المناهج التجريبية لدراسة الميتوكوندريا التعريب وظيفة من دورة الخلية النووية كيناز، Cdk1

Summary

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Abstract

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Introduction

في الثدييات، تقدم دورة الخلية يعتمد على الأحداث أمر غاية التي تسيطر عليها الحلقيات وتحركات تعتمد على السيكلين (Cdks) ^1. من خلال حشوية لها، والطاقة النووية، وتوطين centrosomal، CyclinB1 / Cdk1 قادر على مزامنة الأحداث المختلفة في الانقسام مثل انهيار الغلاف النووي والانفصال الجسيم المركزي ^2. CyclinB1 / Cdk1 يحمي الخلايا الإنقسامية ضد الخلايا ³ ويعزز الانشطار الميتوكوندريا، خطوة حاسمة لتوزيع متساو للالميتوكوندريا في الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا ^4.

في تكاثر خلايا الثدييات، يتم إنشاء الميتوكوندريا ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) الأجهزة (الإلكترون سلسلة النقل)، الذي يتكون من 5 مجمعات متعددة فرعية. أنا معقدة - V معقدة (CI-CV). ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH): مؤكسدة مختزلة يوبيكوينون أو معقدة الأول (CI) هو الأكبر والأقل يفهم من المجمعات الخمسة ^5. ج معقدةonsists من 45 وحدات فرعية، منها 14 تشكل جوهر الحفاز. تجميعها مرة واحدة، يفترض مجمع هيكل على شكل حرف L مع ذراع واحدة بارزة في مصفوفة والذراع الأخرى جزءا لا يتجزأ من ^6،7 الغشاء الداخلي. الطفرات في مفارز CI هي السبب في مجموعة متنوعة من اضطرابات الميتوكوندريا ^8. مطلوب CI فعال وظيفيا في OXPHOS ليس فقط للتنفس الميتوكوندريا العام ^9، ولكن أيضا لخلية الناجحة دورة التقدم ^10. يمكن التكشف الآليات الكامنة وراء عمل هذا المجمع انزيم بغشاء في الصحة والمرض تمكن من وضع إجراءات تشخيصية جديدة والاستراتيجيات العلاجية المتقدمة. في دراسة أجريت مؤخرا، وجدنا أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا في (الفجوة 2) G2 / (الانقسام) المرحلة M وphosphorylates مفارز CI إلى تعزيز إنتاج الطاقة في الميتوكوندريا، يحتمل أن تكون لتعويض زيادة احتياجاتها من الطاقة من الخلايا خلال خلية دورة ^11. نحن هنا SHOwcase الإجراءات التجريبية والاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لدراسة النبات الميتوكوندريا من تحركات خلاف النووية / هيولي، ركائز من الميتوكوندريا وكذلك العواقب الوظيفية للتوطين الميتوكوندريا الخاصة بهم باستخدام CyclinB1 / Cdk1 كمثال على ذلك.

ورأت أن CyclinB1 / Cdk1 مجمع translocates في الميتوكوندريا عند الحاجة دفعت دراسات overexpression-الميتوكوندريا محددة وضربة قاضية لهذا المجمع. لتحقيق التعبير عن الميتوكوندريا محدد من البروتينات، يمكن للمرء أن إضافة تسلسل الميتوكوندريا التي تستهدف (MTS) في N-محطة من البروتين من الفائدة. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل تسمح للفرز بروتينات الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي يقيمون فيها عادة ^12. لقد استخدمت 87 الميتوكوندريا قاعدة تستهدف تسلسل المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) والمستنسخة ذلك إلى البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -tagged CyclinB1 أو الأحمر نيونبروتين (RFP) -tagged Cdk1 تحتوي على البلازميدات في الإطار. يسمح هذا الأسلوب لنا لاستهداف CyclinB1 وCdk1 في الميتوكوندريا، وتغيير وجه التحديد التعبير الميتوكوندريا من هذه البروتينات دون أن يؤثر ذلك تجمع النووي. عن طريق وضع علامات fluorescently هذه البروتينات، كنا قادرين على مراقبة التعريب في الوقت الحقيقي. وبالمثل، أدخلنا MTS إلى البلازميد التي تحتوي على الموسومة طلب تقديم العروض المهيمنة سلبية Cdk1، الذي سمح لنا أن يطرق على وجه التحديد أسفل التعبير وظائف الميتوكوندريا من Cdk1. لا بد من التمييز بين وظائف الميتوكوندريا والنووية للتحركات التي لديها تعريب المزدوجة مثل Cdk1. هندسة MTS إلى N-محطة من هذه تحركات الوظيفية المزدوجة يقدم استراتيجية كبيرة أن من السهل استخدامها وفعالة.

منذ Cdk1 هو كيناز دورة الخلية، وهو أساسي لتحديد تقدم دورة الخلية عندما يكون موضعيا Cdk1 إلى الميتوكوندريا. ولتحقيق ذلك، فإننا قد تستخدم لmetho جديدد لمراقبة محتوى الحمض النووي في الخلايا. وتشمل الأساليب التقليدية باستخدام BrdU (bromodeoxyuridine)، والثيميدين التماثلية الاصطناعية، والتي تضم في الحمض النووي مركبة جديدة خلال مرحلة من مراحل دورة الخلية إلى استبدال الثيميدين. ثم الخلايا التي يتم تكرار بنشاط عينات من الحمض النووي يمكن أن يتم الكشف باستخدام الأجسام المضادة ضد BrdU. ومن عيوب هذا الأسلوب هو أنه يتطلب تمسخ من الحمض النووي لتوفير وصول الأجسام المضادة BrdU بواسطة أساليب قاسية مثل العلاج حامض أو الحرارة، مما قد يؤدي إلى عدم تناسق بين النتائج ^13،14. بدلا من ذلك، نحن تستخدم نهجا مماثلا لمراقبة تقسيم الخلايا بنشاط مع التناظرية ثيميدين مختلفة، EDU. لا يتطلب الكشف ايدو قاسية تمسخ الحمض النووي كما تمكن العلاج المنظفات معتدل الكاشف الكشف للوصول إلى ايدو في الحمض النووي توليفها حديثا. وقد ثبت أن طريقة ايدو لتكون أكثر موثوقية، بما يتفق ومع إمكانية تحليل الإنتاجية العالية ^(15).

وأخيرا، رس تحديد ركائز الميتوكوندريا من Cdk1، استخدمنا أداة البروتينات تسمى 2D-DIGE، وهو نسخة مطورة من الكلاسيكية الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. اثنين الكهربائي الأبعاد يفصل البروتينات وفقا لنقطة تساوي الكهربائية في البعد الأول والوزن الجزيئي في الثانية. منذ مرحلة ما بعد التعديلات متعدية مثل الفسفرة تؤثر على نقطة تساوي الكهربائية والوزن الجزيئي للبروتينات، يمكن أن المواد الهلامية 2D كشف عن الاختلافات بين الحالات الفسفرة من البروتينات داخل عينات مختلفة. حجم (المساحة وكثافة) من البروتين البقع التغييرات مع مستوى التعبير من البروتينات، مما يتيح المقارنة الكمية بين عينات متعددة. باستخدام هذا الأسلوب، كنا قادرين على التفريق بين البروتينات فسفرته في النوع البري مقابل Cdk1 الخلايا معربا عن متحولة استهداف الميتوكوندريا. تم عزل البقع البروتين المحددة التي أظهرت في النوع البري ولكن في عداد المفقودين في متحولة إعداد Cdk1 استهداف الميتوكوندريا وحددت عن طريق قياس الطيف الكتلي.

في المواد الهلامية 2D التقليدية، وتستخدم الأصباغ ثلاثي فينيل ميثان لتصور البروتينات على هلام. يستخدم 2D-DIGE تسميات بروتين فلوري مع تأثير ضئيل على البروتين التنقل الكهربي. عينات البروتين مختلفة يمكن أن توصف مع الأصباغ الفلورية مختلفة، مختلطة مع بعضها البعض وتفصل بينها المواد الهلامية متطابقة، والسماح للزملاء الكهربائي من عينات متعددة على هلام واحد ^16. هذا يقلل من الاختلافات جل إلى جيل، وهي مشكلة خطيرة في دراسات البروتينات القائم على هلام.

Protocol

1. عزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة

1. إعداد عزل العازلة للخلايا (IBC) العازلة
   1. تحضير 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف (تريس (hydroxymethyl) aminomethane / 3- (N -morpholino) حمض propanesulfonic): ذوب 12.1 غرام من تريس في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق اجتماعات الأطراف، إضافة الماء المقطر إلى ما مجموعه حجم 1 لتر وتخزينها في 4 ^{درجة مئوية.}
   2. تحضير 0.1 M EGTA (الايثيلين جلايكول مكرر (2-aminoethyl الأثير) حمض tetraacetic) / تريس: ذوب 38.1 غرام من EGTA في 800 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام مسحوق تريس، إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 1 لتر وتخزينها في 4 ^{درجة مئوية.}
   3. إعداد 1 M السكروز: ذوب 34.23 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر، وجعل 20 مل قسامات، ومخزن في -20 ^{درجة مئوية.}
   4. إعداد العازلة _ج IB: إعداد 100 مل من IB _ج العازلة بإضافة 10 مل من 0.1 M تريس / اجتماعات الأطراف و1 مل من 0.1 M EGTA / تريس إلى 20 مل، من 1 M السكروز. إضافة الماء المقطر إلى إجمالي حجم 100 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
2. إعداد خلية الاحتياطي تحلل
   1. إعداد العازلة تحلل تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA (الإثيلين diamino حمض tetraacetic)، 1 ملي EGTA، 1٪ تريتون-X-100، 2.5 ملم الصوديوم بيروفوسفات، 1 ملم β- سكرولي، 1 ملم الصوديوم orthovanadate. إضافة مثبطات بروتين 1 ميكروغرام / مل Leupeptin و1 ملم PMSF (phenylmethylsulfonyl الفلورايد) الحق قبل الاستخدام.
3. عزل الميتوكوندريا
   1. حصاد 3 × 10 ⁷ الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة)، ودرجة الحموضة 7.4 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.} تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 5 مل العازلة IB _ج الجليد الباردة.
   2. تجانس الخلايا باستخدام طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج لمدة 10 دقيقة. نقل جناسة لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 ميلن في 4 ^{درجة مئوية.} لالميتوكوندريا وظيفية، واستخدام اقتران الزجاج / تفلون كما أنه أقل ضررا على الميتوكوندريا من طاحونة الأنسجة الزجاجية / زجاج.
   3. جمع طاف في أنابيب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.} طاف لنقل أنبوب 1.5 مل، وباستثناء ما بروتين العصارة الخلوية.
   4. يغسل بيليه (الميتوكوندريا) مرتين مع 200 ميكرولتر الجليد الباردة عازلة IB _ج وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.}
   5. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت خلية تحلل واستخدامها على الفور أو تخزين في -80 ^درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. إذا كانت هناك حاجة الميتوكوندريا وظيفية، وإعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت المتبقية بعد التخلص من طاف. تمييع جزء الميتوكوندريا الأخرى التي قد تؤدي إلى فقدان وظيفة الميتوكوندريا. تخزين على الجليد واستخدام إعداد في 1-3 ساعة حصول على أفضل النتائج.
   6. يصوتن بيليه معلق لمدة ثلاثين 3 انفجارات ثانية فيحمام الثلج، الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق، وحفظ طاف باعتبارها جزء الميتوكوندريا.

2. المشارك المناعية من Cdk1، CyclinB1 وCOXIV، وهو البروتين الميتوكوندريا المقيم

1. تنمو 5 × 10 ⁴ خلايا coverslips على في 24-جيدا لوحات O / N أو ما يصل إلى 70٪ التقاء. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة 1 × برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
2. إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في RT لمدة 10 دقيقة. نضح الحل تحديد وغسل الخلايا مع 500 ميكرولتر 1 × PBS 3 مرات، مع كل طيف اهتزاز في RT مدة 5 دقائق.
3. Permeabilize الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT. نضح الحل وغسل الخلايا 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة عرقلة الحل (500 ميكرولتر، 1٪ BSA (الأبقار مصل الزلال) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين 20) لمدة 30 دقيقة في RT.
4. تمييع الأجسام المضادة الأولية 1: 250 (ت: ت) في 5001؛ لتر من عرقلة الحل واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المطلوبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة لتجنب الإشارات عبر (CyclinB1 (الماوس) وCOXIV (أرنب) أو Cdk1 (الماوس) وCOXIV (الأرنب) في RT ل30 - 60 دقيقة أو O / N عند 4 ^{درجة مئوية.}
5. غسل لل coverslips مع 500 ميكرولتر من 1 × PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 1000 في 500 ميكرولتر عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة تليها الغسيل مع 500 ميكرولتر PBS 3 مرات، 5 دقائق لكل منهما.
6. جبل لل coverslips مع 20 ميكرولتر من محلول تصاعد مكافحة تتلاشى وختم الشرائح مع طلاء الأظافر. صورة الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت على الفور أو تبقى في الظلام عند 4 ^درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع.

3. كربونات الصوديوم استخراج الميتوكوندريا سليمة

1. ينمو حوالي 20 × 10 ⁷ خلايا، والحصاد، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. تقسيم الميتوكوندريا يعزل إلى قسمين قدم المساواةنهاية الخبر قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4)؛ انقاذ نصف لاستخدامها إجمالي الميتوكوندريا (الخطوة 3.2)، استخدم النصف الآخر لاستخراج كربونات الصوديوم (بعد خطوات 3،3-3،6) لفصل البروتينات القابلة للذوبان وغشاء ملزمة.
2. ليز مجموع الميتوكوندريا بيليه مع 30 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلايا وتخزين المحللة في -80 ^درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
3. إضافة 250 ميكرولتر من 0.1 M نا ₂ CO ₃ (كربونات الصوديوم)، ودرجة الحموضة 11.0، إلى النصف الآخر من بيليه الميتوكوندريا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
4. أجهزة الطرد المركزي في 100000 x ج لمدة 20 دقيقة. جمع طاف وانتقل إلى الخطوة 3.5. ليز بيليه باستخدام 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ويصوتن كما في الخطوة 1.3.6. تخزين في -80 ^درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.
5. إضافة حجم مساو من 20٪ حمض الخليك ثلاثي الكلور تقدم طازجة (TCA) لطاف لترسيب البروتينات والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة.
6. Centrifأويغه في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف، حل بيليه في 80 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل ومخزن في -80 ^درجة مئوية حتى استخدامها في immunoblotting.

4. فصل الداخلية والخارجي الأغشية من الميتوكوندريا (عزل Mitoplasts)

1. ينمو حوالي 20 × 10 ⁷ خلايا، والحصاد، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وعزل الميتوكوندريا كما هو موضح في القسم 1. فصل الكسور الميتوكوندريا إلى 10 أجزاء متساوية قبل الطرد المركزي الماضي لبيليه الميتوكوندريا (قبل الخطوة 1.3.4).
2. حل كل بيليه في 30 ميكرولتر من تركيز المشار إليه من عازلة السكروز منخفض التوتر (1 ملم EDTA، 10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (هيدروكسيد البوتاسيوم)، ودرجة الحموضة 7.2، تركيز السكروز تتراوح 25-200 ملم) مع أو بدون 50 ميكروغرام / مل التربسين ( انظر الجدول 1)، واحتضان 30 دقيقة على الجليد.
3. إضافة 3 ميكرولتر من 10 ملي PMSF (للوصول إلى تركيز النهائي من 1 ملم PMSF) إلى التربسين التي تحتوي على قوارير لوقف رانه التربسين الهضم واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
4. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج في 4 ^درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نقل طاف في أنبوب جديد، ليز بيليه في 30 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل، يصوتن كما في الخطوة 1.3.6، ومخزن في -80 ^{درجة مئوية.}

5. بناء الميتوكوندريا استهداف GFP / الموسومة طلب تقديم العروض CyclinB1 / Cdk1 المتجهات وتأكيد تلك التعريب الميتوكوندريا

1. استنساخ الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS، المستمدة من السلائف السيتوكروم البشري ج أوكسيديز فرعية 8A (COX8) بين النيوكليوتيدات 76-161) في إطار في N-محطة من GFP أو طلب تقديم العروض في مواقع NheI وBamHI من pEGFP-N1 أو pERFP ناقلات -N1 باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية.
2. عند تصميم الاشعال PCR لجينات CyclinB1 وCdk1، إضافة مواقع BamHI انزيم التقييد الاعتراف (جريئة) ل5 'من الاشعال PCR.
   إلى الأمام Cdk1 BamH15 'CAG تي GG ATC C AA TGG مجموعة الاهلي ATT ATA التقييم القطري المشترك AAA T
   عكس Cdk1 BamH1 5 "CTG تي GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT
   إلى الأمام CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC الجهاز المركزي للمحاسبات TGG CGC TCC GAG TCA
   عكس CyclinB1 BamH1 5 "ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C
3. تضخيم الجينات Cdk1 وCyclinB1 استخدام هذه البادئات التالية الأساليب القياسية. هضم منتجات PCR مع 1 ميكرولتر من انزيم تقييد BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع الصحيحة شظايا الحمض النووي -sized بها وتنقية الحمض النووي من الجل باستخدام مجموعة استخراج الهلام.
4. هضم 1 ميكروغرام من MTS-pEGFP-N1 والبلازميدات MTS-pERFP-N1 مع 1 ميكرولتر من انزيم BamHI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إضافة 1 ميكرولتر من العجل-INTEStinal الفوسفاتاز القلوية (CIP) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تشغيل المنتجات الهضم على هلام الاغاروز 1٪ وتنقية البلازميدات الخطية من هلام كما في الخطوة 5.3.
5. إعداد رد فعل الربط عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من البلازميد من الخطوة 5.4 و 5 ميكرولتر من Cdk1 أو CyclinB1 من الخطوة 5،3-3 ميكرولتر من العازلة يغاز، 0.5 ميكرولتر من T4 يغاز، و 20.5 ميكرولتر من درهم ₂ O. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
6. تحويل كولاي DH5α الخلايا المختصة مع 10 ميكرولتر من خليط ربط التالية التقنيات القياسية وتنمو البكتيريا على 10 ملغ / مل الكانامايسين التي تحتوي على LB لوحات أجار O / N عند 37 درجة مئوية للحصول على المستعمرات.
7. اقتطاف مستعمرة من O / N نمت لوحات باستخدام طرف ماصة معقمة، إدراج معلومات سرية إلى 5 مل من كانامايسين-LB التي تحتوي على أنبوب واحتضان O / N. عزل البلازميد باستخدام مجموعات miniprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتسلسل البلازميد باستخدام التقنيات القياسية.
8. Transfect MCF1 تنمو باطرادخلايا 0A (1.5 × 10 ⁴ خلايا المصنفة على لوحات 96-جيدا) مع MTS-Cdk1-طلب تقديم العروض أو MTS-CyclinB1-GFP البلازميدات من الخطوة 5.7 من خلال إعداد البلازميد / ترنسفكأيشن نسبة كاشف 1: 2 (ث: ت، 100 نانوغرام : 0.2 ميكرولتر) في serum- 100 ميكرولتر والمتوسطة خالية من المضادات الحيوية.
9. احتضان الخلايا في البلازميد مزيج / كاشف لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة CO ₂ مع مراقبة الرطوبة (5٪ CO _2، الرطوبة النسبية 95٪).
10. إعداد 1 ملم حل سهم الأصباغ الحمراء والخضراء الفلورسنت الميتوكوندريا عن طريق تذويب 50 ميكروغرام من مسحوق في 100 ميكرولتر من DMSO. تمييع الحلول الأوراق المالية 1: 400 في برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 2.5 ميكرومتر حلول العمل. يمكن تخزين حلول السهم عند -20 درجة مئوية لمدة عام.
11. خلط 2 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر من صبغة حمراء مع 98 ميكرولتر من مستنبت لإعداد تركيز النهائي 50 نانومتر.
12. استبدال خلية ثقافة المتوسط ​​من CyclinB1-GFP تحمل خلايا MCF10A (ولدت في الخطوة 5.8) مع صبغة حمراء تحتوي متوسطة لمدة 2 دقيقة. تكرارنفس الإجراء مع صبغة خضراء لCdk1-طلب تقديم العروض خلايا تحمل MCF10A.
13. يغسل مرتين مع 100 ميكرولتر 1 × برنامج تلفزيوني للتخلص من الحل تلطيخ الزائد، إضافة 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X لوحة 96-جيدا.
14. تصور الميتوكوندريا وCyclinB1-GFP (الإثارة من 488 نانومتر، والانبعاثات في 494-536 نانومتر) وCdk1-طلب تقديم العروض (الإثارة من 560 نانومتر، والانبعاثات في 565-620 نانومتر) على لوحات 96-جيدا تحت المجهر الفلورسنت في 40X التكبير.

6. تحديد تفاضلي فسفرته البروتينات عبر 2D-DIGE

1. إعداد عينة
   1. عزل الميتوكوندريا وليز الكسور الميتوكوندريا كما في الخطوة 1.3. إضافة حجم مساو من 20٪ TCA (حمض التريكلوروسيتيك في الماء) لكل عينة ودوامة لمدة 15 ثانية. احتضان عينات على الجليد لمدة 30 دقيقة كما تترسب البروتينات من الحل.
   2. عينات الطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإضافة 60 ميكرولتر الأسيتون البارد (100٪)، يليهالطرد المركزي في 9300 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. كرر الخطوة غسل الأسيتون (الخطوة 6.1.2) واحد مزيد من الوقت، إزالة طاف واعادة تعليق العينات في 50 ميكرولتر DIGE وضع العلامات عازلة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.5).
2. إعداد الأصباغ الفلورية
   1. إعداد محلول المخزون: ذوب الأصباغ (5 نانومول) في 5 ميكرولتر من الفورماميد ثنائي ميثيل جديدة (DMF) إلى تركيز النهائي من 1 نانومول / ميكرولتر. تخزين محلول المخزون صبغ في -20 ^درجة مئوية حتى استخدامها لبضعة أشهر.
   2. يعد حل العمل: السماح الأصباغ لتعيين في RT لمدة 5 دقائق. تمييع 1 ميكرولتر من صبغ مع 4 ميكرولتر من DMF إلى التركيز النهائي من 200 بمول / ميكرولتر. الحفاظ على الجليد أثناء الاستخدام. ملاحظة: الحل العمل يمكن أن تبقى عند درجة حرارة -20 ^درجة مئوية لمدة 3 أسابيع.
3. البروتينات التسمية
   1. مزيج 1 ميكرولتر من محلول الصبغة العمل في 12.5 ميكروغرام من البروتين. تصعيد حسب الحاجة. لمعايير المجمعة، إضافة 61؛ لتر من Cy2 حل العاملة إلى 300 ميكروغرام تجميع البروتين.
   2. دوامة لمدة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في 12000 ز س. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. وقف الوسم بإضافة 1 ميكرولتر من 10 ملي يسين في 1 ميكرولتر من محلول العمل المستخدمة. تخلط جيدا واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقيقة.
   3. تجمع صفت بشكل فردي عينات وتخلط مع العازلة الإماهة (7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 4٪ CHAPS، 1.2٪ destreak، 1٪ pharmalytes، برموفينول الأزرق). وسيبلغ اجمالي حجم يكون 125 ميكرولتر.
   4. عينات دوامة لمدة 30 ثانية، وتسمح عينات لتعيين في RT لمدة 30 دقيقة. تحميل 125 ميكرولتر من العينات على 7 سم درجة الحموضة 4-9، ISOELECTRIC التركيز (منتدى الطاقة الدولي) شرائط.
4. أولا البعد الكهربائي
   1. وضع أصحاب الشريط (توابيت) على لوحة إلكترود، والتأكد من أصحاب قطاع نظيفة تماما وجاف. ماصة 125 عينات ميكرولتر في تابوت، ونشر بالتساوي على نعش بأكمله.
   2. استخدام ينتفالتمرير، والتقاط قطاع منتدى الطاقة الدولي، بعناية إزالة الغطاء الواقي البلاستيك، ووضعه (الجانب جل أسفل) في المخزن نعش / الإماهة. تجنب احتباس فقاعات الهواء. ببطء ملء نعش (1-1،5 مل) مع الزيوت المعدنية ووضع التابوت يغطي على التوابيت.
   3. تبدأ ISOELECTRIC التركيز بعد بروتوكول في الجدول 2:
      ملاحظة: بمجرد تشغيل كاملة، قد يتم تخزين الشرائط في أنابيب بلاستيكية في -80 ^درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى موازنة والبعد الثاني.
5. البعد الثاني - الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE)
   1. موازنة
      1. ذوبان الجليد SDS عازلة موازنة (8 مل لكل قطاع، 6 M اليوريا، و 30٪ الجلسرين، 2٪ SDS). تزن خارج dithiothreitol (DTT و 10 ملغ DTT لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS). حل DTT إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      2. تزن خارج IAA (iodoacetamide، 25 ملغ IAA لكل 1 مل من العازلة موازنة SDS).حل IAA إلى 4 مل SDS عازلة موازنة.
      3. تذوب 1 مل ختم الحل الاغاروز في حمام مائي لاستخدامها لاحقا.
      4. إذا تم تجميد شرائح، تسمح لهم ذوبان الجليد تماما. مكان شرائط الجانب جل ما يصل إلى علبة reswelling. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع DTT إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
      5. تخلصي من كل المخزن المؤقت موازنة SDS مع التلفزيون الرقمي الأرضي. إضافة 4 مل من العازلة موازنة SDS مع IAA إلى كل قطاع واحتضان لمدة 15 دقيقة أخرى مع اهتزاز لطيف. بعد موازنة مع العازلة IAA، صب المخزن المؤقت موازنة SDS.
   2. SDS-PAGE
      1. بسط الهلام صغيرة، وإزالة المشط وشطف جل والآبار مع DDH ₂ O. إزالة الشريط الأبيض في الجزء السفلي من هلام قبل تشغيل. توجيه قطاع على هلام بشكل صحيح، والتوجه هلام هو أمر حاسم لقطع الفور.
      2. ضع شقة الجل على مواجهة مع لوحة صغيرة صعودا وهلام أعلى تواجه هxperimenter. وضع الشريط على لوحة طويل القامة مع نهاية انوديك (++ تنتهي مع الباركود) التي تواجه الجانب الأيسر من هلام. وباستخدام مسطرة، ودفع ببطء الشريط أسفل على سطح هلام. تجنب احتباس فقاعات الهواء بين القطاع وهلام. الوقوف على جل ما يصل في موقف لوحة من الزجاج.
      3. إضافة 1 مل من الملفات الساخنة حل ختم الاغاروز افتتاح الكاسيت. تأكد من الضغط على جميع فقاعات الهواء خارج باستخدام مسطرة شقة. تجميع الجهاز وتشغيل هلام في ثابت 125 فولت لمدة 90 دقيقة.
      4. عند انتهاء هلام التشغيل، وضع الجل على جهاز تصوير الجزيئية البيولوجية مع 2 مل ده ₂ O ومسح هلام في وضع الاستحواذ مضان مع 635 نانومتر ليزر الإثارة و 665 مرشح الانبعاثات نانومتر.
   3. بروتين فسفوري؛ فسوبروتين تلطيخ
      1. إصلاح هلام مع 50٪ الميثانول و 10٪ خليط حامض الخليك (10 مل) لمدة 30 دقيقة مرتين. يغسل مع 10 مل من الماء لمدة 10 دقيقة ثلاث مرات وصمة عار مع 10 مل بروتين فسفوري؛ فسوبروتين وصمة عار ل60-90 دقيقة، تليهاdestaining مع 10 مل يزيل اللون الحل لمدة 30 دقيقة ثلاث مرات.
      2. يغسل مع 10 مل من الماء 5 دقائق مرتين وصورة هلام مع ماسح ضوئي هلام الليزر في 532 نانومتر / 560 نانومتر الإثارة / الانبعاث.
   4. البروتين الهضم وتحديد
      1. المكوس جميع تفاضلي أعرب البقع البروتين من هلام في الآبار صفيحة باستخدام الروبوت بقعة منقار وفقا لمواصفات الشركة الصانعة، وإضافة 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (2 مل) لمدة 1 ساعة على RT ليزيل اللون القطع هلام. يذوى مع 2 مل 100٪ الأسيتونتريل يغسل مرتين والجافة في المكثف فراغ لمدة 30 دقيقة.
      2. ترطيب القطع هلام مع 100 ميكرولتر من 13 نانوغرام / التربسين الخنازير المعدلة ميكرولتر في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية. جمع supernatants وزيادة استخراج البروتينات مع 100 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic 5٪ في 50٪ الأسيتونتريل لمدة 30 دقيقة.
      3. التركيز على الببتيدات وصولا الى 5 ميكرولتر من فراغ الطرد المركزي تناسقRATOR وتحليل مع مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين - وقت الطيران - جنبا إلى جنب تحليل الطيف الكتلي (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

7. في المختبر كيناز الفحص

1. إعداد ركائز
   1. استنساخ الفرعي مجمع الأول (CI) مفارز (NDUFV1، NDUFV3، NDUFS2، NDUFB6، وNDUFA12)، التي يتم تحديدها كأهداف Cdk1 فسفرته تفاضلي، إلى pGEX-5X-1 ناقلات لتوليد الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) -tagged التعبير البكتيرية البلازميدات ^11. تنقية مفارز CI باستخدام أعمدة الجلوتاثيون عالية تقارب بعد بروتوكول أدناه.
      1. ثقافة GST-الموسومة CI فرعية تحتوي على كولاي سلالة BL-21 في مرق مع 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين في شاكر عند 37 ^درجة مئوية لوريا، Bertani (LB) حتى الكثافة البصرية (OD) من تم التوصل 0.6. إضافة الآيزوبروبيل BD-ثيو-galactopyranoside (IPTG) إلى عبادةلدى عودتهم إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم، واحتضان ل3 ساعة إضافية.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة لجمع البكتيريا وإعادة تعليق في 5 مل من 1 العازلة في برنامج تلفزيوني س تحتوي على 5 ملم من DTT، 1 × بروتين مثبط كوكتيل، و 0.1٪ الليزوزيم. ليز الخلايا عن طريق صوتنة لمدة عشرين 5 ثوان رشقات نارية، وإزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة.
      3. جمع طاف واحتضان مع حبات 4B-الجلوتاثيون الاغاروز في نسبة حجم 4: 1 (طاف: حبة) لمدة 1 ساعة على RT.
      4. أزل البروتينات GST الانصهار من الخرز مع 3 مل من العازلة الجلوتاثيون شطف (10 ملي الجلوتاثيون المختزل في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0) وإخضاع البروتينات مزال لغسيل الكلى في الجزيئي أنابيب غشاء مسامي (الوزن الجزيئي الحد الفاصل لل12 -14 kiloDaltons) مع 1 × PBS / 1 ملم EDTA. تخزين تنقية البروتينات في - 80 ^{درجة مئوية.}
2. Cdk1 كيناز الفحص
   1. قبل البدء في الحمار كينازعبد المنعم يوسف، تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية و 100 درجة مئوية. ذوبان التجاري CyclinB1 / Cdk1 مجمع انزيم وركائز على الجليد.
   2. تحضير مزيج رد فعل على الجليد. منذ تشارك ³² ف ATP النظير، وإعداد جميع مخاليط رد فعل في 1.5 مل أنابيب العينات مع قبعات المسمار تحتوي على حلقة O لمنع انتشار النشاط الإشعاعي.
      تحذير: اتبع قواعد حماية المواد المشعة. استخدام 8 مم زجاجي سميك يحمي والعمل على الأقل تجارية بحتة. مسح أسفل أي المنطقة الملوثة بالماء.
   3. إعداد عازلة رد فعل 30 ميكرولتر تحتوي على 1 × عازلة Cdk1 (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي MgCl2، 2 ملي DTT، 1 ملي EGTA، 0.01٪ بريج 35، ودرجة الحموضة 7.5)، 0.6 ملي اعبي التنس المحترفين البارد، 0.1 μCi ³² ف ATP، 2 وحدة من CyclinB1 / Cdk1 و 6 ميكروغرام من البروتين الركيزة. ضبط مستوى الصوت إلى 30 ميكرولتر مع ده ₂ O. رد فعل إيجابي السيطرة، استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1، وهي معروفة جيدا CyclinB1 / Cdk1 الركيزة.
      1. لكنترول السلبيةردود الفعل ل، (1) محل الركيزة مع بروتين ضريبة السلع والخدمات فقط و (2) استبدال الركيزة مع 0.01 ملي هيستون H1 + 0.5 ميكرومتر RO-3306، وهو Cdk1 مثبط انتقائي.
   4. تخلط جيدا مع ماصة وأجهزة الطرد المركزي لجلب كل السائل إلى أسفل الأنبوب، والتقليل من مخاطر التلوث. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
   5. إضافة 6 ميكرولتر من عينة العازلة 5X SDS لوقف التفاعل وتفسد على 100 ^{​​درجة} مئوية لمدة 10 دقيقة. تشغيل العينات على 10٪ هلام SDS-PAGE 160 V لمدة 2 ساعة، أو حتى أمام الصبغة قد وصل إلى نهاية هلام. نقل الجل على ورقة اللوني والتفاف مع غلاف بلاستيكي.
      تحذير: جميع السائل في اتصال مع النظائر المشعة يجب أن تعامل على أنها النفايات المشعة والتخلص منها في الدامجانة زجاجة بولي 5 غالون التي تقدمها خدمات الصحة والسلامة البيئية وفقا لتوجيهات المؤسسية.
   6. فضح هلام إلى فيلم الأشعة السينية لمدة 1 يوم أو ما يصل إلى 1 في الاسبوع في -20 ^درجة مئوية تبعا لنشاط محدد من النظائر المشعة المستخدمةوالانزيم.

8. الموقع الموجه الطفرات لتوليد Cdk1 سلبي المهيمن (D146N)

1. الاشعال تصميم الطفرات. اثنين الاشعال، مكملة لبعضها البعض، يحتوي على موقع متحولة (سيتم استبدال G التي كتبها A النوكليوتيدات إلى رمز ل N بدلا من مد الأحماض الأمينية) يحيط بها 20 قاعدة على كل جانب ^(11).
2. إعداد 50 ميكرولتر تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مزيج يحتوي على رد فعل العازلة 1X، 2.5 ملي dNTPs، 10 ميكرومتر الاشعال (على حد سواء إلى الأمام والخلف)، 40 نانوغرام من القالب، وده ₂ O. إضافة 2.5 U من البلمرة الحمض النووي في رد الفعل.
3. تشغيل البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية 3 دقائق و 95 درجة مئوية و 30 ثانية و 55 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، 68 ° C 6 دقائق. 16 دورات (ملاحظة: يتم تحديد 68 ° C فترة حضانة حسب حجم الحمض النووي مطلوب 1 دقيقة / كيلو بايت الحمض النووي ≤ 10 كيلوبايت لالحمض النووي أكبر، 2 دقيقة / كيلو بايت بالإضافة إلى 10 ثانية لكل دورة.). متابعة من قبل 68 ° C 7 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
4. إضافة2 ميكرولتر من DPN أنا انزيم التقييد (10 U / ميكرولتر) و 5.7 ميكرولتر DPN أنا العازلة، تخلط جيدا مع الصنبور لطيف مع إصبع واحتضان رد الفعل عند 37 ^درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
5. نقل 10 ميكرولتر DPN I-معاملة المنتجات PCR إلى 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة DH5α للتحول. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، تليها 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 ^درجة مئوية و 5 دقائق على الجليد. إضافة 500 ميكرولتر من LB ويهز عند 37 ^درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل الطلاء على لوحات LB-أجار. احتضان O / N عند 37 ^{درجة مئوية.}
6. اختيار مستعمرة من O / N نمت لوحات أجار باستخدام معقم الأصفر طرف ماصة، وانخفاض طرف في أنبوب يحتوي على 5 مل من LB، وتنمو O / N في 37 ^درجة مئوية شاكر. عزل البلازميد باستخدام طقم miniprep وتسلسل البلازميد لتأكيد طفرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

9. تحديد دورة الخلية المرحلة أطوال مع ايدو التأسيس الفحص

1. الفرز الخلية
   1. آرansfect 2 × 10 ⁵ الخلايا مع ناقلات المشار إليها (MTS-GFP / RFP، MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-WT-طلب تقديم العروض أو MTS-Cdk1-DN-RFP) في لوحة 6 جيدا باستخدام 1: 2 (ث: • 2.5 ميكروغرام: 5 ميكرولتر) نسبة الحمض النووي: ترنسفكأيشن الكاشف خليط أعد في 2.5 مل serum- والمضادات الحيوية وسائل الاعلام ثقافة خالية لمدة 48 ساعة. خلايا النوع الحية يعبرون عن مستقر البروتينات CyclinB1 GFP الموسومة Cdk1 والموسومة طلب تقديم العروض عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      1. غسل الخلايا مع 1 × برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من التربسين في صحن واحتضان عند 37 ^درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة لجمع الخلايا وتمريرها من خلال 70 ميكرون فلتر لتوليد تعليق خلية واحدة. غسل تعليق خلية واحدة مع 500 ميكرولتر من 1٪ الجنين العجل المصل في برنامج تلفزيوني (FCS / PBS) قبل تحميلها على قياس التدفق الخلوي.
      2. إعداد معلمات فرز التالية البروتوكولات المعمول ¹⁸ النابضة للخلايا إيجابية مزدوجة ملطخة كلا GFP وطلب تقديم العروض. جمع الخلايا مرتبة الخروج من الكريات إلى contai أنبوبنينغ زراعة الخلايا المتوسطة واستخدام هذه الخلايا لتحليل تقدم دورة الخلية مع وضع العلامات ايدو نبض مطاردة كما هو الحال في بروتوكول 9.2.
2. قياس طول دورة الخلية باستخدام الفحص ايدو وصفها التدفق الخلوي
   1. البذور فرز الخلايا في 6 لوحات بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 ⁵ خلايا لكل بئر والثقافة O / N عند 37 ^درجة مئوية في حاضنة CO _2. إضافة EDU إلى مستنبت بتركيز نهائي من 25 ميكرومتر. احتضان عند 37 ^درجة مئوية في حاضنة CO ₂ لمدة 1 ساعة.
   2. غسل الخلايا مع 1٪ BSA في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب 1.5 مل على فترات ساعة 2 ليصبح المجموع من 10 - 12 ساعة.
   3. خلايا الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل طاف. طرد بيليه وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت (المقدمة من قبل الشركة المصنعة داخل EDU الوسم عدة) لمدة 15 دقيقة في RT وتخلط جيدا.
   4. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إصلاحالخلايا مرة أخرى مع 0.5 مل من الايثانول 70٪ O / N عند 4 ^{درجة مئوية.}
      ملاحظة: تحديد الإيثانول أمر بالغ الأهمية لإرواء مضان GFP / RFP الداخلي نظرا لتعبير البروتين المؤتلف الموسومة.
   5. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 350 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل بيليه مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من العازلة permeabilization (0.1٪ تريتون-X-100، 1٪ BSA، 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في RT.
   6. غسل الخلايا مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 0.5 مل من الكوكتيل رد فعل في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان خليط التفاعل على RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
   7. تغسل مع 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني مرة واحدة والحمض النووي وصمة عار مع 50 ميكروغرام / مل يوديد propidium (PI) في 1 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني.
   8. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لمتابعة السكان EDU إيجابية. الحالية مبعثر مؤامرة نقطة من الخلايا المسمى EDU الملطخة عن محتوى الحمض النووي (تلطيخ PI، المحور السيني) وايدو (اليكسا 647 تلطيخ، العمودي).
      1. استخدام قناة APC لأليكسa647-EDU استخدام عصابة تمرير الترشيح 670/30 مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 685 نانومتر ضرب هذا المرشح. وفيكوإيريترين قناة (PE) لPI مع عصابة تمرير الترشيح 581/15 أمامه مع جميع الحاضرين خفيفة أقل من 600 نانومتر ضرب هذا المرشح.
      2. إدراج أول أنبوب يحتوي على الخلايا في التدفق الخلوي واستخدام استراتيجية النابضة القياسية لاقتناء: قطعة FSC المساحة X SSC-منطقة لالتشكل تليها PI (قناة PE) X Alexa647-EDU (قناة APC) عن تلطيخ الخلايا. تسجيل البيانات لجميع الأنابيب واحدا تلو الآخر الحصول على 10،000 الأحداث في العينة.
      3. تحديد توزيع مرحلة دورة الخلية من الخلايا وأطوال المرحلة باستخدام التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات التالية البروتوكولات المعمول ^11،30.

النتائج

التعريب شبه الميتوكوندريا من CyclinB1 وCdk1

يستخدم استخراج كربونات الصوديوم لتحديد ما إذا كان يقع على البروتين داخل الميتوكوندريا أو على السطح الخارجي، وهي الغشاء الخارجي. مرة واحدة يظهر ?...

Discussion

مثل البروتينات الموجهة للعضيات التحت خلوية أخرى، فإن البروتينات الميتوكوندريا المستهدفة تمتلك إشارات تستهدف ضمن الهيكل الأساسي أو الثانوي في أن توجيهها إلى عضية بمساعدة translocating بروتين معقد وآلات للطي ^21،22. الميتوكوندريا التي تستهدف تسلسل (MTS) تم الحصول عليها م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956