A Cell Assay libre d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose

Résumé

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Résumé

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Introduction

Xenopus laevis extrait d'oeuf est un outil puissant et largement appliquée pour étudier les événements cellulaires complexes dans la simplicité d'un essai acellulaire. Depuis leur première description par ^une Lohka & Masui ils ont été largement utilisés pour étudier les processus mitotiques telles que la condensation de la chromatine ^2, l'assemblage de broche ^3, l'enveloppe nucléaire ventilation ^4, mais également transport nucléocytoplasmique ⁵ ou ⁶ replication de l'ADN. Les événements qui se déroulent à la fin de la mitose, nécessaires pour la réforme du noyau interphasique tels que la réforme de l'enveloppe nucléaire et pore nucléaire remontage complexes sont beaucoup moins bien compris par rapport aux événements mitotiques précoces, mais peuvent être étudiées de manière similaire en utilisant Xenopus extrait d'oeufs ^7. Nous avons récemment mis en place un essai basé sur Xenopus extrait d'oeufs d'étudier décondensation de chromatine à la fin de la mitose ^8, un processus de sous-enquête qui attend its caractérisation détaillée.

Chez les métazoaires, la chromatine est fortement condensé à l'entrée en mitose, afin de remplir fidèlement la ségrégation du matériel génétique. Pour garantir que la chromatine est accessible pour l'expression des gènes et la replication de l'ADN pendant l'interphase, il doit être dé-compacté à la fin de la mitose. Chez les vertébrés, la chromatine est jusqu'à cinquante-pli plus compacté lors de la mitose par rapport à l'interphase ^9, contrairement aux levures mitotique où le compactage est généralement beaucoup plus faible, par exemple, seulement deux fois dans S. ¹⁰ cerevisiae. Animal vertébré décondensation de la chromatine a été principalement étudié dans le cadre de la réorganisation de l'ADN de sperme après fécondation des oeufs. Un mécanisme moléculaire, dans laquelle nucléoplasmine, une protéine de l'ovocyte abondante, échange protamines spécifique sperme à histones H2A et H2B stockées dans l'œuf. Ce processus a également été élucidée en utilisant Xenopus extrait d'oeufs ^{11, 12.} Toutefois, l'expressionde nucléoplasmine est limitée à ¹³ ovocytes et la chromatine mitotique ne contient pas ces protamines spécifique sperme. Par conséquent, la décondensation de la chromatine à la fin de la mitose est indépendant nucléoplasmine ^8.

Pour la réaction de décondensation in vitro, nous employons extrait généré à partir activés X. laevis œufs et des grappes de chromatine isolés à partir de cellules HeLa synchronisés. Traitement des œufs avec un ionophore de calcium imite la libération de calcium dans l'ovocyte généré par l'entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation. La vague de calcium déclenche la reprise du cycle cellulaire et de l'œuf, arrêté dans la deuxième métaphase de la méiose, progresse à la première interphase ^14. Par conséquent, les extraits d'œufs préparés forme activée oeufs représentent l'état de sortie / interphase mitotique et sont compétents pour induire des événements spécifiques pour la sortie mitotique comme décondensation de chromatine, enveloppe nucléaire et pores réforme complexe. Pour l'isolement de ch mitotiqueromatin grappes, nous avons utilisé une version légèrement modifiée du protocole publié par Laemmli Gasser et ^15, où les grappes de chromosomes sont libérés par lyse de cellules HeLa en mitose synchronisés et isolés dans des tampons contenant des polyamines par centrifugations à gradient.

Protocole

Cluster mitotique chromatine isolement de cellules HeLa

1. Préparatifs

1. Solutions de culture cellulaire
   1. Préparation du milieu de Eagle modifié par Dulbecco complet (DMEM) en ajoutant 10% de sérum de veau foetal, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 2 mM de glutamine à la DMEM. Préparer une solution saline de tampon phosphate (PBS) contenant 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na ₂ HPO _4, 2H 2 O et 2 mM de KH ₂ PO ₄ dans de l'eau désionisée, et ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 10 N.
      REMARQUE: PBS peut être maintenue aussi 10x solution stock au fil du temps à la température ambiante. Diluer avec de l'eau déminéralisée à 1x avant utilisation. Filtre à nouveau la solution de 1x si elle va être utilisée dans la culture cellulaire.
   2. Préparer un stock de 40 mM de solution de thymidine (culture cellulaire appropriée) dans un milieu DMEM. Dissoudre 0,97 g de thymidine dans 90 ml de milieu DMEM. Ajuster le volume final à 100 ml. Conserver la solution de stock à -20 °C. Dissoudre (ATTENTION! Travailler sous une hotte chimique, porter des gants et un masque de protection) nocodazole à un ml de solution à 5 mg / ml dans le DMSO.
2. Mitotiques Clusters isolement Solutions
   NOTE: Toutes les solutions décrites dans 1.2 doivent être conservés sur la glace après la préparation / décongélation au long de l'ensemble de l'expérience.
   1. L'eau déminéralisée autoclave pendant 105 min à 121 ° C. Dissoudre le tétrachlorhydrate de spermine dans l'autoclave, de l'eau désionisée à une concentration finale de 200 mM (69,6 mg / ml). Magasin solution stock à -20 ° C. Dissoudre trichlorhydrate de spermidine dans l'autoclave, de l'eau désionisée à une concentration finale de 200 mM (50,8 mg / ml). Magasin solution stock à -20 ° C.
   2. Préparer 5% (p / v) digitonine (ATTENTION! Travailler sous hotte chimique, porter des gants et un masque de protection) dans de l'eau déminéralisée chaude. Filtrer et conserver des aliquotes à -20 ° C. Dissoudre le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) (ATTENTION! Travailler under hotte chimique, porter des gants et un masque de protection) à une concentration finale de 200 mm (35 mg / ml) dans 100% d'éthanol. Magasin solution stock à -20 ° C.
   3. Dissoudre dithiothréitol (DTT) avec de l'eau déminéralisée à une concentration finale de 1 M (154 mg / ml) (ATTENTION! Travailler sous une hotte chimique, porter des gants). Solution de filtre et les stocks en magasin à -20 ° C.
   4. Préparer une 100 fois inhibiteur de la protéase mélange (ATTENTION travailler sous hotte chimique, gants porter!) Par dissolution de 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml de leupeptine, 0,1 mg / ml de pepstatine et 0,2 mg / ml d'aprotinine dans l'eau désionisée. Magasin solution stock à -20 ° C.
   5. Préparer une solution 10x stock de tampon A contenant 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM de KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM tétrachlorhydrate de spermine et 5 mM de spermidine trichlorhydrate. Un magasin tampon à 4 ° C sans tétrachlorhydrate de spermine et la spermidine trichlorhydrate, qui devrait être ajoutéfraîchement juste avant utilisation.
      REMARQUE: EDTA dissout seulement à des pH supérieur à 8, par conséquent, de préparer un concentré EDTA-KOH solution stock élevé (0,5 M recommandé), ajouter 5 N KOH à pH juste au-dessus de 8 à dissoudre. Ensuite titrer jusqu'à pH 7,4.
   6. Préparer une solution 20x boursier de tampon comme contenant 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), KCl 400 mM, 400 mM d'EDTA-KOH (pH 7,4) et 5 mM de spermidine trichlorhydrate. Comme tampon peut être stocké dans les mêmes conditions que le tampon A.
      NOTE: Préparer les solutions de travail I à IV (voir dans les étapes suivantes), le gradient de glycérol et les solutions de particules de silice colloïdale contenant des particules de silice (15 à 30 nm de diamètre) revêtues de polyvinylpyrrolidone non-dialysable (PVP) fraîchement juste avant l'isolement procédure (PMSF et digitonine devraient être ajoutés directement avant l'utilisation comme PMSF est labile dans des solutions aqueuses et a tendance à précipiter de la digitonine à stockage à long terme sur de la glace).
   7. Préparer 100 ml d'une solution 0,5 x I par addition d'un tampon A,DTT 1 mM, 1: 100 de l'inhibiteur de protease mélange et PMSF 0,1 mM dans l'autoclave, l'eau désionisée. Préparer 50 ml de solution II (pour la lyse des cellules) en ajoutant 1 x tampon A, DTT 1 mM, 1: 100 de l'inhibiteur de protease mélange, PMSF 0,1 mM, 0,1% de digitonine et 10% de glycerol dans l'autoclave, l'eau désionisée.
   8. Préparer 200 ml d'une solution contenant un tampon III A de 0,25x, DTT 1 mM, 1: 100 de l'inhibiteur de protease mélange, PMSF 0,1 mM et 0,05% de digitonine dans l'autoclave, l'eau désionisée. Préparer 40 ml de solution tampon contenant IV 1x As, DTT 1 mM, 1: 100 de l'inhibiteur de protease mélange, 0,1 mM de PMSF et 0,1% de digitonine dans l'autoclave, l'eau désionisée.
   9. Préparer 120 ml d'une solution de gradient de glycerol par addition de 25% de glycerol et 0,1% de digitonine pour solution I.
   10. Préparer 150 ml d'colloïdale solution de particules de silice contenant 60% v / v (volume par volume) d'une suspension contenant des particules de silice (diamètre 15 à 30 nm) revêtues de polyvinylpyrrolidone non-dialysable (PVP), 15% de glycerol, 2 mM depermidine trichlorhydrate et 0,8 mM spermine tétrachlorhydrate en solution IV.
   11. Préparer du tampon de stockage de la grappe contenant 250 mM de saccharose, 15 mM de Hepes (pH 7,4), 0,5 mM de spermidine trichlorhydrate, 0,2 mM de spermine tétrachlorhydrate, 1: 100 de l'inhibiteur de protease mélange, 0,3% de BSA et 30% de glycerol. Le tampon de stockage du cluster peut être conservé à -20 ° C.
   12. Préparer la solution de correction de squash contenant 10% de formaldéhyde (ATTENTION! Travailler sous une hotte chimique, porter des gants), 50% de glycérol, de deux types: le tampon de Ringer modifiée de Mark (ROR voir 4.5.) Et 0,2 pg / ml DAPI (ATTENTION! Porter des gants). Conserver à 4 ° C dans des tubes à réaction légers protégé. Il est pas crucial pour l'expérience d'utiliser cette courge correctif recette, recettes alternatives fonctionnera également.

2. La synchronisation des cellules

1. Le Jour 1: Seed cellules HeLa sur cinq 75 cm ² (250 ml) flacons avec les médias et à incuber à 37 ° C dans 5% CO _2.
   NOTE: Ce sera donné dans environ 18 x 10 ⁶ cellules au jour de l'isolement de la grappe de la chromatine.
2. Le jour 2: Lorsque les cellules sont au moins 50% de confluence (environ la moitié de la surface est recouverte par les cellules et il ya encore de la place pour les cellules à croître), ajouter la thymidine à une concentration finale de 2 mM (bloc de thymidine) et des cellules de culture pour 24 h à 37 ° C dans _5% de CO2.
   NOTE: Ce sera d'arrêter les cellules à la G1 / S phase de frontière.
3. Le Jour 3: Aspirer le milieu contenant de la thymidine et ajouter du PBS stérile. Laver les cellules par un rinçage délicat avec PBS stérile. Aspirer le PBS et ajouter doucement 15-20 ml de cellules de moyennes et culture fraîches, chaudes DMEM complet pendant 3 à 4 heures à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pour les libérer du bloc G1 / S-phase.
4. Au jour 3 (suite): Après avoir libéré les cellules du bloc G1 / S en phase, ajouter nocodazole à une concentration finale de 100 ng / ml. Diluer nocodazole en ajoutant 2 pi de solution de stock (5 mg / ml) à 98ul de milieu DMEM frais, et ajouter 1 pl de nocodazole dilué par ml de culture cellulaire. Des cellules de culture pour environ 12 heures à 37 ° C dans _5% de CO2. Ceci va bloquer les cellules en mitose.

3. Mitotiques Clusters Isolement

1. Le jour 4: Isoler grappes mitose. En utilisant une microscopie sur fond clair, vérifier si la majorité des cellules sont mitotique. Si moins de 50% des cellules sont mitotique attente jusqu'à ce que les cellules atteignent plus de mitose. Recueillir les cellules mitotiques en tapant énergiquement sur le côté de la fiole (ou par pulvérisation avec la pipette doucement), cela va détacher les cellules mitotiques restantes. Transférer la suspension cellulaire à 50 ml tubes à centrifuger coniques.
   REMARQUE: Les cellules mitotiques deviennent ronde et peut facilement être enlevé du fond du flacon (tout comme les cellules après traitement à la trypsine), contrairement aux cellules dans d'autres stades du cycle cellulaire, qui sont plates et fermement attaché au ballon.
2. Récolter les cellules en mitose en faisant tourner les tubes à 1500 g pendant 10 min (476; ou C RT) et élimination du surnageant par la suite. Reprendre le culot cellulaire dans 8 ml de PBS, piscine dans un 50 ml tube de centrifugeuse conique, remplir le tube complètement avec PBS et tourner à nouveau pendant 10 min à 1500 x g. Répéter ce procédé de lavage à trois reprises au total.
3. A partir de maintenant effectuer toutes les étapes sur la glace avec des solutions froides. Vigoureusement remettre le culot dans 37 ml de solution froide II. Transférer la suspension à un froid 40 ml homogénéiseur verre-verre en utilisant une pipette de 25 ml et lyse des cellules sur la glace par douncing avec un pilon serré jusqu'à grappes mitotiques sont exempts d'cytoplasmique. Le nombre de coups est très dépendante sur le stock digitonine et peut varier de 3 à 20 fois.
   Remarque: Une homogénéisation peut être assez vigoureuse, mais doit être considérée comme complète quand presque toutes les cellules en mitose sont lysées et les grappes sont considérés comme exempts de matières cytoplasmique (voir 3.4).
4. Après quelques coups mélanger 5-10 ul de la suspension cellulaire 1: 2 au bleu Trypan et vérifier par MICRoscopy dans une chambre de Neubauer. Chromatine Lorsque les cellules sont lysées est coloré bleu et gratuitement des membranes cellulaires (NOTE: possibles restes cytoplasmiques seront accumuler autour de la chromatine teinté bleu et seront faciles à distinguer).
   REMARQUE: Les cellules mitotiques lyseront avant que les cellules interphasiques mais néanmoins faire attention de ne pas exagérer l'homogénéisation afin d'éviter la contamination par des noyaux interphasiques et chromatine mutilé.
5. La couche immédiatement l'ensemble du lysat de cellules sur des gradients étages froids (avec 5 ml d'colloïdale solution de particules de silice de 60% à la base, recouvert par 19,5 ml d'une solution de gradient de glycerol chaque) dans cinq tubes de centrifugation en polycarbonate (28,8 x 107,0 mm, il est recommandé de placer les tubes sur de la glace avant de les refroidir) en utilisant une pipette de 10 ml. Ne pas laisser les cellules dans la solution II pendant une longue période, par conséquent il est recommandé de préparer les tubes et le gradient au préalable (par exemple, au cours des étapes de lavage).
6. Centrifuger les gradients de 30 min à 1000 g à 4 ° C dans un rotor à angle fixe.
   REMARQUE: Les noyaux, les cellules non lysées et les grappes sont récupérés ensemble à l'interface entre le glycérol et les particules colloïdales de silice couches.
7. Retirez le liquide au-dessus de l'interphase aide d'une pipette et transférer le reste à l'homogénéisation froid. Mélange Re-homogénéiser par 3-15 coups (à nouveau en fonction de la digitonine stock) avec le pilon serré pour éliminer les agrégats et pour enlever les fibres du cytosquelette des grappes. Après chaque couple de coups de vérifier l'efficacité de l'homogénéisation. Mélanger 1 pl de l'échantillon avec 1 pl de la courge correctif complété avec DAPI et d'examiner sous le microscope à fluorescence.
   REMARQUE: Le nombre de coups est crucial, la présence de la grappe regroupe des moyens, que le nombre de coups est insuffisante, tandis que la chromatine mutilé et les débris noyaux indiquent que l'homogénéisation était trop forte.
8. Distribuer la solution parmi les quatre nouveaux tubes polycarbonate de centrifugation (28,8 x107,0 mm) (10 ml de solution environ. Par tube) et les remplir complètement avec 60% de solution de particules de silice colloïdale (env. 30 ml de solution colloïdale de particules de silice par tube).
   REMARQUE: éviter de surcharger le colloïdale des particules de silice gradient depuis grappes peuvent facilement être piégés si il ya trop de débris cytoplasmique dans le dégradé.
9. Spin pendant 5 min à 3000 x g, puis 30 min à 45 440 xg à 4 ° C dans un rotor à angle fixe.
   NOTE: Comme précédemment, les noyaux interphasiques seront gardés d'entrer dans le gradient (si homogénéisation n'a pas été fait trop lourdement qui libère noyaux des débris cytoplasmique), mais les grappes accumule environ 1,5 cm du fond du tube, souvent comme un ballon perdu.
10. Retirer le liquide au-dessus des clusters à l'aide d'une pipette, piscine le reste dans un tube, remettre en suspension bien et les redistribuer aux deux tubes de centrifugation en polycarbonate (28,8 x 107,0 mm). Diluer la suspension de cluster 1: 4 avec une solution III dans chaque tube et bien mélanger. Mark èmee site ont le culot sera et tourner 1.000 g pendant 15 min à 4 ° C dans un rotor à angle fixe.
11. Remettre en suspension les pastilles en solution III, commun dans un 50 ml tube conique de centrifugeuse et remplir avec Solution III. Centrifuger à seulement 300 g pendant 10 min environ. Ne pas centrifuger à vitesse plus élevée - il pourrait provoquer une agrégation irréversible de grappes.
12. Laver ensuite avec Solution III en 1,5 ou 2 ml tubes de réaction (remettre en suspension les boulettes et remplir les tubes complètement) et centrifuger à 300 x g. Retirer soigneusement le surnageant avec une pipette. Resuspendre le culot attentivement dans 250 tampon de stockage du cluster pi (si vous avez plusieurs pastilles utilisent 250 pi pour tous ensemble et mettent en commun entre eux). Diluer 5-10 ul de l'échantillon 1: 2 au bleu Trypan et compter dans la chambre de Neubauer. Si applicable plus dilué pour obtenir une concentration approximative de 500 grappes / ul.
13. Poussez la suspension à travers un tamis cellulaire 100 um pour veillez à retirer l'agrégation de clusters résultant de la remise en suspension abusive. Les grappes peuvent être stockés pendant des mois dans -80 ° C. Pour éviter regel multiples font aliquotes appropriées et enclenchez gel dans de l'azote liquide.

4. Préparation de tampon pour interphasique Xenopus laevis extrait d'oeufs

REMARQUE: Xenopus laevis grenouilles sont maintenus et traités en conformité avec les directives et règlements établis par la Convention du Conseil de l'Europe sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres (UE a ratifié en 1998) et la loi allemande relative à l'utilisation d'animaux dans la recherche de vertébrés.

1. Préparer DTT et un mélange d'inhibiteurs de protease de 100 fois selon 1.2.3 et 1.2.4. Dissoudre cytochalasine B à une concentration finale de 10 mg / ml dans le DMSO, aliquote (10 ou 20 pi recommandé) et conserver à -20 ° C.
2. Dissoudre la cycloheximide à une concentration finale de 20 mg / ml dans l'éthanol, l'aliquote (500 ulrecommandé) et conserver à -20 ° C. Dissoudre l'ionophore de calcium A23187 à une concentration finale de 2 mg / ml dans de l'éthanol, aliquote et conserver à -20 ° C.
   REMARQUE: PI, la TNT, la cytochalasine B, cycloheximide et A23187 peuvent être congelés et décongelés plusieurs reprises.
3. Préparer 20x tampon de Ringer modifiée Mark (MMR) contenant 2 M de NaCl, 40 mM de KCl, 20 _mM de MgCl2, 40 mM de CaCl _2, 2 mM d'EDTA et 100 mM de Hepes, ajuster le pH à 8,0 avec du KOH 5 N.
   NOTE: La 20x ROR peut être conservé plus longtemps à la température ambiante. Selon les quantités d'oeufs, pour une préparation d'extrait d'oeufs interphasique 1 L de 1x MMR par grenouille injecté et un 5-10 litres supplémentaires pour les étapes de lavage sont nécessaires. Re-ajuster le pH de 1x MMR à 8,0 avec KOH 5N. 1x MMR prêt à garder les grenouilles dans O / N x 1 doit être à température ambiante. 1x MMR préparé pour la préparation d'extrait doit être conservé au froid jusqu'à ce qu'il soit utilisé, mais il est pas cruciale pour l'expérience que l'1x MMR est vraiment froid.
4. Préparer 1 L de Sucun tampon contenant 250 mM de saccharose, 50 mM de KCl, 2,5 _mM de MgCl2 et 10 mM de Hepes pH 7,5 rose. Tampon saccharose doit être préparé la veille avec de l'eau stérile et doit être conservé à 4 ° C.
5. Préparer la solution de dejellying fraîchement le matin de l'expérience en dissolvant 2% de L-cystéine dans 0.25x ROR. Ajuster le pH à 7,8 avec du KOH 5 N. Conserver à 4 ° C jusqu'à son utilisation.

Extract laevis Egg 5. Protocolfor interphasique Xenopu

1. Injecter 120 IE gonadotrophine de sérum de jument gravide (PMSG) dans le sac dorsal de la lymphe de chaque grenouille 3-10 jours avant l'expérience (5 ml seringues, 27 G ¾ '' aiguilles).
   NOTE: Cette injection va induire l'ovulation. La quantité d'oeufs de grenouille établit un varie beaucoup. Une grenouille bien portant peut produire des oeufs occupant un volume de jusqu'à 7 ml après avoir été dé-jellynated qui correspond à un maximum de 3,5 ml d'extrait brut. Toutefois, certains considèrent que les grenouilles pourraient ne pas jeter ou de volonté laœufs pourris y.
2. Injecter 500 IE gonadotrophine chorionique humaine (hCG) par la grenouille du soir avant l'expérience (5 ml seringues, 27G ¾ '' aiguilles). Cela va induire la libération des œufs. Gardez les grenouilles pour les 13-17 heures à 18 ° C dans les réservoirs individuels contenant 1,2 l 1x ROR (pH 8).
3. Ramassez les œufs en les versant dans 600-1000 ml béchers de verre.
   REMARQUE: Prenez seulement les bons lots d'œufs qui sont pondus individuellement, de taille similaire et clairement pigmentés avec un sombre et un demi de couleur claire. Ne prenez pas les œufs qui forment des chaînes ou ce regard bouffi et blanc. Ceux-ci devraient être triés toute la procédure en utilisant une pipette Pasteur en plastique. Pour une description détaillée du bien contre le mal oeufs voir Gillespie et al. ⁶
4. Lavez les œufs intensive, environ 4 fois, avec 1x MMR par décantation le surnageant lorsque les oeufs sont installés et le remplissage le bécher avec un tampon frais par la suite.
   NOTE: Leœufs sont stables avant qu'elles ne soient dejellynated et le tampon de lavage peuvent être appliqués directement sur les oeufs.
5. Dejellynate les oeufs en incubation dans la solution de cysteine ​​à 2%. Changer tampon une fois après 2-4 min par décantation et le remplissage de la mémoire tampon attentivement le bécher avec un tampon frais. Considerdejellying terminé lorsque le volume des oeufs diminue considérablement et les œufs deviennent plus denses.
   NOTE: Le dejellying besoin d'environ 5-7 min et doit être arrêtée lorsque visible, mais plus tard après 10 min.
6. Lavez les œufs environ 4 fois avec 1x MMR par décantation et le remplissage du surnageant tampon.
   REMARQUE: Les œufs sont plus fragiles après avoir été dejellynated et, par conséquent, les étapes de lavage doivent être fait avec plus de soin. Le vaccin RRO devrait être plutôt rincé sur le mur du bêcher au lieu de directement sur les œufs.
7. Activer œufs dans 100 ml 1x MMR en ajoutant 8 pi de l'ionophore de calcium (2 mg / ml dans de l'éthanol). Arrêtez activation lorsque le capuchon animale contraction êtrevient visible ou après 10 min.
   NOTE: Le cap des animaux contraction peut être identifié par le compactage de la moitié noire de l'œuf.
8. Laver soigneusement 4 fois avec 1x MMR par décantation et le surnageant remplissage de la mémoire tampon.
9. Incuber les oeufs pendant 20 min à 1x MMR à la température ambiante.
10. Préparer des tubes de centrifugation au cours de la durée d'incubation: La place 50 ul de tampon de saccharose, 50 ul de 100 fois mélange d'inhibiteurs de protease, 5 ul de 1 M DTT, 12,5 pi de cycloheximide (à empêcher la traduction, en particulier de la cycline B) et 2,5 pi de la cytochalasine B (à empêcher polymérisation de l'actine) dans 5 ml de tubes de centrifugation (13 x 51 mm). Sinon, pour plus de 30 ml d'oeufs, 14 ml tubes (14 x 95 mm) peuvent être utilisés, dans ce cas augmenter les volumes de 2,4 fois.
11. Lavez les œufs deux fois avec du tampon froid saccharose (décantation et le tampon de recharge dans le récipient en verre) et de les transférer dans des tubes de centrifugation à l'aide d'une pipette de Pasteur en plastique avec une large ouverture (couper l'extrémité étroite).
12. Packœufs par filage pendant 1 min à 130 x g. Placer les tubes dans 15 ml de centrifugation coniques des tubes à cet effet (14 ml mettre les tubes dans 50 ml de centrifugation coniques tubes, respectivement). Le but est d'enlever autant de tampon que possible pour éviter la dilution de l'extrait. Après centrifugation, enlever l'excès de tampon en utilisant une pipette Pasteur en plastique et finalement combler plus d'oeufs sur le dessus.
13. Spin dans un 6 x 5 ml balancer rotor pendant 20 min à 21 000 g à 4 ° C.
14. Retirer extrait à basse vitesse à l'aide d'une seringue de 5 ml avec un 16 1 G ½ '' aiguille, entre le jaune et jaune au-dessus de l'oeuf cassé débris dans le fond sombre. A cet effet, pousser l'aiguille de seringue à travers la paroi du tube de centrifugation au-dessus de la couche de débris d'oeuf cassé au fond. Tenir le tube contre une résistance lors de la poussée avec l'aiguille.
    NOTE: A 5 ml tube de centrifugation rempli donne entre 1,8-2,5 ml d'extrait.
15. Pour 1 ml de l'extrait ajouter 10 ul de 100 fois inhibiteur de protéase, 1 ul de mélangede 1 M de DTT, 2,5 ul de cycloheximide (20 mg / ml) et 0,5 pi de la cytochalasine B (10 mg / ml). Gardez l'extrait sur la glace.
    NOTE: L'extrait peut être soit utilisée directement pour l'expérience ou aliquotée, snap congelés et conservés dans l'azote liquide pendant plusieurs mois. Congélation l'extrait va diminuer son activité. Pour les expériences délicates comme immunodéplétion il est fortement recommandé d'utiliser l'extrait frais immédiatement.

6. Préparation de tampons pour In Vitro Reconstitution de décondensation de chromatine

1. Préparer la solution mix énergétique de réserve contenant 25 mM d'ATP, GTP 25 mM, 127,5 mg / ml créatine phosphate et 2,5 mg / ml créatine kinase dans un tampon contenant 250 mM de saccharose, Hepes 1,2 mM, KCl 5,9 et 0,3 _mM de MgCl2. Aliquoter et conserver à -80 ° C. Utilisez fraîchement après décongélation, ne pas recongeler.
2. Dissoudre 0,2 g / ml glycogène dans de l'eau déminéralisée. Conserver à -20 ° C. Dissoudre aminopurine 6-diméthyl (DMAP) à une concentration finalede 0,25 M dans du DMSO. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Utilisez fraîchement après décongélation, ne pas recongeler.
3. Préparer 30% (p / v) de saccharose dans du PBS, filtrer et conserver à 4 ° C. Préparer la solution de VikiFix 4% contenant 80 mM PIPES pH 6,8, _MgCl2 1 mM, 150 mM de saccharose et de 4% de paraformaldéhyde (PFA) (ATTENTION! Travailler sous une hotte chimique, porter des gants et un masque de protection).
   NOTE: Le PFA est difficile à dissoudre par conséquent, il est recommandé de le faire de la manière suivante: Pour 1 l Viki-Fix dissoudre 24,2 g tuyaux et 40 g PFA dans des béchers distincts, à la fois dans (presque bouillante) de l'eau déminéralisée chaude. Les deux se dissoudra par addition de NaOH 10 N, mais attention à ne pas ajouter trop. Ajouter 51,4 ​​g de saccharose et 1 ml 1 M _MgCl2 à la solution PFA. Ajouter la solution de tuyaux pour l'autre mélange. Remplir jusqu'à 1 l de volume finale et ajuster le pH neutre par addition de NaOH.
4. Dissoudre 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans l'eau (ATTENTION! Porter des gants). Conserver dansl'obscurité à -20 ° C.

7. Protocole pour In Vitro Reconstitution de décondensation de chromatine

1. Spin basse vitesse extrait interphase pendant 12 min à 386 000 xg dans un angle fixe de 20 x 0,2 ml ou à 355 000 xg dans un rotor 10 x 2,0 ml.
2. Retirez délicatement la couche lipidique sur le dessus en utilisant une pompe à vide ou d'une pipette et prendre le surnageant (ci-après appelé extrait à grande vitesse) à éviter toute contamination de la membrane de la couche de fond et jeter le culot.
   REMARQUE: Pour réduire la contamination de la membrane possible, il est conseillé de tourner l'extrait deux fois ou pour diluer l'extrait avec 20% du volume avec le tampon de saccharose avant la centrifugation. Cependant, la dilution et les étapes de centrifugation supplémentaires peuvent réduire l'activité de l'extrait.
3. Pipet 18 ul d'extrait à grande vitesse dans un tube de 1,5 ml de réaction, ajouter 0,7 pi pôle mitotique (montant peut être légèrement varier en fonction de la chromatine concentration stock), 0,5 pi glycogène, 0,5 pimix énergétique et 0,3 DMAP ul. Utilisez des conseils avec une large ouverture de mélanger la réaction dès que la chromatine est ajouté pour empêcher le cisaillement de la chromatine decondensing.
   REMARQUE: La réaction peut être effectuée en présence ou en l'absence de membranes (voir figure 3). Pour decondense chromatine en présence de membranes, ajouter 2 ul de membranes flottaient préparés selon le protocole décrit par Eisenhardt et al. ¹⁶
4. Incuber le mélange réactionnel jusqu'à 2 heures (ou moins d'étudier des points de temps antérieurs du processus de décondensation) à 20 ° C.
5. Fixer l'échantillon en ajoutant de la glace froide 0,5 ml Viki-Fix contenant 0,5% de glutaraldéhyde et 0,1 mg / ml DAPI et incubation pendant 20-30 min sur la glace.
   NOTE: Si les échantillons seront ensuite traitées pour immunofluorescence, la fixation doit être fait sans glutaraldéhyde comme cela interfère souvent avec la coloration d'anticorps. Toutefois, si seule la coloration DAPI sera analysée, l'ajout de surabondancearaldehyde permettra de préserver une structure de la chromatine plus agréable.
6. Incuber lamelles couvre-objet rondes (diamètre 12 mm) pendant 5 minutes avec une solution de lysine poly-L-pour augmenter l'affinité des lamelles couvre-objet de la chromatine. Sécher les lamelles sur un papier filtre après.
7. Assembler des tubes de centrifugation à fond plat (6 ml, 16/55 mm) en mettant les lamelles couvre-objet avec le site revêtue vers le haut sur le fond du tube de centrifugation. Ajouter 800 ul du coussin de saccharose à 30% et la couche de l'échantillon fixe sur le dessus.
8. Spin pendant 15 min à 2500 g à 4 ° C.
   REMARQUE: Les tubes de centrifugation à fond plat aptes à rotors qui adoptent 15 ml tubes de centrifugation coniques.
9. Décanter le surnageant, puis retirer les lamelles des tubes en enfonçant soigneusement le fond du tube de centrifugation avec un 16 G 1 ½ '' de l'aiguille de la seringue. A cet effet, la bande de couvercle de l'aiguille et l'aiguille elle-même au niveau de leurs fonds et couper l'extrémité avant du couvercle de sorte que l'aiguille se colle sur 3en mm. Lorsque la lamelle est soulevée par l'aiguille sur un site, utilisez une pince à épiler pour enlever la lamelle.
10. Laver la lamelle rapidement en le plongeant dans de l'eau déminéralisée, sécher doucement en touchant son côté à un papier filtre et le placer sur la lame de microscope sur une goutte de milieu de montage. Sceller avec du vernis à ongles, sec et garder dans l'obscurité.
    Note: Les échantillons fixes sans glutaraldéhyde peuvent être stockés dans du PBS dans une plaque de 24 puits et de nouveau utilisée pour immunofluorescence. Si elles sont stockées pendant plusieurs jours, ajouter 0,05% d'azoture de sodium (ATTENTION! Porter des gants) à la PBS pour éviter la contamination par des bactéries.
11. L'analyse des échantillons par microscopie de fluorescence du signal DAPI (en utilisant par exemple un microscope confocal avec un laser 405 nm).

8. Préparation de tampon pour immunofluorescence de reconstitués in vitro échantillons décondensation de chromatine

1. Préparation selon la PBS 1.1.1. Dissoudre NH _{4 Cl} à une final concentration de 50 mM dans du PBS. Conserver cette solution à 4 ° C. Dissoudre 5 ug / ml de DAPI dans de la PBS (fraîchement préparer). Ajouter 0,1% de Triton X-100 à PBS. Conserver à 4 ° C. Préparer du tampon de blocage fraîchement avant l'utilisation par dilution de 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS + 0,1% de Triton X-100.

9. Protocole pour immunofluorescence de reconstitués in vitro échantillons décondensation de chromatine

NOTE:. Toutes les incubations suivantes des lamelles sont faites dans une plaque de 24 puits avec au moins 250 solution par puits, sauf indication contraire in vitro décondensés échantillons de chromatine sont plus sensibles que les cellules fixes donc être prudent lors de l'ajout ou la suppression des solutions. Il est recommandé d'utiliser des pipettes de Pasteur en plastique couper angulaire. Pour les étapes de lavage et d'incubation d'anticorps secondaire placer la plaque à la température ambiante sur la bascule ou de plate-forme tournante, se déplaçant pas à plus de 100 rpm.

1. Étancher échantillons en incubant lamelles avec 1 ml _de NH 4 Cl dans du PBS pendant 5 min. Des échantillons de bloc en les incubant avec 1 ml de tampon de blocage pendant au moins 30 min.
2. Assembler une chambre d'humidité pour l'incubation avec l'anticorps primaire: Mettez un tissu humide sur le fond d'une boîte refermable et le couvercle de la plaque de 24 puits à l'envers sur le dessus du tissu humide. Placer parafilm dans le couvercle et ajouter 70 ul de la solution d'anticorps par échantillon sur le parafilm. Pour la solution d'anticorps, diluer antisérum ou des anticorps purifiés par affinité de 1: 100 dans du tampon de blocage.
3. Placer les lamelles couvre-objet à l'envers au-dessus de la solution d'anticorps et incuber pendant 1 à 2 heures. Placez les lamelles de retour à la plaque de 24 puits avec le côté de l'échantillon vers le haut et se laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes avec 1 ml 0,1% de Triton X-100 dans du PBS.
4. Incuber lamelles couvre-objet pour une heure à température ambiante dans 250 marqués par fluorescence anticorps secondaire dilué ul dans du tampon de blocage à une concentration recommandée par le fabricant. Protéger de la lumière. Laver Three fois pendant 10 minutes avec 1 ml de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS.
5. Incuber les échantillons pendant 10 minutes avec 1 ml de 5 pg / ml de DAPI dans de la PBS. Laver trois fois pendant 5 minutes avec 1 ml de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS.
6. Laver la lamelle rapidement en le plongeant dans de l'eau déminéralisée, sécher doucement en touchant son côté à un papier filtre et le placer sur la lame de microscope sur le dessus d'une goutte de milieu de montage. Sceller avec du vernis à ongles, sec et garder à 4 ° C dans l'obscurité jusqu'à utilisation. Analyser les échantillons par microscopie à fluorescence.

Résultats

La dépendance du temps de la réaction de décondensation

La figure 1 montre une évolution dans le temps typique de l'analyse de décondensation. Le groupe de chromosomes visibles au début de la réaction decondenses et fusionne en un seul, ronde et lisse noyau. Quand l'extrait d'œuf est remplacé par un tampon saccharose de la grappe reste chromosome condensé, ce qui suggère que l'activité de décondensation est présente dans l'extrait d'œuf...

Discussion

Xenopus laevis extraits d'œufs sont un outil très utile pour reproduire fidèlement les processus cellulaires in vitro, et ce système a été utilisé avec succès dans la caractérisation des événements du cycle cellulaire et la division cellulaire ^{2, 3,5,6,17.} En raison de grands magasins de composants nucléaires séquestrés dans l'œuf cours de l'ovogenèse, extraits d'œufs sont une excellente source de composants cellulaires. Comparé à d'autres ap...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1