Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Özet

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Özet

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

Giriş

Hasta kaynaklı ksenogratflardır kanser araştırmaları için kullanılan giderek daha popüler deneysel modellerdir. Onlar biyomarkerların ve biyolojik yollar, klinik öncesi ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi ve kişiselleştirilmiş kanser tedavilerinin ^1,2 avatars oluşturulması karakterizasyonu için kullanılabilir. Daha önce, diğer araştırma grupları implante veya immün sistemi baskılanmış farelerin ¹ içine tek tümör hücre süspansiyonları veya tüm tümör eksplantlar enjekte edilerek ya PDX modeller geliştirdik. Bu PDX Modeller taze katı tümörün cerrahi koleksiyonu, malign asiti veya masraflı hem de ve iatrojenik morbidite riski hastayı gösterir bir cerrahi prosedür geçiren bir hastanın plevral sıvı gerektirir.

Kanser araştırmalarında çok belirgin bir gelişme dolaşan tümör hücrelerinin tespit, izolasyon ve karakterizasyonudur. Bu tümör hücreleri primer tümör kitlesi kaçmak ve dolaşıma gireronlar metastaz ve nüks önemli bir rol oynar nerede, kanserin en sık nedeni mortalite ³ ile ilgili. Birkaç solid tümör türlerinden kapalı zaman eğrilerinin değerlendirilmesi ve karakterizasyonu tanısı, prognozu ve rezidüel hastalık ³ izlemek için klinik bilgiler sağlamıştır. Ya da fiziksel özellikleri, biyo-ifadesi veya kapalı zaman eğrilerinin fonksiyonel özelliklerine dayanan şu anda kullanılan çeşitli yaklaşımlar verimli kapalı zaman eğrilerinin ⁴ izole etmek için kullanılabilir. Mevcut macroscale CTC izolasyon yöntemleri yüzey moleküllerine karşı yoğunluk gradyan santrifüj filtre gözenekleri fiziksel filtrasyon ve ayırma bulunmaktadır. En yaygın olarak kullanılan CTC izolasyon yöntemleri kapalı zaman eğrilerinin antikor bazlı yakalama dayanmaktadır. Her iki hücre yüzeyi markerlerinin pozitif ve negatif seçim periferal kandan izole edilmesi için kapalı zaman eğrilerinin kullanılabilir. Periferik dolaşımdaki kapalı zaman eğrilerinin için pozitif seçim yaygın epitel belirteçleri (örneğin, EpCAM) kullandığı birkapalı zaman eğrilerinin ancak hematopoietik olmayan hücreler üzerinde eksprese edilen yeniden. Bu yöntemin dezavantajı, metastatik potansiyele sahip kapalı zaman eğrilerinin genellikle epitelyal to-mezenkimal ³ epitel yüzey belirteçleri aşağı doğru düzenleyen bir geçiş (EMT) geçirmiş olması. Metastatik potansiyele sahip CTCS izole etmek amacıyla, hematopoietik bir yüzey işaretleyici CD45 kullanan bir negatif seçim yöntemi, lökositlerin normal hücre popülasyonu ⁵ kullanılabilir tüketmek için.

Prostat kanseri, en sık görülen kanserdir ve erkeklerde ⁶ kansere bağlı ölümlerin önemli bir nedenidir. Tümör ilerlemesi ve saldırganlık mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve bu nedenle üretim ve prostat kanserinin moleküler heterojenite özetlemek deneysel modellerin karakterizasyonu önemli ilgi konusudur. Prostat kanserinin PDX model olmuştur immunocom, insan prostat kanseri hücrelerinin nakli yoluyla daha önce oluşturulansöz fareler ^7,8. Ancak bu tür modellerin üretimi öncelikle hastalığın tembel doğası atfedilen immün sistemi baskılanmış farelere prostat kanserinin düşük engraftmant oranı, engel olmuştur. Son zamanlarda, kapalı zaman eğrilerinin meme kanseri ^9, akciğer kanseri ve prostat kanseri ^{10 11} PDX modelini oluşturmak için kullanıldı. Bunlar proof-of-concept çalışmalar cerrahi numune toplama ihtiyacı PDX modelleri bağımsız üretme olasılığını tanıttı. Bu yazıda ayrıntılı olarak yeni bir deneysel model üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

Bu protokol kurumsal araştırma etik kurulu onayı ile kurumumuza yürütülen ve insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallar ile uyumlu değil.

Gelişmiş Prostat Kanseri Hastalarında gelen Periferik Kan 1. Koleksiyonu

Not: metastatik prostat kanserli hasta seçin. Yazılı hasta rızasını ve izolasyon yaşı ve önceki kemoterapi ve hormonal tedaviler de dahil olmak üzere hastaların klinik özelliklerini, kaydedin. Metastatik hastalığı olan hastalar potansiyel periferik kanda kapalı zaman eğrilerinin en yüksek konsantrasyonuna sahip olacaktır.

1. Aydınlatılmış onam sonra uygun bir Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü onayladı altında kan örnekleri toplamak. Lateks eldiven ve prosedür boyunca laboratuvar önlüğü giyin.
2. Iğne tutucu 25 G kelebek iğne ve tüp bağlayın. Alanını temizlemek için alkol bez kullanınpazı ve önkol arasında antekübital ven, daha sonra hastanın üst koluna turnike uygulanır.
3. Antekübital ven içine kelebek iğne takın ve toplama başlatmak için iğne tutucu içine kan toplama tüpü itin. Pıhtılaşmasını önlemek için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren toplama tüplerinde kan yaklaşık 10 ml toplayın.
4. Hastadan kelebek iğne çıkarın ve 1 dakika boyunca damar delinme sitesi üzerinden steril gazlı bezle basınç uygulayın. Steril bandaj ile Kapak sitesi.

Mononükleer Hücreleri 2. İzolasyon

Not: 1 aşamasından gelen toplanan kan mononükleer kapalı zaman eğrilerinin ilave olarak çevresel kan mononükleer hücreleri (PBMC) (örneğin, lenfositler ve monositler) ihtiva edecektir.

1. : 1 oranında Pipet bütün 5 ml serolojik pipetle 50 ml polistiren konik tüp içine, kan ve 1 Hanks Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS) ekleyin. Yavaşça pipet karışımı homojenize etmek.
2. Boş 50 ml polistiren konik tüp düşük hızlı yoğunluk gradyan santrifüjü ile kan bileşiklerinin ayrılması için bir ticari olarak hazırlanmış solüsyonu (Ficoll-Paque) 15 ml ilave edilir.
3. Yavaşça farklı üst tabaka oluşturmak üzere, aşama 2,2 polistiren tüp içine, Aşama 2.1, tam kan ve HBSS karışımı pipetle. Çözümlerin karıştırma en aza indirmek için en düşük ayara ayarlayın pipet, bu verimli ayrılmasını sağlayacaktır.
4. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de (25 ° C) santrifüje tabi tutulur. En düşük ayara yavaşlama ayrıldıktan sonra çözümlerin karıştırma önlemek için. Hızlanma herhangi hıza ayarlanmış olabilir.
5. Santrifüj işleminden sonra tüpün alt kısmında üst ve ayırma çözüm üzerinde plazma arasındaki PBMC'Ier ve KTC sandviç tabakasının ince beyaz-gri şerit tespit.
6. Plastik transfer pipet kullanarak 50 ml polistiren tüp içine adım 2.5 beyaz-gri şerit hücreleri toplayın.
7. PBMC'leri ve kapalı zaman eğrilerinin ve c 50 ml polistiren konik tüp HBSS ekle10 dk RT yıkamak için 400 xg'de tekrar entrifuge.
8. Yıkamak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g hızında tekrar santrifüj HBSS ve 50 ml sıvı ve tekrar süspansiyon pelet boşaltacaktır.
9. Süpernatant atılır, kırmızı kan hücre lisis tamponu, 5 ml kalan pelet tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çözelti inkübe edin.
10. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile kırmızı kan hücre parçalama tamponu çıkarın.
11. Süpernatant atılır ve önceden antikor boyama engellemek için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 ml PBS 1X pelletini.

Kontrol THP için CD45-FITC antikoru 3. boyanması Tek Çekirdekli Hücreleri (FACS)

1. Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanılarak (adım 2.11 itibaren) canlı (tripan mavi-negatif) hücrelerin sayısını ölçmek. (% 10 FBS ile PBS 1x), 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir süspansiyon hazırlayın ve 1 saat boyunca buz üzerine yerleştirin.
2. Sayısal Dağıtiki tüp içine, önceki aşamada elde edilen hücre süspansiyonu. Kontrol ve CD45 boyanma olarak Etiket tüpleri.
3. 250: kontrol tüpüne 1, bir seyreltme IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) ekleyin. CD45 boyama tüpü, 1 bir seyreltme CD45 FITC (2,5 ug / ml) konjüge birincil antikor ekleyin: 250 ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücre süspansiyonları. CD45 antijeni markalama hematopoietik hücreleri için de kullanılır.
4. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve süpernatant atılır.
5. Steril 1 x PBS ile her pelet süspanse edilmesi suretiyle, hücreler iki kez yıkanır, 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile ve ardından,% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
6. 10 ug / ml'lik bir konsantrasyonda 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren PBS 1x 1 ml çözelti içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
7. 12 mm x 75 mm polistiren tüpler içine 35 mikron süzgeç kapaklar sayesinde nihai çözüm Filtre.

Prostat kapalı zaman eğrilerinin 4. İzolasyon tarafındanFACS

Not: Canlı CD45 negatif CTCS toplamak için bir akış sitometresinin yararlanın.

1. Etiketli tüpten hücreleri kullanılarak Set tazminat kontrolleri "Denetim".
2. Enkaz ve uygun ileriye dağılım ve yan dağılım parametreleri kullanılarak hücrelerin kümelenmeleri hariç kapıları oluşturun.
3. Etiketli tüp, hücre süspansiyonları kullanılarak FITC kapıları kurulması "CD45-FITC."
4. Pasifik mavi-A kanalı kullanılarak Kapısı canlı (DAPI-negatif) hücreleri.
5. % 10 FBS ile takviye edilmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 2 ml ihtiva eden steril bir 15 ml polistiren konik tüp içine CD45 negatif popülasyonu toplayın.
6. % 10 FBS ile takviye edilmiş RPMI 500 ul - santrifüj 3 dakika boyunca 400 x g'de kriteri prostat tümörü hücre süspansiyonu daha sonra 200 pelet tekrar süspansiyon.

Xenograftlarında Büyüme Fareler ve İzleme içine kapalı zaman eğrilerinin 5. Enjeksiyon

Not:Kurumsal hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış protokoller uyarınca tüm hayvan prosedürleri yürütün. Bu protokol tüm ilgili düzenleyici ve kurumsal kurumlar, yönetmelik ve yönergelere uygun olarak ve uygun bizim Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanan belirli Hayvan Kullanımı Protokolü kapsamındaki bizim kurumda yapılmıştır.

1. Buz üzerinde 1 oranında ve yeri: 1 hücre dışı matriks ile sıralanmış prostat tümör hücre süspansiyonu karıştırın.
2. Oksijen / dak, 1 L% 5 (h / h) inhale izofluran sağlayan bir oda içinde deri altından implante edilmesinden önce fare anestezisi. Fare kornea ve ayak refleks kaybı için kontrol ederek uygun anestezi sağlamak.
3. Bir 25 G iğne ve 1 ml şırınga kullanarak, 8-10 haftalık erkek bağışıklık yetersizliği olan fare hem üst yanları içine prostat tümörü hücre ve hücre-dışı matris hücre süspansiyonu deri altından 250 ul enjekte edilir. Enjeksiyon hacmi i olarak 250 ul bakılmaksızın CTC konsantrasyonu enjektemportant değer. Farede maksimum SQ uygulanması en fazla 1 ml'dir.  
4. Subkutan nodüler yoğunlukları büyümesi için fare enjeksiyon siteleri haftalık palpasyonu yaparak ve haftada iki kez fareler ağırlık ölçerek fareler izleyin.
5. Tümör büyüklüğü, moleküler analiz ve seri pasaj için yeterli tümör dokusu sağlamak için en fazla 0.5 cm ve en büyük çapı en az 1 cm servikal dislokasyon ile hasat deri altı hümen prostat kanseri ksenograftları ardından karbon dioksit ile boğarak fareler öldürülür. Hiçbir tümör rağmen sıkıntı ya da% 15 kilo kaybı belirtileri ile fareler Euthanize hissediliyor.

Sonuçlar

Bu protokol izole CD45 negatif prostat kanseri kapalı zaman eğrilerinin gelen PDX modellerinin oluşmasına yol açacaktır. Protokolde kullanılan negatif seçim yöntemine dayanarak DAPI leke kullanılarak ölü hücreleri hariç gereklidir. Akış sitometrisi ile tespit CD45 negatif hücrelerin yüzdesi değişkendir ve hasta (Şekil 1A) tümör yükünün bağlıdır. Beyaz oklar (Şekil 1B) ile belirtildiği gibi (hücre çekirdekleri belirlemek için) CD45 ve DAPI kullanılarak ...

Tartışmalar

Bu yazıda kapalı zaman eğrilerinin prostat kanseri PDX modellerin üretimi için bir yöntem tarif eder. PDX üretimi için kapalı zaman eğrilerinin kullanılması Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında modelleri birçok potansiyel önemli avantajlara sahiptir. İlk olarak, periferal kan, kapalı zaman eğrilerinin erişilebilir toplanması, farklı hastalık safhalarında aynı hastadan alınan deney modellerinde üretilmesini sağlar. İkinci olarak, kan toplama tümör hücrelerinin ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe