب من كتلة الورم الابتدائية وتدخل الدورة الدمويةحيث أنها تلعب دورا حاسما في الانبثاث والانتكاس، والسبب الأكثر شيوعا من سرطان الوفيات ³ ذات الصلة. وقد وفرت تقييم وتوصيف CTCs من عدة أنواع الأورام الصلبة المعلومات السريرية لتشخيص، تشخيص ومراقبة المرض المتبقي ^3. مجموعة متنوعة من الأساليب المستخدمة حاليا الاعتماد على أي من الخصائص الفيزيائية والتعبير عن المؤشرات الحيوية، أو الخصائص الوظيفية CTCs يمكن استخدامها لعزل بكفاءة CTCs ^4. وتشمل macroscale أساليب العزل CTC القائمة الكثافة الطرد المركزي التدرج، والترشيح البدني مع المسام مرشح والانفصال ضد جزيئات السطح. وتستند الأكثر استخداما على نطاق واسع منهجيات العزلة CTC على القبض على الأضداد من CTCs. كلا اختيار الإيجابية والسلبية للعلامات سطح الخلية يمكن أن تستخدم لعزل CTCs من الدم المحيطي. اختيار إيجابية للCTCs في الدورة الدموية الطرفية يستخدم عادة علامات الظهارية (على سبيل المثال، EpCAM) التي لإعادة أعرب عن CTCs لكن الخلايا المكونة للدم لا. وعيب هذه الطريقة هو أن CTCs مع إمكانية المنتشر كثيرا ما خضع الظهارية-إلى-الوسيطة الانتقالية (EMT)، التي downregulates علامات سطح الظهارية ^3. من أجل عزل CTCs مع إمكانية النقيلي، منهجية اختيار السلبية التي توظف علامة السطحية المكونة للدم، CD45، إلى أن تستنفد السكان الخلية العادية من الكريات البيض يمكن استخدام ^5.

سرطان البروستات هو السرطان الاكثر تشخيصا وسببا رئيسيا من أسباب الوفيات المرتبطة بالسرطان بين الرجال ^6. آليات تطور الورم والعدوانية ليست مفهومة تماما، وبالتالي توليد وتوصيف النماذج التجريبية التي ألخص عدم التجانس الجزيئي للسرطان البروستات ذات أهمية كبيرة. وكانت نماذج PDX من سرطان البروستاتا ولدت من قبل engraftment من خلايا سرطان البروستاتا البشرية إلى immunocomالفئران وعد ^7،8. ومع ذلك الجيل من هذه النماذج أعاقتها معدل engraftment منخفض للسرطان البروستاتا في الفئران المناعة، وهو ما يرجع في المقام الأول إلى طبيعة كسلان من المرض. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت CTCs لتوليد سرطان الثدي ⁹ وسرطان الرئة وسرطان البروستاتا ^{10 11} نماذج PDX. أدخلت هذه إثبات صحة مفهوم الدراسات إمكانية توليد PDX نماذج مستقلة عن الحاجة لجمع العينات الجراحية. في هذه المقالة وصفنا بالتفصيل طريقة لتوليد هذا النموذج التجريبي الرواية.

Protocol

وقد أجرى هذا البروتوكول في مؤسستنا مع موافقة من مجلس أخلاقيات البحث المؤسسي ومتوافق مع جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية، والدولية من أجل رفاهية الإنسان.

1. جمع الدم المحيطي من المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا المتقدم

ملاحظة: يتم اختيار المرضى الذين يعانون من سرطان البروستاتا النقيلي. الحصول على موافقة المريض الخطية وتسجيل الخصائص السريرية للمرضى، بما في ذلك السن في العزل والعلاج الكيميائي السابق والعلاجات الهرمونية. والمرضى الذين يعانون من المرض المنتشر يحتمل أن يكون أعلى تركيز من CTCs في الدم المحيطي.

1. جمع عينات الدم بعد الموافقة المسبقة وتحت وافق على مجلس المراجعة المؤسسية المناسبة البروتوكول. ارتداء القفازات المطاطية ومعطف مختبر في جميع أنحاء الداخلي.
2. ربط 25 G فراشة إبرة والأنابيب لحامل الإبرة. استخدام مسحة الكحول لتنظيف المنطقة منالوريد أمام المرفق بين العضله ذات الرأسين والساعد، ثم تطبيق وقف النزف لذراع المريض العلوي.
3. إدراج فراشة إبرة في الوريد أمام المرفق، ودفع أنبوب جمع الدم إلى حامل إبرة لبدء تجميع. جمع حوالي 10 مل من الدم في أنابيب جمع التي تحتوي على ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) لمنع تخثر الدم.
4. إزالة فراشة إبرة من مريض والضغط مع معقمة الشاش على موقع الوريد ثقب لمدة 1 دقيقة. موقع غطاء مع ضمادة معقمة.

2. عزل الخلايا وحيدة النواة

ملاحظة: إن الدم التي تم جمعها من الخطوة 1 تحتوي على خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) (على سبيل المثال، الخلايا اللمفية وحيدات) بالإضافة إلى CTCs وحيدات النوى.

1. ماصة الدم كله إلى 50 مل البوليسترين أنبوب مخروطي مع 5 مل ماصة المصلية وإضافة هانكس محلول الملح المتوازن (HBSS) في نسبة 1: 1. بلطف خليط ماصة للالتجانس.
2. إضافة 15 مل من محلول استعداد تجاريا (Ficoll-Paque) لفصل مكونات الدم عن طريق سرعة منخفضة الكثافة التدرج الطرد المركزي إلى فارغة 50 مل البوليسترين أنبوب مخروطي.
3. ماصة بلطف الدم الكامل وHBSS الخليط، من الخطوة 2.1، في أنبوب البوليسترين من الخطوة 2.2، لتشكيل الطبقة العليا متميزة. ماصة تعيين إلى أدنى الإعداد لتقليل الاختلاط من الحلول، وهذا سيضمن الفصل كفاءة.
4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في RT (25 ° C). تعيين التباطؤ إلى أدنى الإعداد لمنع اختلاط حلول بعد الانفصال. قد يتم تعيين تسارع إلى أي سرعة.
5. بعد الطرد المركزي، وتحديد شريط أبيض رمادي رقيقة من طبقة PBMCs وCTCs تقع بين البلازما على رأس والانفصال حل في الجزء السفلي من الأنبوب.
6. جمع الخلايا من الشريط الأبيض الرمادي في الخطوة 2.5 إلى 50 مل البوليسترين أنبوب نقل باستخدام ماصة بلاستيكية.
7. إضافة HBSS إلى 50 مل البوليسترين أنبوب مخروطي مع PBMCs وCTCs وجentrifuge مرة أخرى في 400 x ج لمدة 10 دقيقة RT لغسل.
8. صب السائل وبيليه resuspend في 50 مل من HBSS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 400 x ج لمدة 3 دقائق على RT لغسل.
9. تجاهل طاف، resuspend الكرية المتبقية مع 5 مل من خلايا الدم الحمراء تحلل العازلة واحتضان الحل لمدة 5 دقائق على RT.
10. إزالة خلايا الدم الحمراء تحلل عازلة بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
11. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 1 مل PBS 1X تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) لمنع قبل تلوين الأجسام المضادة.

3. خلايا وحيدة النواة تلطيخ مع CD45-FITC الأجسام المضادة لالإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

1. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة (التريبان الزرقاء سلبية) (من الخطوة 2.11) باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي. إعداد 1 × 10 ⁶ خلية / مل تعليق (في برنامج تلفزيوني 1X مع 10٪ FBS) ووضعه على الجليد لمدة 1 ساعة.
2. توزيع كمياتعليق الخلية من الخطوة السابقة إلى أنبوبين. أنابيب التسمية، والتحكم وCD45 تلطيخ.
3. في أنبوب السيطرة، إضافة IgG1κ-FITC (2.5 ميكروغرام / مل) في التخفيف من 1: 250. في CD45 أنبوب تلوين، إضافة CD45 FITC (2.5 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة الأولية مترافق في التخفيف من 1: 250 واحتضان الايقاف الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة. يستخدم CD45 وضع العلامات مستضد لاستبعاد الخلايا المكونة للدم.
4. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
5. غسل الخلايا مرتين، من خلال تعليق كل بيليه مع معقم 1 × PBS تستكمل مع 10٪ FBS تليها الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
6. resuspend الخلايا في محلول 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) بتركيز 10 ميكروغرام / مل.
7. تصفية الحل النهائي خلال 35 ميكرون قبعات مصفاة إلى 12 مم أنابيب البوليسترين × 75 مم.

4. عزل البروستاتا CTCs من قبلFACS

ملاحظة: الاستفادة من تدفق عداد الكريات لجمع الحية CD45 CTCs السلبية.

1. وضع ضوابط التعويض باستخدام خلايا من الأنبوب المسمى، "تحكم".
2. إنشاء البوابات التي تستبعد الحطام ومجموعات من الخلايا باستخدام الأمام مبعثر والجانب مبعثر المعلمات المناسبة.
3. إنشاء بوابات FITC باستخدام تعليق خلية من الأنبوب المسمى "CD45-FITC".
4. بوابة قابلة للحياة الخلايا (دابي سلبي) باستخدام باسيفيك بلو-A القناة.
5. جمع CD45 السكان السلبية في العقيمة 15 مل البوليسترين المخروطية أنبوب يحتوي على 2 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 تستكمل مع 10٪ FBS.
6. الطرد المركزي البروستاتا تعليق خلية الورم مرتبة في 400 x ج لمدة 3 دقائق، ثم resuspend وبيليه في 200-500 ميكرولتر من RPMI تستكمل مع 10٪ FBS.

5. حقن CTCs في الفئران ورصد النمو طعم أجنبي

ملاحظة:إجراء كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية. وقد أجريت هذا البروتوكول في مؤسستنا تحت معين بروتوكول استخدام الحيوان التي وافقت عليها لجنتنا رعاية الحيوان وفقا والامتثال لجميع وكالات واللوائح والمبادئ التوجيهية والتنظيمية والمؤسسية ذات الصلة.

1. مزيج البروستاتا تعليق خلية الورم فرزها مع المصفوفة خارج الخلية في نسبة 1: 1 ومكان على الجليد.
2. تخدير الماوس قبل الزرع تحت الجلد في غرفة توريد 5٪ (ت / ت) استنشاقه الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. ضمان التخدير المناسب عن طريق التحقق من فقدان منعكس القرنية وأخمص القدمين في الماوس.
3. باستخدام إبرة G 25 وحقنة 1 مل، وضخ 250 ميكرولتر من الخلايا السرطانية في البروستاتا والمصفوفة خارج الخلية تعليق خلية تحت الجلد في كلا الجناحين العليا من العوز المناعي الذكور 8-10 اسبوع الماوس. ضخ 250 ميكرولتر بغض النظر عن تركيز لجنة مكافحة الإرهاب حيث بلغ حجم الحقن هو أناقيمة mportant. إدارة SQ القصوى في الماوس لا يزيد عن 1 ملم.  
4. مراقبة الفئران عن طريق إجراء الجس الأسبوعي للمواقع الحقن الماوس لنمو الكثافة عقيدية تحت الجلد وذلك عن طريق قياس وزن الفئران مرتين في الأسبوع.
5. الموت ببطء الفئران عن طريق غاز ثاني أكسيد الكربون الاختناق تليها خلع عنق الرحم والحصاد تحت الجلد البروستاتا البشرية xenografts السرطان عند حجم الورم أكثر من 0.5 سم وأقل من 1 سم في أكبر قطر لضمان ما يكفي من نسيج الورم عن التحليلات الجزيئية ومرور التسلسلي. الموت ببطء الفئران مع وجود علامات الضيق أو فقدان الوزن بنسبة 15٪ على الرغم من عدم الورم هو واضح.

النتائج

وهذا البروتوكول يؤدي إلى توليد نماذج PDX من معزولة CD45 البروستاتا السلبية CTCs السرطان. استنادا إلى أسلوب الاختيار السلبي المستخدمة في بروتوكول لدينا من الضروري استبعاد الخلايا الميتة باستخدام دابي وصمة عار. النسبة المئوية للخلايا السلبية CD45 الكشف عنها بواسطة التدفق ا?...

Discussion

تصف هذه المخطوطة طريقة لتوليد سرطان البروستاتا نماذج PDX من CTCs. استخدام CTCs لتوليد PDX نماذج لديها العديد من المزايا الهامة المحتملة بالمقارنة مع الطرق القائمة. أولا، جمع الوصول إليها من CTCs من الدم المحيطي يتيح توليد نماذج تجريبية من نفس المريض في مراحل المرض ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe