前列腺癌患者产生派生异种移植模型从循环肿瘤细胞

摘要

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

摘要

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

引言

来自患者的异种移植物是用于癌症研究日益流行的实验模型。它们可用于生物标志物和生物学途径，药物疗效的临床前评估，并创建化身个性化癌症疗法^1,2的表征。此前，其他研究小组已经开发出PDX机型无论是通过植入或注射单个肿瘤细胞悬液或全肿瘤植到免疫小鼠^1。这些PDX 模型需要外科收集新鲜实体瘤，恶性腹水或从患者经历外科手术这既昂贵又暴露病人医源性发病的危险性增加胸腔积液。

在癌症研究显著最近的发展一直循环肿瘤细胞检测，分离和鉴定。从原发肿瘤肿块这些肿瘤细胞逃逸，并进入循环在那里他们在转移和复发发挥关键作用，癌症的最常见的原因有关的死亡率^3。的CTC从几个实体瘤类型的评估和表征提供了临床信息进行诊断，预后，监测和残留病^3。多种目前使用的方法依赖于任一物理性质，生物标志物的表达，或的CTC的功能特性可以用来有效地分离的CTC ^4。现有宏观尺度四氯化碳的分离方法包括密度梯度离心，带过滤器的孔的物理过滤和分离针对表面分子。最广​​泛使用的CTC隔离方法是基于的CTC的基于抗体的捕获。两个阳性和阴性选择的细胞表面标记物可以用来从外周血分离的CTC。阳性选择为在外围循环的CTC通常使用上皮标记（例如，EpCAM的），其一个重新表达的CTC而不是造血干细胞。这种方法的缺点是，的CTC转移性潜力经常经历上皮至间质转变（EMT），该下调上皮表面标志^3。为了分离的CTC转移性潜力，负选择方法，它采用了造血表面标记，CD45，耗尽白细胞的正常细胞群可以使用^5。

前列腺癌是最常见的诊断的癌症和癌症相关死亡的男性⁶的一个主要原因。肿瘤进展和侵略性的机制尚未完全了解，因此，产生和实验模型概括前列腺癌的分子异质性的表征是显著兴趣的。前列腺癌的PDX机型已经 由人前列腺癌细胞的植入先前产生成immunocom承诺小鼠^7,8。然而，这样的模式的产生受到阻碍低植入率前列腺癌到免疫小鼠，这主要归因于疾病的性质无痛。最近，的CTC已经用于生成乳腺癌^9，肺癌¹⁰和前列腺癌¹¹ PDX模型。概念验证的这些研究引入生成的需要手术样品收集PDX模型独立的可能性。在本文中，我们详细描述了这个新的实验模型的生成方法。

研究方案

该协议已在我们的机构，从体制研究伦理委员会的批准，已进行并符合对人类福利的所有机构，国家和国际准则。

从晚期前列腺癌1.采集外周血

注意:选择治疗转移性前列腺癌。获得书面患者同意，并记录患者的临床特征，包括年龄在隔离和以前的化疗和激素治疗。转移性肿瘤患者将有可能拥有的CTC的外周血中含量最高。

1. 知情同意书后，并在适当的机构审查委员会批准的协议采集血液样本。戴乳胶手套和试验服整个过程。
2. 连接25摹蝴蝶针和管针持有人。用酒精棉签擦拭的面积二头肌和前臂的肘静脉，然后应用止血带患者的上臂。
3. 将蝴蝶针插入肘静脉推采血管为持针器开始收集。收集大约10毫升的血液中含有乙二胺四乙酸（EDTA）以防止凝固收集管。
4. 从患者除去蝴蝶针和用消毒纱布垫施加压力超过现场静脉穿刺的1分钟。盖部位用无菌绷带。

2.分离单个核细胞

注意:从第1步收集的血液将包含外周血单核细胞（PBMC）（例如，淋巴细胞和单核细胞），除了单核的CTC。

1. 吸移管的全血到50ml聚苯乙烯锥形管用5 ml的血清吸液管和添加Hanks平衡盐溶液（HBSS）以1:1的比例。轻轻吸管混合均匀化。
2. 加入15mL可商制备的溶液（菲可 - 帕克）由低速密度梯度离心来分离血液成分为空50毫升聚苯乙烯锥形管中。
3. 轻轻吸取全血和HBSS混合物，从步骤2.1，到聚苯乙烯管从步骤2.2，以形成不同的顶层。设置吸管以减少溶液混合的最低设置，这将确保有效的分离。
4. 离心机在400×g离心30分钟，在室温（25℃）。设置减速到最低设置，以防止分离后的溶液混合。加速度可以被设置为任何速度。
5. 离心后，确定在顶部和分离溶液等离子体之间PBMC和的CTC夹层的薄白灰色条纹在管的底部。
6. 收集来自白灰色条纹在步骤2.5的细胞分化成使用塑料移液管50毫升的聚苯乙烯管中。
7. 加入HBSS至50ml聚苯乙烯锥形管PBMC和检验中心和c再次entrifuge在400 XG 10分钟RT洗。
8. 再次滗析液重悬沉淀在50ml的HBSS和离心机在400×g离心3分钟，在室温洗。
9. 弃去上清液，重悬其余沉淀用5ml红细胞裂解缓冲液孵育5分钟，在室温的溶液中。
10. 除去离心的红细胞裂解缓冲液在400×g离心3分钟，在RT。
11. 弃上清，重悬沉淀在1ml的PBS 1×补充有10％胎牛血清（FBS），以阻止前抗体染色。

3.染色单个核细胞CD45-FITC抗体进行荧光活化细胞分选（FACS）

1. 量化使用血球或自动细胞计数器上可行的（台盼蓝阴性）细胞（来自步骤2.11）的数量。制备^1×10 6个细胞/ ml的悬浮液（在PBS中1×有10％FBS），并放置在冰上1小时。
2. 分发量化来自前一步骤的两试管细胞悬浮液。标签管作为对照和CD45染色。
3. 250:在控制管，在一个稀释的1加IgG1κ-FITC（2.5微克/毫升）。在CD45染色管中，加入CD45 FITC（2.5微克/毫升）的共轭初级抗体的稀释度为1:250和在冰上孵育细胞悬浮液30分钟。 CD45抗原标记用于排除造血细胞。
4. 离心细胞，在400×g离心3分钟，在4℃下，并弃去上清液。
5. 洗涤细胞两次，悬浮每个粒料用无菌1×PBS中补充了10％FBS的随后离心，在400×g离心3分钟，在4℃。
6. 悬浮在1毫升溶液含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）以10μg/ ml的浓度的PBS 1×的细胞。
7. 过滤器通过35微米的过滤器盖的最终解决方案，为12毫米×75毫米聚苯乙烯管。

4.隔离前列腺检验中心通过FACS

注:利用流式细胞仪来收集实时CD45阴性检验中心。

1. 采用细胞标记，管道组补偿控制"控制"。
2. 创建排除碎片和集群使用适当的正向散射和侧向散射参数细胞的大门。
3. 建立使用从标记的管中，细胞悬浮液的FITC门"CD45-FITC"。
4. 门可行的（DAPI阴性）使用太平洋蓝色的通道细胞。
5. 收集CD45阴性人口到无菌的15 ml的聚苯乙烯锥形管含有2毫升罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）1640补充有10％FBS中。
6. 离心机的排序前列腺肿瘤细胞悬浮液在400×g离心3分钟，然后重悬在粒料200 - 500微升的RPMI补充有10％FBS中。

5.注射的CTC入小鼠移植瘤生长和监控

注意:开展所有动物的程序符合批准的机构动物保护委员会的协议。该协议已在我们的制度下，根据和遵守所有相关的监管和体制机构，法规和准则经我们的动物保护委员会的特定动物使用协议进行的。

1. 混合排序前列腺肿瘤细胞悬浮液与细胞外基质以1:1的比例，并置于冰上。
2. 麻醉小鼠之前皮下植入的腔室在1L供给5％（体积/体积）吸入异氟烷的氧气/分钟。通过检查角膜和脚趾反射小鼠丧失确保适当的麻醉。
3. 使用地下25针和1ml注射器，注入250微升前列腺肿瘤细胞和细胞外基质的细胞悬浮液皮下注射到一个8-10周龄雄性免疫缺陷小鼠的两个上侧翼。注入无论四氯化碳浓度的250微升作为喷射体积是第important值。在小鼠最大SQ施用是不超过1毫升 
4. 通过执行鼠标注射部位为皮下结节密度生长每周触诊并通过每周测量小鼠体重两次监测小鼠。
5. 安乐死的小鼠通过二氧化碳窒息颈椎脱位和收获皮下人前列腺癌异种移植物当肿瘤大​​小超过0.5厘米和小于1厘米的最大直径，以确保有足够的肿瘤组织进行分子分析和连续传代。安乐死小鼠困扰或体重减轻15％的迹象，尽管未见肿瘤是显而易见的。

结果

该协议将导致从孤立的CD45阴性前列腺癌的CTC的产生PDX机型。根据我们的协议中使用的负选择方法，有必要用DAPI染色来排除死细胞。 CD45阴性细胞通过流式细胞术检测到的百分比是可变的并且取决于患者（图1A）的肿瘤负荷。使用CD45和DAPI未分选的细胞的免疫荧光染色（鉴别细胞核）揭示了CD45阴性细胞中，由白色箭头（图1B）所指示的。 在图1C中，皮下结节密?...

讨论

这份手稿描述了从检验中心的新一代前列腺癌PDX模型的方法。对于PDX一代的使用检验中心的 时相比，现有方法的模型有几个潜在的重要的优点。首先，访问集合的CTC的外周血使实验模型的产生来自同一患者在不同疾病阶段。第二，血液采集代表一个更安全和更便宜的方法相比，需要外科手术收集的肿瘤细胞的现有方法以分离肿瘤细胞。

CTC富集多种方法已经被描?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe