خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام

Summary

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Abstract

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Introduction

القيطم المورق استخراج البيض هو أداة قوية والتطبيقية على نطاق واسع لدراسة الأحداث الخلوية المعقدة في بساطة مقايسة خالية من الخلايا. منذ أول وصف من قبل Lohka وMasui ¹ كانت قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة العمليات الإنقسامية مثل لونين التكثيف ^2، والتجمع المغزل ^3، المغلف انهيار النووي ^4، ولكن أيضا وسائل النقل نووي هيولي ⁵ أو ⁶ تكرار الحمض النووي. الأحداث الجارية في نهاية الانقسام، اللازمة لإعادة تشكيل نواة interphasic مثل إصلاح الغلاف النووي والمسام النووي إعادة التجميع المعقدة هي أقل بكثير يفهم مقارنة أحداث الإنقسامية في وقت مبكر ولكن يمكن دراستها على نحو مماثل باستخدام القيطم استخراج البيض ^7. أنشأنا مؤخرا مقايسة على أساس القيطم استخراج البيض لدراسة ونين decondensation في نهاية الانقسام ^8، وهي عملية التحقيق في إطار ذلك ينتظر طنهاية الخبر توصيف مفصل.

في metazoans، ويتم تكثيف لونين للغاية في دخول الإنقسامية من أجل القيام بأمانة الفصل بين المادة الوراثية. للتأكد من أن لونين يمكن الوصول إليها للتعبير عن الجينات وتكرار الحمض النووي أثناء الطور البيني، فإنه يحتاج إلى أن إلغاء ضغط في نهاية الانقسام. في الفقاريات، لونين هو ما يصل إلى خمسين ضعفا أكثر كبس خلال الانقسام مقارنة البيني ^9، على النقيض من الخمائر حيث الضغط الإنقسامية عادة ما يكون أقل من ذلك بكثير، على سبيل المثال، فقط شقين في S. الخباز ^10. وقد الفقاريات لونين decondensation درس معظمهم في سياق إعادة تنظيم DNA الحيوانات المنوية بعد الإخصاب البيض. A الآلية الجزيئية، التي nucleoplasmin، وهو بروتين الخلية البيضية وفيرة، ويتبادل protamines الحيوانات المنوية محددة لالهستونات H2A وH2B المخزنة في البيض. تم توضيح هذه العملية أيضا باستخدام القيطم استخراج البيض ^{11 و 12.} ومع ذلك، فإن التعبيرمن nucleoplasmin يقتصر على البويضات ^{13 و} ونين الإنقسامية لا تحتوي على هذه protamines الحيوانات المنوية الخاصة. لذا لونين decondensation في نهاية الانقسام هو nucleoplasmin مستقلة ^8.

لفي المختبر decondensation رد فعل ونحن توظيف استخراج الناتجة عن تنشيط X. البيض المورق وتجمعات لونين عزل من خلايا هيلا متزامنة. علاج البيض مع حامل الأيون الكالسيوم يحاكي إطلاق الكالسيوم في البويضة الناتجة عن دخول الحيوانات المنوية أثناء الإخصاب. موجة الكالسيوم مشغلات استئناف دورة الخلية والبيضة، الذي اعتقل في الطورية الثانية من الانقسام الاختزالي، يتقدم إلى البيني الأول ^14. ولذلك، مقتطفات البيض إعداد النموذج تنشيط البيض تمثل الإنقسامية الدولة مخرج / البيني وهي المختصة للحث على أحداث محددة للخروج الإنقسامية مثل decondensation لونين، المغلف النووي والمسام إصلاح معقدة. لعزل الفصل الإنقساميةromatin مجموعات استخدمنا صيغة معدلة بشكل طفيف من البروتوكول التي نشرتها جاسر وLaemmli ^15، حيث يتم الإفراج مجموعات كروموسوم التي تحلل من خلايا هيلا متزامنة في الانقسام ومعزولة في البوليامين تحتوي على مخازن من قبل centrifugations الانحدار.

Protocol

الإنقسامية لونين عزل الكتلة من الخلايا هيلا

1. الاستعدادات

1. حلول الثقافة الخلية
   1. إعداد المتوسطة المعدلة النسر كاملة Dulbecco ولل(DMEM) وذلك بإضافة 10٪ مصل الجنين العجل، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 2 ملي الجلوتامين إلى DMEM. إعداد المالحة العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 2.7 ملي بوكل، 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي _نا 2 هبو ₄ 2H _{2 O} و 2 ملي KH ₂ PO ₄ في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم.
      ملاحظة: PBS يمكن أن تبقى كما 10X حل سهم مع مرور الوقت في RT. تمييع مع الماء منزوع الأيونات إلى 1x أخرى قبل الاستخدام. تصفية حل 1X مرة أخرى إذا كان سيتم استخدامها في زراعة الخلايا.
   2. إعداد المخزون 40 ملي حل التيميدين (زراعة الخلايا المناسبة) في DMEM المتوسطة. حل 0،97 ز التيميدين في 90 مل من DMEM المتوسطة. ضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. حل محل الأوراق المالية في -20 °C. حل (تنبيه! يعملون تحت غطاء الكيميائية، وارتداء القفازات وحماية الفم) نوكودازول إلى 5 ملغ / مل حل الأسهم في DMSO.
2. الإنقسامية مجموعات حلول عزل
   ملاحظة: جميع الحلول الموضحة في 1.2 تحتاج إلى أن تبقى على الجليد بعد إعداد / الذوبان في كافة مراحل التجربة برمتها.
   1. الماء منزوع الأيونات الأوتوكلاف لمدة 105 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. حل tetrahydrochloride السبرمين في تعقيمها والماء منزوع الأيونات إلى تركيز النهائي من 200 ملم (69.6 ملغ / مل). مخزن حل الأوراق المالية في -20 ° C. حل trihydrochloride الأسبرميدين في تعقيمها والماء منزوع الأيونات إلى تركيز النهائي من 200 ملم (50.8 ملغ / مل). مخزن حل الأوراق المالية في -20 ° C.
   2. إعداد 5٪ (ث / ت) ديجيتونين (تنبيه! يعملون تحت غطاء الكيميائية، وارتداء القفازات وحماية الفم) في والماء منزوع الأيونات الساخن. تصفية وتخزين aliquots في -20 ° C. حل فلوريد phenylmethylsulfonyl (PMSF) (تنبيه! عمل undeغطاء الكيميائية ص، وارتداء القفازات وحماية الفم) إلى التركيز النهائي من 200 ملم (35 ملغ / مل) في الإيثانول بنسبة 100٪. مخزن حل الأوراق المالية في -20 ° C.
   3. حل dithiothreitol (DTT) مع الماء منزوع الأيونات إلى تركيز النهائي من 1 M (154 ملغ / مل) (تنبيه! يعمل تحت غطاء الكيميائية، وارتداء القفازات). تصفية والأسهم مخزن الحل في -20 ° C.
   4. إعداد 100 أضعاف مزيج مثبط البروتياز (تنبيه تعمل تحت غطاء الكيميائية، وارتداء قفازات!) عن طريق إذابة 10 ملغ / مل AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride)، 0.2 ملغ / مل leupeptin، 0.1 ملغ / مل pepstatin و 0.2 ملغ / مل أبروتينين في الماء منزوع الأيونات. مخزن حل الأوراق المالية في -20 ° C.
   5. يعد حل 10X تقييم العازلة والتي تحتوي على 150 ملي تريس الكلورين (7.4 درجة الحموضة)، 800 ملي بوكل، 20 ملي EDTA-KOH (7.4 درجة الحموضة)، 2 مم السبرمين tetrahydrochloride و 5 ملي الأسبرميدين trihydrochloride. مخزن عازلة A في 4 درجات مئوية دون tetrahydrochloride السبرمين والأسبرميدين trihydrochloride، التي ينبغي أن تضافحديثا فقط تستخدم من قبل.
      ملاحظة: EDTA يذوب فقط في بالوسط أعلى من 8، بالتالي، أن تعد عالية تتركز EDTA-KOH حل سهم (0.5 M مستحسن)، إضافة 5 N KOH لدرجة الحموضة فقط فوق 8 حلها. يعاير بعد ذلك الى 7.4 درجة الحموضة.
   6. يعد حل 20x والأسهم العازلة والتي تحتوي على 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)، 400 ملي بوكل، 400 ملي EDTA-KOH (7.4 درجة الحموضة) و 5 ملي الأسبرميدين trihydrochloride. العازلة كما يمكن تخزينها تحت نفس الظروف التي عازلة A.
      ملاحظة: إعداد الحلول العامل الأول إلى الرابع (انظر في الخطوات التالية)، التدرج الجلسرين والحلول جسيمات السيليكا الغروية التي تحتوي على جزيئات السيليكا (15-30 قطرها نانومتر) المغلفة مع بوفيدون غير dialyzable (PVP) طازجة قبل العزلة (ينبغي أن يضاف PMSF وديجيتونين مباشرة قبل الاستعمال كما PMSF غير قابل للتغيير في المحاليل المائية وديجيتونين يميل لترسيب على تخزين على المدى الطويل على الجليد) الإجراء.
   7. إعداد 100 مل من محلول I بإضافة 0.5X العازلة A،1 ملي DTT، 1: 100 من مزيج مثبط البروتياز و 0.1 ملي PMSF إلى تعقيمها والماء منزوع الأيونات. إعداد 50 مل من محلول II (للتحلل الخلية) وذلك بإضافة 1X عازلة A، 1 ملم DTT، 1: 100 من مزيج مثبط البروتياز، 0.1 ملي PMSF، 0.1٪ ديجيتونين و 10٪ الجلسرين إلى تعقيمها والماء منزوع الأيونات.
   8. إعداد 200 مل من محلول يحتوي على III عازلة 0.25X A، 1 ملم DTT، 1: 100 من مزيج مثبط البروتياز، 0.1 ملي PMSF و 0.05٪ ديجيتونين في تعقيمها والماء منزوع الأيونات. إعداد 40 مل من محلول IV تحتوي على العازلة 1X و، 1 ملم DTT، 1: 100 من مزيج مثبط البروتياز، 0.1 ملي PMSF و 0.1٪ ديجيتونين في تعقيمها والماء منزوع الأيونات.
   9. إعداد 120 مل من محلول الجلسرين التدرج بإضافة 25٪ الجلسرين و 0.1٪ ديجيتونين إلى حل I.
   10. إعداد 150 مل من الغروية حل جسيمات السيليكا التي تحتوي على 60٪ V / V (حجم في الحجم) من تعليق تحتوي على جزيئات السيليكا (قطر 15-30 نانومتر) المغلفة مع بوفيدون غير dialyzable (PVP)، و 15٪ الجلسرين، 2 مم الصورةpermidine trihydrochloride و 0.8 ملي السبرمين tetrahydrochloride في حل رابعا.
   11. إعداد كتلة عازلة التخزين التي تحتوي على 250 ملي السكروز، 15 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة)، 0.5 ملي الأسبرميدين trihydrochloride، 0.2 ملي السبرمين tetrahydrochloride، 1: 100 من مزيج مثبط البروتياز، 0.3٪ BSA و 30٪ الجلسرين. يمكن الاحتفاظ المخزن المؤقت تخزين الكتلة في -20 ° C.
   12. إعداد الاسكواش حل الإصلاح التي تحتوي على 10٪ الفورمالديهايد (تنبيه! يعملون تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، وارتداء القفازات)، 50٪ الجلسرين، ذات شقين التعديل عازلة مارك قارعو الأجراس (MMR نرى 4.5) و 0.2 ميكروغرام / مل دابي (تنبيه! ارتداء القفازات). تخزين عند 4 درجات مئوية في ظل حماية أنابيب رد فعل. أنها ليست حاسمة بالنسبة لتجربة لاستخدام هذا الإصلاح الاسكواش وصفة، وصفات بديلة تعمل أيضا.

2. تزامن خلايا

1. في يوم 1: بذور خلايا هيلا في خمسة 75 سم ² (250 مل) قوارير مع وسائل الإعلام واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية في 5٪ C_O 2.
   ملاحظة: هذا العائد في ما يقرب من 18 × 10 ⁶ خلايا في يوم من العزلة كتلة لونين.
2. يوم 2: عندما الخلايا لا يقل عن 50٪ متموجة (تقريبا تغطي نصف سطح الخلايا ومازال هناك مجال للخلايا أن تنمو)، إضافة التيميدين إلى تركيز النهائي من 2 ملم (كتلة التيميدين) والخلايا الثقافة ل 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
   ملاحظة: هذا إلقاء القبض على خلايا في G1 / S الحدود المرحلة.
3. يوم 3: نضح المتوسطة التي تحتوي على التيميدين وإضافة PBS العقيمة. غسل الخلايا عن طريق الشطف دقيق مع برنامج تلفزيوني العقيمة. نضح PBS وبلطف إضافة 15-20 مل من خلايا جديدة، دافئة كاملة DMEM المتوسطة والثقافة لمدة 3 إلى 4 ساعات في 37 درجة مئوية في 5٪ CO _{2 إلى} إطلاق سراحهم من كتلة G1 / S-المرحلة.
4. في يوم 3 (تابع): بعد الإفراج عن الخلايا من كتلة G1 / S-المرحلة، إضافة نوكودازول إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل. تمييع نوكودازول بإضافة 2 ميكرولتر من محلول المخزون (5 ملغ / مل) إلى 98ميكرولتر من الطازجة المتوسطة DMEM، وإضافة 1 ميكرولتر من المخفف نوكودازول لكل مل من ثقافة الخلية. خلايا الثقافة لنحو 12 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2. وهذا منع الخلايا في الانقسام.

3. الميتوزى مجموعات عزل

1. يوم 4: عزل التجمعات الإنقسامية. باستخدام المجهر حقل مشرق، معرفة ما اذا كان غالبية الخلايا الإنقسامية. إذا كانت أقل من 50٪ من الخلايا هي الانتظار حتى الإنقسامية المزيد من الخلايا تصل الانقسام. جمع الخلايا الإنقسامية عن طريق النقر بقوة على جانب القارورة (أو عن طريق الرش بلطف مع ماصة)، وهذا فصل الخلايا الإنقسامية المتبقية. نقل تعليق الخلية إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية.
   ملاحظة: خلايا الميتوزى تصبح الجولة ويمكن فصل بسهولة من أسفل القارورة (تماما مثل الخلايا بعد trypsinization)، على عكس الخلايا في مراحل أخرى دورة الخلية، والتي هي شقة وترتبط بقوة مع القارورة.
2. حصاد الخلايا الإنقسامية من خلال الدوران الأنابيب في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة (476؛ C أو RT) وإزالة طاف بعد ذلك. resuspend الكرية خلية في 8 مل PBS، تجمع في واحدة من 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي، وملء الأنبوب تماما مع برنامج تلفزيوني وتدور مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. كرر هذا الإجراء الغسيل ثلاث مرات في المجموع.
3. من الآن فصاعدا تنفيذ جميع الخطوات على الجليد مع حلول الباردة. و resuspend بقوة بيليه في 37 مل من محلول الباردة II. نقل تعليق على البارد 40 مل الزجاج من الزجاج الخالط باستخدام 25 مل ماصة وليز الخلايا على الجليد douncing مع مدقة ضيقة حتى مجموعات الإنقسامية خالية من المواد حشوية. عدد من السكتات الدماغية يعتمد إلى حد كبير على الأسهم ديجيتونين ويمكن أن تختلف 3-20 مرات.
   ملاحظة: التجانس يمكن أن يكون قويا إلى حد ما، ولكن ينبغي النظر في كامل عندما هي lysed الخلايا الإنقسامية جميع تقريبا، وتعتبر هذه التجمعات على أن تكون خالية من المواد حشوية (انظر 3.4).
4. بعد بضع ضربات مزيج 5-10 ميكرولتر من تعليق خلية 1: 2 مع التريبان الأزرق والتحقق من قبل ميكرoscopy في غرفة نويباور. اتسخت لونين عندما هي lysed الخلايا الأزرق وخالية من أغشية الخلايا (ملاحظة: سوف الممكنة حشوية بقايا يكون تتراكم حول لونين الأزرق الملون، وسوف يكون من السهل تمييز).
   ملاحظة: خلايا الميتوزى وليز قبل خلايا interphasic ولكن مع ذلك يجب الحرص على عدم تطرف التجانس من أجل تجنب التلوث مع نوى interphasic والكروماتين المهترئ.
5. طبقة على الفور المحللة كله الخليوي أكثر من خطوة التدرجات الباردة (مع 5 مل من 60٪ الغروية جزيئات السيليكا حل في الجزء السفلي، مضافين مع 19.5 مل من الجلسرين التدرج حل لكل منهما) في خمسة أنابيب الطرد المركزي البولي (28.8 X 107.0 ملم، فمن المستحسن ل وضع أنابيب على الجليد قبل أن يبرد عليهم) باستخدام ماصة 10 مل. لا تبقي الخلايا في حل II لفترة طويلة، وبالتالي فمن المستحسن لإعداد أنابيب والتدرج مسبقا (على سبيل المثال، خلال خطوات الغسيل).
6. أجهزة الطرد المركزي التدرجات لمدة 30 ميلن في 1000 x ج في 4 درجات مئوية في الدوار زاوية ثابتة.
   ملاحظة: نوى، يتم استرداد خلايا unlysed ومجموعات معا في واجهة من الجلسرين والغروية السيليكا الجسيمات طبقات.
7. إزالة السائل فوق البيني باستخدام ماصة ونقل الباقين إلى الخالط البارد. خليط إعادة التجانس التي كتبها 3-15 السكتات الدماغية (مرة أخرى اعتمادا على المخزون ديجيتونين) مع مدقة ضيقة للقضاء على المجاميع وإزالة الألياف هيكل الخلية من الكتل. بعد كل بضع ضربات تحقق كفاءة التجانس. مزيج 1 ميكرولتر من العينة مع 1 ميكرولتر من الإصلاح الاسكواش تستكمل مع دابي وفحص تحت المجهر الفلورسنت.
   ملاحظة: عدد من السكتات الدماغية أمر بالغ الأهمية، وجود كتلة المجاميع الوسائل، أن عدد من السكتات الدماغية غير كافية، في حين لونين المهترئ والحطام أنويتها تشير إلى أن التجانس كان قويا جدا.
8. توزيع حل بين أربعة أنابيب البولي الطرد المركزي الجديدة (28.8 X107.0 ملم) (حوالي 10 مل من محلول في أنبوب) وشغل لهم تماما مع 60٪ جسيمات السيليكا الغروية حل (حوالي 30 مل الغروية جزيئات السيليكا الحل في أنبوب).
   ملاحظة: تجنب إثقال جزيئات السيليكا الغروية الانحدار منذ الكتل يمكن بسهولة محاصرين إذا كان هناك الكثير من الحطام حشوية في الانحدار.
9. تدور لمدة 5 دقائق في 3000 x ج، تليها 30 دقيقة في 45440 x ج في 4 درجات مئوية في الدوار زاوية ثابتة.
   ملاحظة: كما كان من قبل، وستبقى نوى interphasic من دخول التدرج (إذا لم يحدث التجانس بشكل كبير جدا الذي يطلق نوى من الحطام حشوية) إلا أن مجموعات تتراكم حوالي 1.5 سم من أسفل الأنبوب، وغالبا ما يكون كرة مرتدة.
10. إزالة السائل فوق كتل باستخدام ماصة، تجمع الباقي في أنبوب واحد، حسنا و resuspend وإعادة توزيعها إلى أنبوبين الطرد المركزي البولي (28.8 X 107.0 ملم). تمييع تعليق المجموعة 1: 4 مع حل ثالثا في كل أنبوب وتخلط جيدا. علامة عشروكان الموقع الإلكتروني سوف يكون بيليه وتدور 1000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار زاوية ثابتة.
11. Resuspend والكريات في الحل الثالث، تجمع في واحدة من 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي وملء مع الحل الثالث. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج فقط لحوالي 10 دقيقة. لا أجهزة الطرد المركزي في أعلى سرعة - قد تسبب التجميع النهائي لمجموعات.
12. يغسل مرة أخرى مع الحل الثالث في 1.5 أو 2 مل أنابيب رد فعل (resuspend والكريات وملء أنابيب تصل تماما) وأجهزة الطرد المركزي في 300 ز س. إزالة طاف بعناية مع ماصة. بيليه resuspend بعناية في 250 ميكرولتر العازلة التخزين الكتلة (إذا كان لديك عدة الكريات تستخدم 250 ميكرولتر عن كل ذلك معا وبركة لهم). تمييع 5-10 ميكرولتر من العينة 1: 2 مع التريبان الأزرق والعد في غرفة نويباور. إذا مخفف ينطبق أكثر للحصول على تركيز تقريبي 500 مجموعات / ميكرولتر.
13. دفع تعليق من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون للتأكد من إزالة التجميع الكتلةالصورة الناتجة عن إعادة تعليق غير لائق. يمكن تخزين مجموعات لشهور في -80 ° C. لتجنب إعادة تجميد متعددة تجعل قسامات المناسبة والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل.

4. محضرات العازلة للInterphasic القيطم المورق استخراج البيض

ملاحظة: القيطم المورق يتم الاحتفاظ الضفادع ويعامل وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اتفاقية مجلس أوروبا بشأن حماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وأخرى (EU صدقت في عام 1998) والقانون الألماني المتصة استخدام الحيوانات الفقارية في مجال البحوث.

1. إعداد DTT و 100 أضعاف مزيج مثبط البروتياز وفقا ل1.2.3 و1.2.4. حل مثبط حركة الخلايا B إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل في DMSO، قسامة (10 أو 20 ميكرولتر موصى به) وتخزينها في -20 ° C.
2. حل سيكلوهيكسيميد إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل في الإيثانول، قسامة (500 ميكرولترمستحسن) وتخزينها في -20 ° C. حل حامل الأيون الكالسيوم A23187 إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل في الإيثانول، قسامة وتخزينها في -20 ° C.
   ملاحظة: PI، DTT، مثبط حركة الخلايا B، سيكلوهيكسيميد وA23187 يمكن تجميد مرارا وتكرارا وإذابة.
3. إعداد 20x والتعديل عازلة قارعو الأجراس مارك (MMR) التي تحتوي على 2 M كلوريد الصوديوم، و 40 ملي بوكل، 20 ملي MgCl _2، 40 ملم CaCl _2، 2 مم EDTA و 100 ملي HEPES، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع 5 N KOH.
   ملاحظة: MMR 20x ويمكن أن تبقى على مر الزمن الطويل في RT. اعتمادا على كميات من البيض، لإعداد واحدة من interphasic استخراج البيض 1 L من 1X MMR في الضفدع حقن و5-10 لتر إضافي للخطوات غسل ضرورية. إعادة ضبط درجة الحموضة من 1X MMR إلى 8.0 مع 5 N KOH. 1X MMR على استعداد للحفاظ على الضفادع في O / N × 1 يجب أن تكون على RT. 1X أعدت للإعداد مستخلص MMR يجب أن تبقى باردة حتى يتم استخدامها، ومع ذلك فإنه ليس حاسما لهذه التجربة أن 1X MMR هو الباردة حقا.
4. إعداد 1 L من يمثارتفع العازلة التي تحتوي على 250 ملي السكروز، 50 ملي بوكل، 2.5 ملي MgCl ₂ و 10 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة. وينبغي إعداد عازلة السكروز اليوم قبل استخدام الماء المعقم ويجب أن تبقى في 4 درجات مئوية.
5. إعداد الحل dejellying طازجة في صباح يوم من التجربة عن طريق إذابة 2٪ L-سياستين في 0.25X MMR. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع 5 N KOH. الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامه.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu الصورة استخراج المورق البيض

1. ضخ 120 IE موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس الحامل (PMSG) في كيس ظهري الليمفاوية من كل ضفدع قبل 3-10 أيام التجربة (5 مل الحقن، 27 G ¾ '' الإبر).
   ملاحظة: هذا الحقن لحث الإباضة. كمية من البيض يضع ضفدع واحد يختلف كثيرا. ضفدع وضع جيد قد تنتج البيض يحتل حجم ما يصل إلى 7 مل بعد أن نزع jellynated-والتي تتطابق مع ما يصل الى 3.5 مل من استخراج النفط الخام. ومع ذلك، نرى أن بعض الضفادع قد لا تضع أو سوف لاص الاسوياء.
2. ضخ 500 IE موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية) في الضفدع المساء قبل التجربة (5 مل المحاقن، 27G ¾ '' الإبر). هذا وسوف لحث على الإفراج عن البيض. الحفاظ على الضفادع ل13-17 ساعة عند 18 ° C في خزانات الفردية التي تحتوي على 1.2 لتر 1X MMR (درجة الحموضة 8).
3. جمع البيض عن طريق سكب عليها إلى 600-1،000 الأكواب الزجاجية مل.
   ملاحظة: خذ فقط دفعات جيدة من البيض الذي وضعت بشكل فردي، مماثلة في حجم والمصطبغة بشكل واضح مع الظلام ونصف اللون الفاتح. لا تأخذ البيض التي تشكل سلاسل أو أن منتفخ نظرة والأبيض. هذه يجب تسويتها في جميع أنحاء الإجراء بأكمله باستخدام البلاستيك ماصة باستير. للحصول على وصف مفصل من جيدة مقابل سيئة البيض رؤية غيليسبي وآخرون. ⁶
4. غسل البيض بشكل مكثف، ما يقرب من 4 مرات، مع 1X MMR من قبل الصب طاف عندما استقر البيض إلى أسفل وإعادة تعبئة الكأس مع العازلة جديدة بعد ذلك.
   ملاحظة:البيض مستقرة قبل أن يتم dejellynated هم وعازلة غسل يمكن تطبيقها مباشرة على البيض.
5. Dejellynate البيض قبل الحضانة في حل سياستين 2٪. تغيير عازلة مرة واحدة بعد 2-4 دقائق قبل الصب المخزن المؤقت وملء بعناية الكأس مع العازلة الطازجة. Considerdejellying كاملة عندما يكون حجم البيض يقلل بشكل كبير وأصبح البيض معبأة أكثر كثافة.
   ملاحظة: إن dejellying تحتاج حوالي 5-7 دقائق ويجب أن تتوقف عند مرئية ولكن آخر بعد 10 دقيقة.
6. البيض غسل ما يقرب من 4 مرات مع 1X MMR من قبل الصب وإعادة تعبئة طاف العازلة.
   ملاحظة: البيض أكثر هشاشة بعد أن dejellynated، وبالتالي تحتاج إلى خطوات الغسيل الذي يتعين القيام به بعناية أكبر. معدل وفيات الأمهات وينبغي بدلا تشطف على جدار الكأس بدلا من مباشرة على البيض.
7. تفعيل البيض في 100 مل 1X MMR بإضافة 8 ميكرولتر من حامل الأيون الكالسيوم (2 ملغ / مل في الإيثانول). وقف التنشيط عند يكون الغطاء الحيواني الانكماشيأتي مرئية أو بعد 10 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن التعرف على تقلص الغطاء الحيواني من الضغط في الشوط الأسود من البيض.
8. تغسل بعناية 4 مرات مع 1X MMR من قبل الصب وإعادة تعبئة طاف العازلة.
9. احتضان البيض لمدة 20 دقيقة في 1X MMR في RT.
10. إعداد أنابيب الطرد المركزي خلال فترة الحضانة: مكان 50 ميكرولتر عازلة السكروز، 50 ميكرولتر 100 أضعاف مزيج مثبط البروتياز، 5 ميكرولتر 1 M DTT، 12.5 ميكرولتر سيكلوهيكسيميد (لمنع الترجمة، خصوصا من السيكلين B) و 2.5 ميكرولتر مثبط حركة الخلايا B (ل منع الأكتين البلمرة) في 5 مل أنابيب الطرد المركزي (13 × 51 ملم). بدلا من ذلك، لأكثر من 30 مل من البيض، 14 مل أنابيب (14 × 95 مم) يمكن استخدامها، في هذه الحالة زيادة أحجام المبيعات بحوالي 2.4 مرات.
11. غسل البيض مرتين مع العازلة الباردة السكروز (صب وعازلة عبوة في كوب زجاجي) ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي باستخدام ماصة باستير البلاستيك مع فتحة واسعة (قطع نهاية الضيقة).
12. حزمةالبيض من خلال الدوران لمدة 1 دقيقة في 130 ز س. وضع الأنابيب في 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية لهذا الغرض (وضع 14 مل أنابيب لفي 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية، على التوالي). والهدف هو إزالة أكبر قدر من العازلة ممكن لمنع تمييع للاستخراج. بعد الطرد المركزي، وإزالة فائض من العازلة باستخدام البلاستيك ماصة باستير في نهاية المطاف ملء المزيد من البيض على القمة.
13. تدور في 6 × 5 مل تأرجح الدوار لمدة 20 دقيقة في 21000 x ج في 4 درجات مئوية.
14. إزالة المنخفض استخراج سرعة باستخدام حقنة 5 مل مع 16 G 1 ½ '' إبرة، بين صفار البيض الأصفر على رأس والظلام كسر الحطام البيض في القاع. لهذا الغرض، ودفع إبرة حقنة من خلال جدار أنبوب الطرد المركزي فقط فوق طبقة من كسر الحطام البيض في القاع. عقد أنبوب ضد المقاومة عند الضغط مع الإبرة.
    ملاحظة: شغل 5 مل أنبوب الطرد المركزي يمنح بين 1،8-2،5 مل من مستخلص.
15. لكل 1 مل من مستخلص إضافة 10 ميكرولتر 100 أضعاف مزيج مثبط البروتياز، 1 ميكرولترمن 1 M DTT، 2.5 سيكلوهيكسيميد ميكرولتر (20 ملغ / مل) و 0.5 ميكرولتر مثبط حركة الخلايا B (10 ملغ / مل). الحفاظ على استخراج على الجليد.
    ملاحظة: يمكن استخراج إما استخدامها مباشرة للتجربة أو aliquoted، المفاجئة المجمدة وتخزينها في النيتروجين السائل لعدة أشهر. سوف تجميد استخراج خفض نشاطها. للتجارب الحساسة مثل immunodepletion ينصح بشدة لاستخدام استخراج الطلق فورا.

6. إعداد المخازن المؤقتة لفي المختبر إعادة إعماره من لونين Decondensation

1. تحضير المحلول مزيج الطاقة التي تحتوي على 25 ملي ATP، 25 ملم GTP، 127.5 ملغ / مل فوسفات الكرياتين و 2.5 ملغ / مل الكرياتين كيناز في العازلة التي تحتوي على 250 ملي السكروز، 1.2 ملي HEPES، 5.9 ملي بوكل و 0.3 ملي MgCl _2. قسامة وتخزينها في -80 ° C. استخدام الطازج بعد ذوبان الجليد، لا اعادة تجميد.
2. حل 0.2 غرام / مل الجليكوجين في الماء منزوع الأيونات. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. حل aminopurine 6-ثنائي ميثيل (DMAP) إلى التركيز النهائي0.25 M في DMSO. قسامة وتخزينها في -20 ° C. استخدام الطازج بعد ذوبان الجليد، لا اعادة تجميد.
3. إعداد 30٪ (ث / ت) السكروز في برنامج تلفزيوني، ومرشح وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد 4٪ حل VikiFix تحتوي على 80 ملي أنابيب الرقم الهيدروجيني 6.8، 1 ملم MgCl _2، 150 ملي السكروز و 4٪ لامتصاص العرق (PFA) (تنبيه! يعمل تحت غطاء الكيميائية، وارتداء القفازات وحماية الفم).
   ملاحظة: PFA من الصعب حل لذلك فمن المستحسن أن تفعل ذلك على النحو التالي: ل1 لتر فيكي-فيكس حل 24،2 ز أنابيب و 40 ز PFA في أكواب منفصلة، ​​في كل من (تقريبا المغلي) منزوع الأيونات الماء الساخن. كلا سوف تذوب من خلال إضافة 10 N هيدروكسيد الصوديوم ولكن كن حذرا أن لا تضيف كثيرا. إضافة 51.4 غرام السكروز و1 مل 1 M MgCl ₂ في حل PFA. إضافة محلول أنابيب إلى المزيج الآخرين. ملء ما يصل الى 1 لتر الحجم النهائي وضبط درجة الحموضة إلى الحياد بإضافة هيدروكسيد الصوديوم.
4. حل 10 ملغ / مل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في الماء (تنبيه! ارتداء القفازات). خزن فيالظلام في -20 ° C.

7. بروتوكول لفي المختبر إعادة إعماره من لونين Decondensation

1. تدور بسرعة منخفضة استخراج interphasic لمدة 12 دقيقة في 386،000 x ج في زاوية ثابتة 20 × 0.2 مل أو 355 في 000 x ج في الدوار 10 × 2.0 ملم.
2. بلطف إزالة طبقة الدهن على رأس باستخدام مضخة فراغ أو ماصة واتخاذ طاف (تسمى بعد ذلك استخراج عالية السرعة) تجنب تلوث غشاء من الطبقة السفلية وتجاهل بيليه.
   ملاحظة: للحد من تلوث غشاء الممكن فإنه من المستحسن أن تدور استخراج مرتين أو لتخفيف استخراج مع 20٪ من حجم مع العازلة السكروز قبل الطرد المركزي. ومع ذلك، يمكن تخفيف والخطوات الطرد المركزي إضافية تقلل من نشاط استخراج.
3. الماصة 18 ميكرولتر من ارتفاع استخراج سرعة في أنبوب 1.5 مل رد الفعل، إضافة 0.7 ميكرولتر كتلة الإنقسامية (مبلغ يمكن أن تختلف قليلا وفقا لونين تركيز الأسهم)، 0.5 ميكرولتر الجليكوجين، و 0.5 ميكرولترمزيج الطاقة و 0.3 ميكرولتر DMAP. استخدام النصائح مع فتحة واسعة لخلط رد فعل بأسرع ما يضاف لونين لمنع القص من لونين decondensing.
   ملاحظة: إن رد الفعل لا يمكن أن يؤديها في وجود أو عدم وجود الأغشية (انظر الشكل 3). لdecondense لونين في وجود الأغشية، إضافة 2 ميكرولتر من الأغشية طرحت أعدت وفقا لبروتوكول صفها أيزينهارت وآخرون ¹⁶
4. احتضان خليط التفاعل لمدة تصل إلى 2 ساعة (أو أقل لدراسة نقاط وقت سابق من عملية decondensation) عند 20 درجة مئوية.
5. إصلاح العينة بإضافة الثلج الباردة 0.5 مل فيكي فيكس تحتوي على 0.5٪ غلوتارالدهيد و 0.1 ملغ / مل دابي والحضانة لمدة 20-30 دقيقة على الجليد.
   ملاحظة: إذا كان سيتم كذلك معالجة عينات للالمناعي، وينبغي أن يتم التثبيت دون غلوتارالدهيد لأن ذلك غالبا ما يتداخل مع تلوين الأجسام المضادة. ولكن إذا كان سيتم تحليلها فقط تلطيخ دابي، إضافة تخمةسوف araldehyde الحفاظ على هيكل لونين أجمل.
6. احتضان coverslips جولة (قطر 12 ملم) لمدة 5 دقائق مع بولي-L-يسين حل لزيادة تقارب لل coverslips إلى لونين. تجفيف coverslips على ورق الترشيح بعد ذلك.
7. تجميع أنابيب مسطحة القاع الطرد المركزي (6 مل، 16/55 ملم) عن طريق وضع لل coverslips مع موقع المغلفة إلى الأعلى في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. إضافة 800 ميكرولتر من وسادة السكروز 30٪ وطبقة العينة الثابتة على القمة.
8. تدور لمدة 15 دقيقة في 2500 x ج في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: أنابيب الطرد المركزي مسطحة القاع يصلح لالدوارات التي تتبنى 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية.
9. صب طاف، ثم إزالة لل coverslips من الأنابيب التي كتبها بدس بعناية أسفل أنبوب الطرد المركزي مع 16 G 1 ½ '' حقنة إبرة. لهذا الغرض الشريط غطاء الإبرة والإبرة نفسها معا في قيعان وقطع الأمامية من الغطاء بحيث إبرة العصي حوالي 3ملم بها. عندما يتم رفع ساترة عن طريق إبرة في موقع واحد، استخدام ملاقط لإزالة ساترة.
10. غسل ساترة بسرعة عن طريق غمس في الماء منزوع الأيونات، جففه برفق عن طريق لمس جانبها إلى ورقة الترشيح ووضعه على شريحة المجهر على قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة. ختم ذلك بطلاء الأظافر، الجافة ونضع في الظلام.
    ملاحظة: عينات ثابتة دون غلوتارالدهيد يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 24 لوحة جيدا وتستخدم أيضا لتلوين المناعي. إذا تخزينها لعدة أيام، إضافة 0،05٪ أزيد الصوديوم (تنبيه! ارتداء قفازات) إلى برنامج تلفزيوني لتجنب التلوث بالبكتيريا.
11. تحليل العينات بواسطة المجهر مضان إشارة دابي (باستخدام مثل المجهر متحد البؤر مع ليزر 405 نانومتر).

8. إعداد العازلة للتلوين المناعي في المختبر المعاد لونين Decondensation عينات

1. إعداد برنامج تلفزيوني وفقا ل1.1.1. حل NH ₄ الكلورين لزعنفةتركيز القاعدة على 50 ملي في برنامج تلفزيوني. الحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية. حل 5 ميكروغرام / مل دابي في برنامج تلفزيوني (إعداد طازجة). إضافة 0.1٪ تريتون X-100 لبرنامج تلفزيوني. الحفاظ على 4 درجات مئوية. إعداد عازلة تمنع الطازجة قبل استخدامها عن طريق تمييع 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني + 0.1٪ تريتون X-100.

9. بروتوكول المناعي تلون في المختبر المعاد لونين Decondensation عينات

ملاحظة: إن جميع حضانات التالية لل coverslips في 24 لوحة جيدا مع لا يقل عن 250 حل ميكرولتر لكل بئر، إن لم يكن ينص على خلاف ذلك في المختبر decondensed عينات لونين هي أكثر حساسية من الخلايا الثابتة بالتالي توخي الحذر عند إضافة أو إزالة الحلول. فمن المستحسن استخدام البلاستيك الماصات باستور قطع الزاوي. لغسل الخطوات وحضانة الأجسام المضادة الثانوية وضع لوحة في RT على هزاز أو الدورية منصة، لا يتحرك أسرع من 100 دورة في الدقيقة.

1. إرواء العينات التي يحتضنها ساترةالصورة مع 1 مل NH ₄ الكلورين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. عينات كتلة التي يحتضنها لهم 1ML عازلة تمنع لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. تجميع غرفة الرطوبة للحضانة مع الأجسام المضادة الأولية: ضع النسيج الرطب على الجزء السفلي من مربع محكمة السد وغطاء لوحة 24-جيدا رأسا على عقب على رأس النسيج الرطب. وضع parafilm في غطاء وإضافة 70 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل عينة على parafilm. من أجل حل الأجسام المضادة، وتمييع مصل أو تقارب الأجسام المضادة النقاء 1: 100 في عرقلة العازلة.
3. ضع لل coverslips رأسا على عقب على رأس من الحل الأجسام المضادة واحتضان لهم ل1-2 ساعة. ضع لل coverslips إلى 24 لوحة جيدا مع الجانب عينة تواجه صعودا وغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع 1 مل 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
4. احتضان coverslips لمدة 1 ساعة على RT في 250 ميكرولتر الثانوية الضد الفلورسنت الموسومة المخفف في عرقلة العازلة إلى التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة. يحفظ بعيدا عن الضوء. غسل عبتيمرات ه ه لمدة 10 دقيقة مع 1 مل 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
5. احتضان هذه العينات لمدة 10 دقيقة مع 1ml من 5 ميكروغرام / مل دابي في برنامج تلفزيوني. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 1 مل 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
6. غسل ساترة بسرعة عن طريق غمس في الماء منزوع الأيونات، جففه برفق عن طريق لمس جانبها إلى ورقة الترشيح ووضعه على شريحة المجهر على رأس قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة. ختم ذلك بطلاء الأظافر، وجفاف والحفاظ على 4 درجات مئوية في الظلام حتى استخدامها. تحليل العينات بواسطة المجهر مضان.

النتائج

الاعتماد وقت رد الفعل decondensation

ويبين الشكل 1 دورة الوقت النموذجي للمقايسة decondensation. الكتلة من الكروموزومات واضحة في بداية رد فعل decondenses ويدمج في عملية واحدة، وجولة ونواة سلسة. عندما يتم استبدال استخراج البيض م...

Discussion

القيطم المورق مقتطفات البيض هي أداة مفيدة جدا لإنتاج بأمانة العمليات الخلوية في المختبر، وكان يستخدم هذا النظام بنجاح في توصيف دورة الخلية وانقسام الخلية أحداث ^{2، 3،5،6،17.} ونظرا إلى مخازن كبيرة من المكونات النووية المحجوزة في البيض خلال oogenesis وع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1