셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

요약

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

초록

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

서문

Xenopus의 laevis의 달걀 추출물은 무 세포 분석의 단순 복잡한 세포 이벤트를 연구하는 강력하고 광범위하게 적용되는 도구입니다. Lohka & Masui ^1에 의해 처음으로 설명하기 때문에 그들은 광범위하게 같은 염색질 응축 ^2, 스핀들 조립 ^3, 핵 봉투 고장 ^4뿐만 아니라 nucleocytoplasmic 전송 ⁵ DNA 복제 ⁽⁶⁾ 등의 유사 분열 과정을 연구하는 데 사용되었다. 핵 봉투 개혁과 핵 기공 복잡한 재 조립 등의 interphasic 핵의 개혁에 필요한 유사 분열의 끝에서 발생하는 이벤트는, 초기 유사 분열 이벤트에 비해 이해 훨씬 덜하지만 유사 Xenopus의 계란 추출물 ^(7)를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 우리는 최근에 유사 분열 ^(8)의 끝에서 염색질 decondensation을 연구하기 위해 Xenopus의 계란 추출물을 기반으로 분석을 설립, 언더 조사 과정은 내가 기다리고 그자세한 특성의 TS.

후생 동물에서 염색질은 높은 유전 물질의 분리를 충실히 수행하기 위해 유사 분열 진입 집광된다. 염색질은 간기 동안 유전자 발현과 DNA 복제를 위해 액세스 할 수 있는지 확인하기 위하여, 유사 분열의 끝에서 압축 해제 될 필요가있다. 척추 동물에서, 염색질은 최대 유사 분열 다짐 보통 훨씬 ​​낮은 효모 달리, S. 예에서, 단지 두 배 계면 ^(9)에 비해 유사 분열 동안 더 괴성 오십 배이며 cerevisiae의 ^10. 척추 염색질 decondensation은 대부분 계란 수정 후 정자의 DNA 구조 조정의 맥락에서 연구되어왔다. 분자 메커니즘은 어떤 nucleoplasmin, 풍부한 난자 단백질, 계란에 저장 히스톤의 H2A와 H2B에 정자 별 프로타민을 교환한다. 이 과정은 또한 Xenopus의 계란 추출물 ^{11, 12를} 이용하여 규명 하였다. 그러나, 발현nucleoplasmin의이 정자 별 프로타민을 포함하지 않는 난 모세포 ^(13)과 유사 분열 염색질로 제한됩니다. 따라서 유사 분열의 끝에서 decondensation을 염색질 ^{8 개의} 독립적 인 nucleoplasmin입니다.

체외 decondensation 반응을 위해 우리는 동기화 된 HeLa 세포에서 분리 된 활성화 된 X를 laevis의 달걀과 염색질 클러스터에서 발생 추출물을 사용합니다. 칼슘 이온 운반체와 계란의 치료는 수정시 정자의 항목에 의해 생성 된 난자에 칼슘 방출을 모방. 칼슘 웨이브 제 상간 ^14로 이행, 감수 분열의 중기 제 체포 세포주기 재개와 달걀을 트리거한다. 따라서, 양식 활성화 계란 준비 계란 추출물은 유사 분열 출구 / 계면 상태를 나타내고 염색질 decondensation, 핵 봉투와 같은 유사 분열 종료에 대한 특정 이벤트를 유도 할 능력이 복잡한 개혁 기공. 유사 분열 채널의 분리를위한클러스터 romatin 우리는 염색체 클러스터가 헬라 세포 유사 분열에 동기화 및 그라데이션 회 원심에 의해 폴리아민 포함하는 버퍼에 격리에서 용해에 의해 방출된다 가세 & 램 믈리 ^{15 일} 발표 한 프로토콜의 약간 수정 된 버전을 사용했다.

프로토콜

HeLa 세포에서 유사 분열 염색질 클러스터 격리

1. 준비

1. 세포 배양 솔루션
   1. DMEM에 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민을 추가하여 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)를 준비한다. 2.7 밀리미터의 KCl, 137 mM의 염화나트륨, 10 mM의 나 ₂ 2H ₂ O HPO _4, 10 N NaOH로 7.4 2 mM의 KH ₂ 탈 이온수 PO _4, 조정의 pH를 포함하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다.
      주 : PBS 실온에서 10 배 이상의 시간 원액으로 유지 될 수있다. 사용하기 전에 배로 탈 이온수로 희석. 이 세포 배양에 사용되는 경우, 다시 1X 용액 필터.
   2. DMEM 배지에서 티미 딘 용액 (적절한 세포 배양)의 40 mM의 주식을 준비합니다. DMEM 배지 90 ml의 0.97 G의 티미 딘을 녹인다. 100 ㎖에 최종 볼륨을 조정합니다. -20 °에서 보관 원액C.는 (!주의 화학 후드에서 작동, 장갑, 입 보호 착용) 용해 DMSO에 5 ㎎ / ㎖ 원액에 nocodazole을.
2. 유사 분열 클러스터 절연 솔루션
   참고 : 1.2에 설명 된 모든 솔루션은 전체 실험을하는 동안 준비 / 해동 후 얼음에 보관해야합니다.
   1. 121 ℃에서 105 분 동안 오토 클레이브 탈 이온수. 200 밀리미터 (69.6 ㎎ / ㎖)을 최종 농도로 멸균, 탈 이온수의 tetrahydrochloride 페르 민을 녹인다. -20 ° C에서 보관 원액. 200 밀리미터 (50.8 ㎎ / ㎖)을 최종 농도로 멸균 탈 이온수에서의 스퍼 미딘 trihydrochloride을 녹인다. -20 ° C에서 보관 원액.
   2. 뜨거운, 탈 이온수 (장갑과 입 보호구를 착용!주의 화학 후드에서 작동) 5 % (W / V) 디기 토닌을 준비합니다. -20 ° C에서 필터 및 저장 분취. 페닐 메틸 플루오 라이드 (PMSF) (주의 녹여! 운데 작업R 화학 후드는, 100 % 에탄올 200 밀리미터 (35 ㎎ / ㎖)을 최종 농도 장갑과​​ 입 보호)를 착용한다. -20 ° C에서 보관 원액.
   3. (1) M (154 ㎎ / ㎖)의 최종 농도로 탈 이온수로 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 용해 (주의! 장갑을 착용, 화학 후드에서 작동). -20 ° C에서 필터 및 매장 재고 솔루션입니다.
   4. (-) - 4- (2- Aminoethly benzensulfonylfluoride) 10 ㎎ / ㎖ AEBSF 용해 (! 장갑을 착용주의 화학 후드 작동) 100 배 프로테아제 억제제 혼합물을 제조, 0.2 ㎎ / ㎖ 류 펩틴, 0.1 ㎎ / ㎖ 펩 스타틴 탈 이온수 중 0.2 mg의 / ㎖ 아프로 티닌. -20 ° C에서 보관 원액.
   5. 버퍼의 10 배 원액을 준비 150 mM 트리스 - CL (PH 7.4), 800 mM의 KCl을 20 mM의 EDTA-KOH (PH 7.4), 2 MM의 페르 민의 tetrahydrochloride 5 밀리미터 스퍼 미딘의 trihydrochloride를 포함. 저장 버퍼를 추가해야 페르 민의 tetrahydrochloride와 스퍼 미딘의 trihydrochloride없이 4 ° C에서갓 직전 사용합니다.
      참고 : EDTA는, 고농도 EDTA-KOH 주식 솔루션 (권장 0.5 M)를 준비를 용해 단 8 위의 pH가 5 N KOH를 추가, 따라서, 8보다 높은 pH 값에 용해. 그 후 pH가 7.4까지 적정한다.
   6. 100 mM 트리스 -HCl (pH 7.4), 400 mM의 KCl을 400 mM의 EDTA-KOH (PH 7.4), 5 밀리미터의 trihydrochloride 스퍼 미딘을 포함하는 것으로 버퍼의 20 배 스톡 용액을 제조 하였다. 버퍼는 버퍼 A.와 동일한 조건 하에서 저장 될 수있다
      참고 : 막 분리 전에 갓 I는 IV로 (다음 단계 참조) 작업 용액, 글리세롤 구배 비 dialyzable 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)로 코팅 된 실리카 입자 (15 ~ 30 nm의 직경)을 함유하는 콜로이드 성 실리카 입자 용액을 준비 절차 (PMSF는 수용액에서 불안정하고 디기 토닌이 얼음에 장기 저장시 침전 경향 PMSF 및 디기 토닌은 사용하기 전에 직접 추가해야합니다).
   7. 0.5X 버퍼를 첨가하여 I 액 100 ㎖를 준비1 mM의 DTT, 1 : 멸균 탈 이온수로 프로테아제 억제제 혼합물 및 0.1 mM의 PMSF 100. 1X 버퍼를 첨가하여 (세포 용해 용) 용액 II 50 ㎖를 준비 1mM의 DTT, 1 : 프로테아제 저해제 믹스 100, 0.1 mM의 PMSF, 멸균 탈 이온수에 0.1 % 디기 토닌 및 10 % 글리세롤.
   8. 멸균 탈 이온수에 프로테아제 저해제 믹스 100, 0.1 mM의 PMSF 및 0.05 % 디기 토닌 : 200 III 함유 용액 0.25 배씩 버퍼의 ㎖, 1 mM의 DTT, 1을 제조 하였다. 1X 버퍼를 함유하는 용액 40 ml의 IV를 준비 1mM의 DTT, 1로서 : 프로테아제 저해제 믹스 100, 0.1 mM의 PMSF 및 멸균 탈 이온수에 0.1 % 디기 토닌.
   9. I. 용액에 25 % 글리세롤 및 0.1 % 디기 토닌을 첨가하여 글리세롤 구배 용액 120ml를 준비
   10. 비 dialyzable 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP), 15 % 글리세롤, 2 mM의 S 코팅 현탁액 함유 실리카 입자 (15 ~ 30 nm의 직경)의 60 %의 v / V (부피당 부피)를 함유하는 콜로이드 성 실리카 입자 용액 150 ㎖를 제조permidine trihydrochloride 및 솔루션 IV 0.8 밀리미터 페르 민에 tetrahydrochloride.
   11. 프로테아제 억제제 혼합물의 100, 0.3 % BSA 및 30 % 글리세롤 : 250 mM의 수크로오스, 15 mM의 헤 페스 (PH 7.4), 0.5 밀리미터 스퍼 미딘의 trihydrochloride 0.2 밀리미터 페르 민의 tetrahydrochloride 1 함유 클러스터 저장 버퍼를 준비한다. 클러스터 저장 버퍼는 -20 ℃에서 유지 될 수있다.
   12. 50 % 글리세롤, (장갑을 착용, 화학 후드에서 작동!주의) 10 % 포름 알데히드를 포함하는 스쿼시 수정 솔루션을 준비 마크의 수정 링거 버퍼를 두 배 가량 (MMR 4.5을 참조하십시오.) 0.2 μg의 / ㎖ DAPI (주의! 장갑을 착용). 빛 보호 반응 튜브에 4 ℃에서 보관하십시오. 실험이 스쿼시 수정 조리법을 사용하는 것이 중요하지, 대체 조리법도 작동합니다.

세포의 2. 동기화

1. 하루에 1 : 다섯 75cm ² (250 mL) 중 종자 HeLa 세포 미디어 형틀 5 % C에서 37 ° C에서 배양하여O _2.
   참고 :이 염색질 클러스터 분리의 날에 약 18 × 10 ⁶ 세포에 얻을 것입니다.
2. 주 2 : 세포는 적어도 50 % 합류 경우 (대략 표면의 절반은 셀에 의해 커버되고 성장하는 세포의 여지가 여전히 존재한다), 최종 2 mM의 (티민 블록)의 농도 및 배양 세포로 티미 딘을 추가 5 % CO _2에서 37 ℃에서 24 시간.
   참고 :이 G1 / S 단계 경계에 세포를 체포합니다.
3. 3 일에 : 대기음 매체 티미 딘을 포함하고 멸균 PBS를 추가합니다. 멸균 PBS와 섬세한 세척하여 세포를 씻으십시오. 대기음 PBS 부드럽게 CO _2는 G1 / S 상 블록에서 그들을 출시 5 %에서 37 ℃에서 3 시간 4 신선한, 따뜻한 완전한 DMEM 배지 및 배양 세포의 15 ~ 20 ml에 추가 할 수 있습니다.
4. 3 일 (연속) 상 : G1 / S 상 블록으로부터 세포를 해제 한 후, 100 ng를 / ㎖의 최종 농도로 추가 nocodazole. 98 스톡 용액 (5 ㎎ / ㎖) 2 μl를 첨가하여 희석 nocodazole신선한 DMEM 배지의 μL, 그리고 세포 배양의 각 ㎖의 당 nocodazole 희석 1 μl를 추가합니다. 5 % CO _2, 37 ℃에서 약 12 시간 동안 배양 세포. 이 유사 분열에서 세포를 차단합니다.

3. 유사 분열 클러스터 분리

1. 하루 4 일 : 유사 분열 클러스터를 분리합니다. 세포의 대부분이 유사 분열 경우 명 시야 현미경을 사용하여 확인한다. 세포의 50 % 미만이 유사 분열 대기 경우보다 세포 유사 분열을 도달 할 때까지. 플라스크 (또는 부드럽게 피펫 분무)의 측면에서 적극적으로 활용하여 유사 분열 세포를 수집이 나머지 분열 세포를 분리한다. 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
   주 : 유사 분열 세포 평 단단히 플라스크에 부착되어 다른 세포주기 단계의 세포와는 달리, 라운드되기 쉽고 (단 트립신 처리 후 세포 등) 플라스크의 바닥으로부터 분리 될 수있다.
2. (10 분 동안 1,500 XG에 관을 회전시켜 (4) 유사 분열 세포를 수확76, C 또는 RT), 그 후 상층 액을 제거하는 단계를 포함한다. 하나의 50 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 8 ml의 PBS에 펠렛을 재현 탁 풀 완전히 PBS로 주입 튜브 및 1,500 x g에서 10 분 동안 다시 회전. 총이 세척 과정을 세 번 반복합니다.
3. 지금부터 차가운 솔루션과 얼음의 모든 단계를 수행합니다. 적극적으로 차가운 솔루션 II의 37 ml의 펠렛을 재현 탁. 유사 분열 클러스터는 세포질 물질의 분리 될 때까지 꽉 유봉과 douncing에 의해 얼음에 25 ML의 피펫과를 Lyse 세포를 사용하여 추운 40 ㎖의 유리 유리 균질에 현탁액을 전송합니다. 스트로크의 수는 디기 토닌 스​​톡에 크게 의존하고 3 내지 20 시간에서 변화 할 수있다.
   참고 : 균질화 상당히 활발한 될 수 있지만, 거의 모든 유사 분열 세포가 용해되고, 클러스터가 (3.4 참조) 세포질 물질이 없음을 볼 때 완료된 것으로 간주되어야한다.
4. 트리 판 블루로 2 MICR에 의해 확인 : 스트로크의 몇 세포 현탁액 1 ~ 10 μl를 혼합 한 후노이 바 우어 챔버에 oscopy. 세포가 용해되어 염색질 파란색과 세포막의 자유 (: 가능한 세포질 나머지 푸른 스테인드 염색질 주위에 축적되며 구별하기 쉬울 것이다 주) 염색된다.
   참고 : 유사 분열 세포가 interphasic 세포 전에 용균하지만 그럼에도 불구하고 interphasic 핵 및 엉망이 염색질과 오염을 방지하기 위해 균질화를 과용하지 않도록주의합니다.
5. 즉시 28.8 X 107.0 mm, 그것은에게 추천 다섯 카보네이트 원심 분리 튜브 (IN (글리세롤 구배 용액 각각 19.5 ㎖로 겹쳐 하단 60 % 콜로 이달 실리카 입자 용액 5 ㎖와,) 감기 단계 구배 위에 전체 세포 용 해물 레이어 10ml를 피펫을 사용하여)을 냉각하기 전에 얼음에 튜브를 배치합니다. 오랫동안 솔루션 II에 세포를 보관하지 마십시오, 따라서는 (세척 단계에서, 예를 들어) 미리 튜브와 기울기를 준비하는 것이 좋습니다.
6. 30 마일을 위해 그라디언트를 원심 분리기n은 고정 된 각도 회 전자에 4 ° C에서 1,000 XG에.
   주 : 핵, unlysed 세포 클러스터는 글리세롤의 인터페이스 및 콜로이드 실리카 입자 층에서 함께 회수된다.
7. 피펫을 사용하여 계면 위의 액체를 제거하고 차가운 균질 나머지를 전송합니다. 꽉 유 봉 3-15 스트로크 (다시 디기 토닌의 재고 상황에 따라)에 의해 다시 균질화 혼합물 집계를 제거하고 클러스터에서 세포 골격 섬유를 제거 할 수 있습니다. 스트로크의 모든 부부 후 균질화의 효율성을 확인합니다. DAPI 보충 스쿼시 수정 1 μL와 샘플의 1 μl를 혼합하고 형광 현미경으로 검사합니다.
   주 : 스트로크의 수는 중요 클러스터의 존재가 혼용 된 핵 염색질 및 파편 균질화 너무 강한되었음을 나타낼 때 스트로크의 수가 부족한 것을 의미를 집계.
8. (28.8 X 4 개의 새로운 폴리 카보네이트 원심 분리 튜브 사이의 솔루션을 배포107.0 ㎜) (약. 10 ml의 튜브 당 용액)과 완전히 60 % 콜로 이달 실리카 입자 용액을 채워 (약. 30 ml의 튜브 당 콜로이드 실리카 입자 용액).
   주 : 구배 너무 세포질 이물질이있는 경우 클러스터를 쉽게 포획 할 수 있기 때문에, 콜로이드 실리카 입자 구배 과부하 피한다.
9. 고정 각 회 전자에 4 ° C에서 45,440 XG에서 30 분 뒤에 3,000 XG에서 5 분, 대한​​ 스핀.
   참고 : 이전과 interphasic 핵 (균질화가 세포질 파편에서 핵을 출시하는 너무 많이하지 않은 경우)하지만 클러스터가 종종 느슨한 볼로, 튜브의 바닥에서 약 1.5 cm를 축적 할 그라데이션 들어가는 유지됩니다.
10. 피펫을 사용하여 클러스터 위의 액체를 제거, 재현 탁 아니라, 하나의 튜브에 나머지는 수영장과 두 개의 폴리 카보네이트 원심 분리 튜브 (28.8 X 107.0 ㎜)으로 재배포. 각 튜브에 솔루션 III와 4 잘 섞는다 : 클러스터 정지 1을 희석. 마크 일전자 사이트 펠릿하고 고정 된 각도 회 전자에 4 ° C에서 15 분 동안 1,000 XG를 회전합니다했다.
11. 솔루션 III의 펠렛을 재현 탁 한 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 수영장과 솔루션 III와 함께 입력합니다. 약 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 더 높은 속도로 원심 분리하지 마십시오 - 그것은 클러스터의 돌이킬 수없는 집계가 발생할 수 있습니다.
12. 1.5 2 ml의 반응 튜브에 솔루션 III 다시 세척 (펠렛을 재현 탁하고 완전히 튜브 입력) 300 x g에서 원심 분리기를. 피펫 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 조심스럽게 250 μL 클러스터 저장 버퍼에 재현 탁 펠릿 (여러 펠릿 함께 모든 250 μl를 사용하고이를 풀 경우). 트리 판 블루와 (2)와 노이 바 우어 챔버에서 계산 : 샘플 1의 5 ~ 10 μl를 희석. 적용 가능하다면 더 묽은 / μL 클러스터 (500)의 대략적인 농도를 얻었다.
13. 확인하기 위해 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 정지를 눌러 클러스터 집계를 제거하십시오부적절한 재 부유의 결과들. 클러스터는 -80 ° C에서 개월 동안 저장 될 수있다. 여러 재 냉동 적절한 분취을하고 액체 질소에 동결 스냅 방지 할 수 있습니다.

Interphasic Xenopus의에 대한 버퍼 4. 준비는 계란 추출물을 laevis의

참고 : Xenopus의 개구리가 유지되고 (1998 년 비준 EU) 실험과 다른 목적으로 사용되는 척추 동물의 보호에 관한 유럽 의회의 협약에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 처리하고 독일 법에 관한됩니다 laevis의 연구에서 척추 동물의 용도.

1. DTT 및 1.2.3 및 1.2.4에 따라 100 배 프로테아제 억제제 혼합물을 준비한다. -20 ° C에서 최종 (권장 10 또는 20 μL) 10 밀리그램 / DMSO에 ml의 나누어지는의 농도와 저장소에 사이토의 B를 녹인다.
2. (에탄올, 분취 량의 20 mg / ml의 최종 농도 500 μl를 사이클로 헥시 미드를 용해-20 ° C에서 권장) 및 저장. -20 ℃에서 에탄올, 분취 액과 상점에서 2 mg / ml의 최종 농도로 칼슘 이온 운반체 A23187를 녹인다.
   참고 : PI, DTT, 사이토의 B, 사이클로 헥시 미드와 A23187 반복적 냉동 및 해동 할 수 있습니다.
3. mM의 염화칼슘 _{2, 2} mM의 EDTA, 100 mM의 헤 페스가, 5 N KOH와 8.0으로 산도를 조정 40 2 M의 NaCl, 40 mM의 KCl을 20 밀리미터의 MgCl _2를 포함 20 배 마크의 수정 링거 버퍼 (MMR)을 준비합니다.
   참고 : 20 배 MMR 실온에서 장시간 유지 될 수있다. 1X의 주입 개구리 당 MMR 및 세척 단계에 대한 추가 5-10리터의 interphasic 계란 추출물 1 L 중 하나 준비, 계란의 양에 따라이 필요하다. 5 N KOH 8.0에 1X MMR의 pH를 다시​​ 조정합니다. 1X MMR는 O에 개구리를 유지하기 위해 준비 / N 실온에 있어야 1 X. 이 사용될 때까지 추출물 제제 제조 1X MMR 그러나 그것은 1X MMR 정말 감기는 것을 실험에 중요하지 않고, 저온 보관한다.
4. SUC 1 L의 준비250 MM의 자당, 50 밀리미터의 KCl, 2.5 밀리미터의 MgCl _2, 10 mM의 헤 페스 pH가 7.5를 포함하는 버퍼를했다. 자당 버퍼는 멸균 수를 사용하기 전에 하루 준비를해야하고 4 ℃에서 보관해야합니다.
5. 0.25 배씩의 MMR에서 2 % L - 시스테인을 용해하여 실험의 아침에 갓 dejellying 솔루션을 준비합니다. 5 N KOH와 7.8 산도를 조정합니다. 이 사용될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu의 laevis의 달걀 추출

1. 3~10일 실험 (5 ㎖ 주사기, 27 G ¾ ''바늘) 전에 각 개구리의 등 림프 낭에 120 IE 임신 한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)를 주입한다.
   참고 :이 주사는 배란을 유도 할 것이다. 한 개구리가 낳는 알의 크기는 많이 다릅니다. 잘 누워 개구리는 최대 조 추출물 ml의 3.5에 해당하는 해제 jellynated 후 최대 7 ML의 볼륨을 점유 계란을 생산하고 있습니다. 그러나 일부 개구리 라 누워 또는하지 않습니다 수 있음을 고려Y 나쁜 계란.
2. 실험 (5 ㎖ 주사기, 27G ¾ ''바늘) 전에 개구리 500 IE 인간 융모 성 성선 자극 호르몬 (hCG를) 저녁을 주입한다. 이것은 계란의 방출을 유도 할 것이다. 1.2 리터 1X MMR (PH 8)를 포함하는 각각의 탱크에 18 ℃에서 13 ~ 17 시간 동안 개구리를 유지합니다.
3. 600~1,000 mL 유리 비커에 그것들을 부어 계란을 수집합니다.
   참고 : 크기가 유사하고 명확하게 어둡고 밝은 색 절반 착색 개별적으로 배치되어 계란,의 좋은 배치를 가져 가라. 문자열이나 그 모양 푹신한과 흰색을 형성 알을 복용하지 마십시오. 이들은 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 절차를 통해 정리해야한다. 나쁜 대 좋은 계란에 대한 자세한 설명은 길레스피 등을 참조하십시오. ⁽⁶⁾
4. 계란 정착 뜨는을 경사, 그 후 신선한 버퍼 비커를 보충하여, 집중적으로 1X MMR에 약 4 회, 계란을 씻으십시오.
   참고 :그들이 dejellynated하고 세척 완충액 직접 계란에 도포되기 전에 알은 안정하다.
5. 2 % 시스테인 용액에서 인큐베이션 계란 Dejellynate. 버퍼를 경사 조심스럽게 신선한 버퍼 비커를 작성하여 한 번에 2 ~ 4 분 후 버퍼를 변경합니다. 전체 Considerdejellying은 계란의 양이 크게 감소하고 계란은 더 조밀하게 될 때.
   주 : dejellying 약 5-7 분을 필요로하고 때를 볼 수 있지만, 10 분 후 최신 중지해야합니다.
6. 경사 및 버퍼 상층 액을 보충하여 1X MMR 씻을 계란은 약 4 시간.
   참고 : 계란 따라서, 세척 단계 더 신중하게 할 필요가 dejellynated 된 후 더 연약합니다. MMR은 오히려 계란에 대신 직접 비커의 벽에 세척해야한다.
7. 칼슘 이온 운반체 (에탄올 2 ㎎ / ㎖)의 8 μl를 추가하여 ㎖의 1X MMR (100)에 계란을 활성화합니다. 동물 모자 수축 될 때 활성화를 중지눈에 보이는 또는 10 분 후에 온다.
   주 : 동물 캡 수축이 계란의 검은 절반의 압축에 의해 식별 할 수 있습니다.
8. 경사 및 버퍼 상층 액을 보충하여 1X MMR과 신중하게 4 회 반복한다.
9. RT에서 1X MMR에서 20 분 동안 알을 품어.
10. 배양 시간 동안 원심 분리 튜브를 준비 : 장소 50 μL 자당 버퍼, 50 μL 100 배 프로테아제 억제제 믹스, 5 μL 1 M DTT, 12.5 μL의 사이클로 헥시 미드 2.5 μL의 사이토의 B (특히 사이클린 B의 번역을 방지하기 위해 ()에 5 ㎖ 원심 분리 관 (13 X 51mm)의 액틴 중합)을 방지한다. 대안 적으로, 계란 30 mL를 위해 14 ml의 튜브 (14 X 95mm)이 2.4 배,이 경우 증가 볼륨에서 사용될 수있다.
11. (유리 비커에 캔트 및 리필 버퍼) 차가운 자당 버퍼로 두 번 계란을 세척하고 넓은 개방 (좁은 끝을 잘라)와 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 원심 분리 튜브로 전송할 수 있습니다.
12. 팩130 X g에서 1 분간 회전시켜 계란. (각각 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 14 ml의 튜브를 넣어)이 목적을 위해 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에서 튜브를 넣습니다. 추출물의 희석을 방지하기 위해 가능한 목표만큼의 버퍼를 제거하는 것이다. 원심 분리 후, 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 버퍼의 초과를 제거하고 결국 정상에 더 많은 알을 입력합니다.
13. 6 × 5 ml의 스핀은 4 ℃에서 21,000 XG에 20 분 동안 회전 스윙.
14. 하단에서 상단에 노란색 노른자와 어두운 깨진 계란 파편 사이에, 16 G 1 ½ ''바늘로 5 ML의 주사기를 사용하여 저속 추출물을 제거합니다. 이 목적을 위해, 단지 하부에 깨진 계란 파편 층 위 원심 관의 벽을 통해 주사기 바늘을 누른다. 바늘로 밀어 때 저항에 튜브를 잡고.
    참고 : 충전을 5 ml 원심 분리 관 추출물 ml의 1.8 ~ 2.5 사이를 제공합니다.
15. 추출액 1 ㎖ 당 10 ㎕의 100 배 프로테아제 저해제 믹스, 1 μL를 추가1 M DTT 2.5 μl를 사이클로 헥시 미드 (20 ㎎ / ㎖) 0.5 μL의 사이토 칼라 신 B를 (10 ㎎ / ㎖)의. 얼음에 추출물을 유지합니다.
    주 : 추출액 중 실험에 직접 사용하거나 분주 수, 동결 수개월 액체 질소에 저장 스냅인. 추출물을 동결하는 활동을 감소합니다. immunodepletion 같은 섬세한 실험을 위해 그것은 매우 즉시 신선한 추출물을 사용하는 것이 좋습니다.

염색질 Decondensation의 체외 재구성 될 버퍼 6. 준비

1. 25 mM의 ATP, 25 mM의 GTP, 127.5 ㎎ / ㎖ 크레아틴 포스페이트 및 2.5 밀리그램 / 250 mM의 수 크로스, 1.2 mM의 헤 페스, 5.9 mM의 KCl을 0.3 밀리미터의 MgCl _2를 함유하는 완충액 용액 크레아틴 키나제를 함유하는 에너지 믹스 스톡 용액을 제조 하였다. -80 ° C에서 나누어지는 및 저장. 재 냉동하지 않는, 해동 후 갓 사용합니다.
2. 탈 이온수 0.2 ㎍ / ㎖ 글리코겐을 녹인다. -20 ℃에서 보관하십시오. 최종 농도 6- 디메틸 아미노 퓨린 (DMAP)을 녹이고DMSO의 0.25 M의. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 재 냉동하지 않는, 해동 후 갓 사용합니다.
3. 30 % 4 ℃에서 PBS, 필터 및 저장소 (W / V) 자당을 준비합니다. 80 mM의 파이프의 pH 6.8, 1 밀리미터의 MgCl _2, 150 MM의 자당 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (주의!, 화학 후드에서 작동 장갑과 입 보호구를 착용)를 포함하는 4 % VikiFix 솔루션을 준비합니다.
   참고 : PFA 따라서 용해하기 어려운 그것은 다음과 같은 그것을 할 것을 권장합니다 : 1리터은 24.2 g의 파이프 및 별도의 비커에 40g PFA을 용해 VIKI가-수정, 뜨거운 (거의 끓는) 탈 이온수에 모두. 모두 10 N NaOH를 추가함으로써 용해하지만 너무 많이 추가하지 않도록주의합니다. 51.4 g의 자당과 PFA 용액 1 ml의 1 M의 MgCl _2를 추가합니다. 다른 믹스로 파이프 솔루션을 추가합니다. 1리터 최종 부피까지 채우고 수산화 나트륨을 첨가하여 중립으로 산도를 조정합니다.
4. 10 mg을 물에 / ㎖ 4 ', 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) (주의! 장갑을 착용) 용해. 에 저장-20 ℃에서 어두운.

염색질 Decondensation의 체외 재구성 될 7. 프로토콜

1. 고정 된 각도에서 386,000 XG에서 12 분 동안 20 × 0.2 mL로 저속 interphasic 추출물 스핀 또는 10 × 2.0 ml의 회 전자 (355) 000 XG에.
2. 조심스럽게 진공 펌프 피펫을 사용하여 상부에 지방층을 제거하고 상층 액을 하층으로부터 막 오염을 회피 (후 고속 추출액이라고도 함) 및 펠렛을 버린다.
   참고 : 두 번 추출물을 회전하거나 원심 분리 전에 자당 버퍼 볼륨의 20 %와 추출물을 희석하는 것이 좋습니다 수 막 오염을 줄일 수 있습니다. 그러나, 추가로 희석 및 원심 분리 단계는 추출 활성을 감소시킬 수있다.
3. 피펫은 1.5 ml의 반응 관에 고속 추출물 18 μL, 글리코겐 μL (량이 약간 염색질 스톡 농도에 따라 변할 수있다) 0.5 μl를 0.5 분열 클러스터를 0.7 μL를 추가에너지 믹스 0.3 μL DMAP. 염색질이 decondensing 염색질의 전단을 방지하기 위해 추가되는 즉시 반응을 혼합 넓은 개방과 팁을 사용합니다.
   비고 : 반응 막 (도 3 참조)의 존재 또는 부재 하에서 수행 될 수있다. , 세포막의 존재 염색질을 decondense하려면 Eisenhardt 등에 의해 기술 된 프로토콜에 따라 제조 떠 막 2 μL를 추가합니다. ⁽¹⁶⁾
4. 20 ° C에서 (decondensation 프로세스 이전 시점 공부 이하)까지 2 시간 동안 반응 혼합물을 배양한다.
5. 얼음에 20 ~ 30 분 동안 0.5 % 글루 타르 알데히드 0.1 ㎎ / ㎖ DAPI와 부화를 포함하는 0.5 ml의 VIKI - 수정 차가운 얼음을 추가하여 샘플을 수정합니다.
   참고 : 샘플이 추가로 면역 형광 처리 할 경우이 종종 항체 염색 방해로, 고정이 글루 타르 알데히드없이 수행해야합니다. 만 DAPI 염색 분석됩니다 그러나 경우, 과잉의 추가araldehyde는 더 좋은 크로 마틴 구조를 유지합니다.
6. 염색질로 커버 슬립의 친 화성을 높이기 위해 폴리 -L- 라이신 용액으로 5 분 동안 라운드 커버 슬립 (직경 12mm)를 배양한다. 그 후 여과지에 커버 슬립을 건조.
7. 원심 분리 튜브의 바닥에 상단에 코팅 된 사이트와 커버 슬립을 넣어 평면 바닥 원심 분리 튜브 (6 ml의 16/55 mm)를 조립합니다. 30 % 자당 쿠션의 800 μl를 추가하고 상단에 고정 된 샘플 레이어.
8. 4 ° C에서 2,500 XG에 15 분 동안 스핀.
   참고 : 평면 바닥 원심 분리 튜브 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브를 채택 로터에 맞게.
9. 다음, 16 G 1 ½ '주사기 바늘로 신중 원심 튜브의 바닥을 파고에 의해 튜브로부터 제거 된 커버, 상등액을 경사 분리한다. 바늘 (3)이 약 스틱이되도록 목적 테이프 바늘의 덮개와 함께 그들의 바늘 바지에서 자체와는 리드의 선단을 절단MM 아웃. 커버 슬립을 하나의 사이트에서 바늘에 의해 해제 될 때, 커버 슬립을 제거하기 위해 핀셋을 사용합니다.
10. 탈 물에 침지하여 신속하게 커버 슬립을 씻어 여과지에 측면을 터치하여 부드럽게 건조 장착 매체의 드롭 현미경 슬라이드에 놓습니다. 건조 매니큐어를 밀봉하고 어두운 곳에서 보관하십시오.
    주 : 글루 타르 알데히드없이 고정 된 샘플은 24 웰 플레이트에 PBS에 저장 면역 형광 염색법을 더 사용할 수있다. 몇 일 동안 저장하는 경우, 0.05 % 아 지드 화 나트륨 (주의! 장갑 착용) 추가 박테리아 오염을 방지하기 위해 PBS에있다.
11. DAPI 신호의 형광 현미경에 의해 시료를 분석 (예를 들면, 405 nm의 레이저와 공 촛점 현미경을 사용하여).

체외 재구성 염색질 Decondensation 샘플의 면역 형광 염색을위한 버퍼 8. 준비

1. 1.1.1에 따라 PBS를 준비합니다. 핀에 NH ₄ (CL)을 녹여PBS에서 50 mm의 Al 농도. 4 ℃에서이 솔루션을 유지합니다. PBS에 5 μg의 / ㎖ DAPI를 (갓 준비) 용해. PBS에 0.​​1 % 트리톤 X-100을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. PBS + 0.1 % 트리톤 X-100 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 희석하여 사용 전에 버퍼 블로킹 갓 제조.

체외 재구성 염색질 Decondensation 샘플의 면역 형광 염색 9. 프로토콜

참고 :. 달리 명시하지 않을 경우 커버 슬립의 모든 다음 배양이 잘 당 최소 250 μL 용액을 24 웰 플레이트에서 만들어진 체외 decondensed 염색질 샘플을 추가하거나 솔루션을 제거 할 때 따라서주의 고정 된 세포보다 더 민감하다. 그것은 각도 절단 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 세척 단계와 차 항체 배양을 위해 100 rpm으로보다 빠른 이동, 락 또는 플랫폼을 회전에 실온에서 접시를 놓습니다.

1. 커버 슬립을 배양하여 샘플을 끄다5 분 동안 PBS 1 ml의 NH ₄ CL과의. 1ml를 적어도 30 분 동안 블로킹 완충액으로 이들을 배양하여 블록 샘플.
2. 일차 항체와 함께 인큐베이션 습도 챔버를 조립 : 웨트 티슈의 상단에 거꾸로 폐쇄 상자의 바닥 24 웰 플레이트의 뚜껑을 올려 습윤 티슈. 뚜껑에 파라 필름을 놓고 파라 필름에 샘플 당 항체 용액 70 μl를 추가합니다. 항체 솔루션의 경우, 항혈청 또는 친 화성 정제 된 항체 1을 희석 : (100) 버퍼를 차단합니다.
3. 거꾸로 항체 용액 위에 커버 슬립을 넣고 1 ~ 2 시간 동안 이들을 배양. 다시 샘플면이 위를 향하게과 함께 24 웰 플레이트로 된 커버를 배치 PBS 1 ml의 0.1 % 트리톤 X-100과 10 분 동안 샘플을 세 번 씻는다.
4. 제조업체에서 권장하는 농도로 버퍼를 차단에 희석 250 μL 보조 형광 표지 된 항체에 실온에서 1 시간 동안 커버 슬립을 품어. 빛으로부터 보호합니다. THR 세척PBS 1 ml의 0.1 % 트리톤 X-100과 10 분 동안 EE 시간.
5. 5 μg의 1ml를 / ㎖ DAPI PBS에서 10 분 동안 샘플을 품어. PBS 1 ml의 0.1 % 트리톤 X-100과 5 분 동안 세 번 씻으십시오.
6. 탈 물에 침지하여 신속하게 커버 슬립을 씻어 여과지에 측면을 터치하여 부드럽게 건조 장착 매체의 드롭의 상단에있는 현미경 슬라이드에 놓습니다. 건조, 매니큐어와 함께 인감 및 사용까지 어둠 속에서 4 ° C에서 유지. 형광 현미경으로 샘플을 분석 할 수 있습니다.

결과

decondensation 반응의 시간 의존성

그림 1은 decondensation 분석의 전형적인 시간 과정을 보여줍니다. 반응 개시 가시 염색체 클러스터 decondenses 번의 둥글고 부드러운 핵 내로 병합. 계란 추출물 자당으로 대체 될 때 염색체 클러스터 decondensation 활동 계란 추출물에 존재 함을 시사하는 축합 남아 버퍼.

염색질 decondensation는 에너지 의존하는 과정이...

토론

제노 계란 추출물 충실히 시험 관내 세포 과정을 재현하는 매우 유용한 도구이다 laevis의,이 시스템은 성공적으로 세포주기 및 세포 분열 이벤트 ^{2, 3,5,6,17의} 특성화에 사용 하였다. 때문에 oogenesis 동안 계란에서 압수 핵 구성 요소의 대형 상점, 계란 추출물은 세포 성분의 훌륭한 소스입니다. 포유 동물 조직 세포주 또는 유전자 조작에 RNAi를 같은 다른 방법에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1