Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Özet

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Özet

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Giriş

Memelilerde, hücre döngüsü ilerlemesinin siklinlerin ve sikline bağımlı kinazların (cdk'lar) ¹ ile kontrol çok düzenli olaylar bağlıdır. Onun sitoplazmik, nükleer ve centrosomal lokalizasyon yoluyla, CyclinB1 / Cdk1 nükleer zarf arıza ve sentrozom ayırma ² olarak mitoz farklı etkinlikleri senkronize edebiliyor. CyclinB1 / Cdk1 apoptoz ³ karşı mitoz hücreleri korur ve mitokondriyal fisyon, yeni kurulan yavru hücreye ⁴ mitokondri eşit dağılımı için kritik bir adım teşvik etmektedir.

Memeli hücre çoğalmasına olarak mitokondriyal ATP 5 çoklu alt birim kompleksi oluşur oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) makinelerini (elektron nakil zinciri) ile oluşturulur; kompleks I - Karmaşık V (CI-CV). Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH): ubiquinone oksidoredüktazı ya da karmaşık I (CI), beş komplekslerinin ⁵ anlaşılan en az olur. karmaşık Cı45 alt birimden 14 onsists katalitik çekirdeğini oluşturur. Bir kez karmaşık bir kol matris ve iç zarı ^6,7 gömülü diğer kol içine çıkıntılı bir L şeklinde bir yapı varsayar toplandı. Cl alt birimleri mutasyonlar mitokondriyal bozuklukların ⁸ çeşitli nedenidir. OXPHOS işlevsel olarak etkili bir CI genel mitokondriyal solunum ^9, aynı zamanda, başarılı hücre döngüsü ilerlemesinin ¹⁰ için de gereklidir. Sağlıkta ve hastalıkta bu membran bağlı enzim kompleksinin işleyişini altında yatan mekanizmaları aydınlatmak yeni tanı yöntemleri ve gelişmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlayabilir. Yeni bir çalışmada, biz CyclinB1 / Cdk1 kompleksi hücrenin sırasında hücrelerin artan enerji ihtiyaçlarını karşılamak için (Gap 2) G2 / (Mitoz) M fazında mitokondri içine translocates ve potansiyel mitokondriyal enerji üretimini artırmak için CI alt birimleri fosforile bulduk döngüsü ^11. Burada shoDeneysel prosedürler ve aksi çekirdek / sitoplazmik kinaz mitokondriyal translokasyon incelemek için kullanılabilir stratejileri Mitokondriyal substratlar yanı sıra örnek olarak CyclinB1 / CDK1 kullanarak mitokondriyal yerelleştirme fonksiyonel sonuçlarını wcase.

gerekli mitokondri özgü aşırı ekspresyonu ve bu kompleksin demonte çalışmaları istendiğinde CyclinB1 / Cdk1 kompleksi mitokondri içine translocates bulgu. Proteinlerin mitokondriye özgü ekspresyonunu elde etmek için, tek bir ilgili proteinin N-ucunda bir mitokondri hedefleme sekansı (MTS) ekleyin. Dizileri hedef Mitokondri normalde ¹² ikamet mitokondri içine mitokondriyal proteinlerin sıralama izin verir. Bu CyclinB1 veya kırmızı flöresanlı etiketli insan sitokrom C oksidaz alt-birimi 8A (COX8) öncüsü elde edilen bir 87 baz mitokondri hedefleme sekansı kullanılabilir ve yeşil floresan proteini (GFP) içine klonladıkProtein (RFP) Cdk1 çerçeve içinde plazmaları ihtiva etiketli. Bu yöntem, özellikle nükleer havuz etkilemeden bu proteinlerin mitokondriyal ifadesini değiştirerek, bize mitokondri içine CyclinB1 ve CDK1 hedeflemesine izin. floresan bu proteinleri etiketleyerek, biz gerçek zamanlı olarak yerelleştirme izlemek için başardık. Benzer şekilde, bize özellikle CDK1 mitokondriyal ifade ve işlevleri yıkmak için izin RFP etiketli baskın negatif Cdk1 içeren bir plazmid içine MTS girmiştik. CDK1 gibi çift lokalizasyonu sahip kinazlar, mitokondri ve çekirdek fonksiyonları arasında ayırt etmek için gereklidir. Bu çift fonksiyonlu kinazlann, N-terminaline Mühendislik MTS kullanılabilir kolay ve etkili olan büyük bir strateji vardır.

Cdk1 bir hücre döngüsü kinaz olduğundan, Cdk1 mitokondri içine lokalize olduğunda hücre döngüsü ilerlemesini belirlemek için esastır. Bunu başarmak için, yeni bir yöntemii kullanmış olmasıd hücrelerde DNA içeriği izlemek için. Geleneksel yöntemler timidin yerine hücre döngüsünün S fazında yeni sentezlenmiş DNA içine içermektedir BrdU (bromodeoksiüridin), sentetik timidin analogu, kullanmayı içerir. Daha sonra aktif olarak kopyalayan DNA hücreler, anti-BrdU antikoru kullanılarak tespit edilebilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, sonuç ^13,14 arasında bir tutarsızlık ile sonuçlanabilir asit ya da ısı işlemi gibi sert yöntemlerle BrdU antikoru için erişim sağlamak için DNA denatürasyon gerektirmesidir. Alternatif olarak, biz farklı bir timidin analoğu, Edu ile aktif bölünen hücreleri izlemek için benzer bir yaklaşım kullanılmıştır. yumuşak deterjan işleme yeni sentezlenen DNA edu ulaşmak için saptama reajanı sağlayan şekilde edu algılama sert bir DNA denaturasyon gerektirmez. Edu yöntem daha güvenilir, tutarlı ve yüksek verimlilik analizi ¹⁵ potansiyeli olan kanıtlanmıştır.

Son olarak, to CDK1 mitokondriyal substratlar belirlemek, klasik iki boyutlu jel elektroforezi gelişmiş bir sürümüdür 2D-DIGE adında bir proteomik aracı kullanılır. İki boyutlu elektroforez ile birinci boyut ve molekül ağırlığı izoelektrik noktasına göre proteinleri ayıran. fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlar proteinlerin izoelektrik noktası ve moleküler ağırlık etkilediğinden, 2D jelleri farklı örnek içindeki proteinlerin fosforilasyon durumlarını arasındaki farkları belirleyebilir. protein boyutu (bölge ve yoğunluğu), birden çok örnekler arasında niceliksel karşılaştırılmasına izin veren, protein ekspresyon seviyesi ile değişiklik görür. Bu yöntemi kullanarak, mutant mitokondri hedefli Cdk1 eksprese eden hücreler karşı yabani tip fosforile proteinleri ayırt etmek mümkün oldu. Yabani tip gösterdi ama mitokondri hedefli mutant Cdk1 hazırlık eksik spesifik protein spotları izole edildi vekütle spektrometresi aracılığıyla belirledi.

Geleneksel 2D jelleri içinde, trifenilmetan boyalar jeli üzerinde proteinleri görselleştirmek için kullanılır. 2D-DIGE proteini elektroforetik mobilite üzerine minimal etkisi ile floresan protein etiketleri kullanır. Farklı protein numuneleri farklı floresan boyalar, karıştırılır ve tek bir jel ¹⁶ üzerinde birden çok numune eş elektroforez sağlayan aynı jeller ayrılmış ile etiketlenebilir. Bu jel bazlı proteomik çalışmalarda önemli bir problemdir jel için jel varyasyonları en aza indirir.

Protokol

Kültür Hücrelerinin gelen Mitokondri 1. İzolasyonu

1. Hücreler (IBC) Tampon izolasyonu Tampon Hazırlanması
   1. Hazırlama 0.1 M Tris / MOPS (tris (hidroksimetil) aminometan / 3- (N-morfolino) propansülfonik asit) toplam damıtılmış su ekleyin, MOPS toz kullanılarak 7.4 pH ayarlamak, damıtılmış su 800 ml Tris 12.1 g çözündürülür 4 ^o C'de 1 L ve mağaza hacmi
   2. 0.1 M EGTA (etilen glikol bis (2-aminoetil eter) tetraasetik asit), Hazırlama / Tris: 1 L'lik bir toplam hacme distile su ilave Tris toz kullanılarak 7.4 pH ayarlamak, damıtılmış su 800 ml EGTA 38.1 g çözündürülür ve 4 ^o C'de saklayın
   3. 1 M sukroz hazırlayın: damıtılmış su, 100 ml sukroz 34.23 g çözündürülür, ^o C -20 ° C'de 20 ml'lik numuneler ve depolayın
   4. Tampon _C, 0.1 M Tris / MOPS, 10 ml ve 20 ml 0.1 M EGTA / Tris, 1 ml ekleyerek IB 100 ml hazırlayın: IB _C tamponu hazırlayın1; M sükroz. 100 ml'lik toplam hacme kadar damıtılmış su ilave edilir. PH 7.4 ayarlayın.
2. Hücre Liziz Tamponu hazırlanması
   1. 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA (etilen diamino tetraasetik asit), 1mM EGTA ihtiva eden liziz tamponu,% 1 Triton-X-100, 1 mM β- 2.5 mM sodyum pirofosfat, gliserofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat. hemen kullanımdan önce proteinaz inhibitörleri 1 ug / ml Löpeptin ve 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florit) ekleyin.
3. Mitokondri İzolasyonu
   1. Hasat 3 buz soğukluğunda 1 x PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su) x 10 ⁷ hücreleri, pH 7.4 ve santrifüj hücreler 10 dakika boyunca 600 x g'de 4 ° C'de ^o Süpernatantı atın ve 5 ml buz IB _c tampon pelet yeniden askıya.
   2. yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam / cam doku öğütücü kullanılarak hücreler homojenize edilir. 10 mil için 600 xg 15 ml tüp ve santrifüj Homojenat aktarın4 ^o C'de n cam / cam doku öğütücü daha mitokondri daha az zarar olduğu gibi fonksiyonel mitokondri için, cam / teflon bağlantı kullanmak.
   3. 4 ^O ° C'de 10 dakika boyunca 7000 x g'de 1.5 ml tüpler içinde süpernatan ve santrifüj toplamak 1.5 ml tüp süpernatantı aktarın ve sitozol protein olarak kaydedin.
   4. 4 ^O ° C'de 10 dakika boyunca 7000 x g'de 200 ul buz soğukluğunda IB _C tamponu ve santrifüj ile iki kez pelet (mitokondri) yıkayın
   5. Süpernatantı atın ve hücre lizis tamponu pelet yeniden askıya ve hemen kullanmak veya ileride kullanılmak üzere -80 ^o C'de saklayın. Fonksiyonel mitokondri ihtiyaç varsa, süpernatant atarak sonra kalan tampon pelet yeniden askıya. mitokondriyal fraksiyon daha seyreltilmesi mitokondri fonksiyon kaybına neden olabilir. buz üzerinde saklayın ve 1 hazırlık kullanmak - En iyi sonuçlar için 3 saat.
   6. Bir otuz 3-sek patlamaları için yeniden süspansiyon haline pelet sonikasyonBuz banyosu, 5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ve mitokondriyal fraksiyon olarak supernatant kaydedin.

Cdk1, CyclinB1 ve COXIV, bir Mitokondriyal Yerleşik Protein 2. Eş-immün

1. 24 oyuklu plakalar, O / N ya da en fazla% 70 birbirlerinin içine lamelleri 5 x 10 ⁴ hücrelerini büyütün. orta aspire ve 500 ul buz gibi soğuk 1 x PBS, pH 7.4 ile iki kez yıkama hücreleri.
2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 500 ul buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak. Sabitleme çözeltisi aspire ve 500 ul 1 x PBS 3 kez, 5 dakika, oda sıcaklığında nazik çalkalama ile, her hücreleri yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 ul PBS içinde% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. solüsyonu aspire ve 500 ul PBS ile hücreler 3 kez, her biri 5 dakika yıkanır. bloke solüsyonu (500 ul PBS,% 1 Tween 20 ihtiva eden% 1 BSA (Sığır Serumu Albümini)), oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı.
4. 250: Birincil antikorların 1 seyreltin (v: v) 5001 çapraz sinyalizasyon önlemek için farklı türlerde ortaya istenen primer antikorlar ile hücrelerin çözüm engelleme ve inkübe l (CyclinB1 (fare) ve 30 RT'de COXIV (tavşan) veya Cdk1 (fare) ve COXIV (tavşan) - 60 dakika ya da O / N 4 ^o C'de
5. 1 x PBS 3 kez 500 ul, her biri 5 dakika ile lamelleri yıkanır ve daha sonra 1 seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe PBS 500 ul, 3 kez her biri 5 dakika yıkama ve ardından 1 saat boyunca oda sıcaklığında çözelti bloke 500 ul 1.000.
6. anti-solmaya montaj çözümü 20 ul lamelleri monte edin ve oje ile slaytlar mühür. 2 hafta - hemen veya bir floresan mikroskop kullanılarak slaytlar 1 4 ^o C'de karanlıkta tutmak görüntü.

Bozulmamış Mitokondri 3. Sodyum Karbonat Ekstraksiyon

1. Bölüm 1. Böl mitokondriyal açıklandığı gibi hasat, bir kez PBS ile yıkayın ve mitokondri izole, yaklaşık 20 x 10 ⁷ hücre büyür iki par içine izolatlarının(Adım 1.3.4 öncesi) mitokondri pelet son santrifüj önce ts; yarım toplam mitokondri (aşama 3.2) olarak kullanılmak üzere kaydetme, çözünebilir ve zara bağlı proteinleri ayırmak için (3.3-3.6 adımları) sodyum karbonat ekstraksiyonu için diğer yarısı kullanın.
2. Lyse toplam mitokondri hücre lizis tamponu 30 ul pelet ve immunoblotting kullanılıncaya kadar -80 ^o C'de lizat saklayın.
3. Mitokondriyal pelet diğer yarısı, 0.1 M _Na-2 CO ₃ (sodyum karbonat), pH 11.0, 250 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
4. 20 dakika boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant toplayın ve 3.5 adıma geçin. Parçalayıcı aşama 1.3.6 gibi hücre parçalama tamponu ve sonikasyon 30 ul kullanılarak pelet. Immunoblotting kullanılana kadar -80 ^o C'de saklayın.
5. proteinleri çökeltmek ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutmak için süpernatan% 20 taze trikloroasetik asit (TCA) eşit hacim.
6. Santrifüj10 dakika için 15,000 x g'de Uge. Süpernatantı atın immunoblotting kullanılıncaya kadar -80 ^o C'de hücre parçalama tamponu ve mağaza 80 ul pelet çözülür.

Mitokondri iç ve Dış Membranlar (Mitoplasts İzolasyonu) 4. Ayırma

1. Yaklaşık 20 x 10 ⁷ hücreleri hasat büyümek kez PBS ile yıkayın ve (Adım 1.3.4 öncesi) mitokondri pelet son santrifüj işleminden önce 10 eşit parçaya bölümünde 1. Ayrı mitokondriyal kesirler açıklandığı gibi mitokondri izole.
2. hipotonik sukroz tamponu belirtilen konsantrasyonu 30 ul her bir pelet çözülür (1 mM EDTA, 10 mM MOPS / KOH (potasyum hidroksit), pH 7.2, sükroz konsantrasyonu, 25 arasında değişen - 200 mm) ya da (ug / ml tripsin 50 ug olmayan Tablo 1 'e bakınız) ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir.
3. t durdurmak için şişeleri içeren tripsin (1 mM PMSF bir son konsantrasyon elde etmek üzere), 10 mM PMSF 3 ul ekleO ise tripsin hazmından ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
4. 10 dakika için 4 ^o C'de 14.000 x g'de santrifüj. ^O C -80 ° C'de, yeni bir tüp içine süpernatant transfer adımı 1.3.6 gibi hücre parçalama tamponu, sonikasyon 30 ul pelet lize etmek ve saklamak

5. İnşaat Mitokondri hedefli GFP / RFP etiketli CyclinB1 / Cdk1 Vektörler ve Bunların Mitokondriyal Yerelleştirme Onayı

1. pEGFP-N1 ya pERFP Nhel ve BamHI sitelerinde GFP N-terminal veya RFP içine çerçeve içinde - (161 nükleotid arasında, insan sitokrom C oksidaz alt-birimi 8A (COX8 öncüsü elde edilen) 76 MTS) dizisini hedefleme mitokondri Clone standart molekül klonlama teknikleri kullanılarak -N1 vektörler.
2. CyclinB1 ve Cdk1 genler için PCR primerleri tasarlarken, PCR primerleri 5 '(kalın) BamHI sınırlama enzimi belirleme bölgeleri eklemek.
   İleri Cdk1 BamH15 'CAG T GG ATC C AA TGG AAG ATT ATA CCA AAA T
   Cdk1 BamH1 5 'CTG T GG ATC C TG CAT CTT CTT AAT CTG ATT Ters
   İleri CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CAA TGG CGC TCC GAG TCA
   CyclinB1 BamH1 5 'ATA TGG ATC CTG CAC CTT TGC CAC AGC C Ters
3. standart teknikler aşağıdaki bu primerleri kullanılarak Cdk1 ve CyclinB1 genlerini yükseltin. 2 saat boyunca 37 ° C 'de BamHI kısıtlama enzim 1 ul PCR ürünleri Digest. bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirimi ürünlerinin çalıştırın. Bir traş makinesi bıçak kullanarak, doğru ölçülü DNA parçalarını kesmek ve bir jel ekstre etme kiti kullanılarak jelden DNA arındırmak.
4. 2 saat boyunca 37 ° C'de MTS-pEGFP-N1 ve BamHI enzim 1 ul MTS-pERFP-N1 plasmidlerin 1 ug Digest. Buzağı-İNTES 1 ul ekleyin37 ° C'de 30 dakika boyunca intestinal alkali fosfataz (CİP). bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirimi ürünlerinin çalıştırın ve Aşama 5.3 olarak jelden lineer plazmidler saflaştırılması.
5. Aşama 5.4 ve Aşama CDK1 ve CyclinB1 5 ul arasında ligaz tamponu 5.3 ila 3 ul T4 ligaz 0.5 ul ve DH ₂ O 20.5 ul plasmid 1 ul ekleyerek bir ligasyon reaksiyonu başlatacak 4 ° C'de O / N inkübe edin.
6. 10 mg ile bakteriler, standart teknikler, aşağıdaki ligasyon karışımı 10 uL E. coli DH5α yetkin hücrelerini dönüştürmek ve büyümek / ml kanamisin ihtiva eden koloniler elde etmek için 37 ° C'de LB agar levhaları O / N.
7. O bir koloni ortaya çıkarmak / steril bir pipet kullanarak N yetiştirilen plakaları, kanamisin-LB içeren tüp 5 ml ucu yerleştirin ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. üreticinin protokolüne uygun olarak miniprep kitleri kullanılarak plazmid izole, ve standart teknikler kullanılarak plazmid dizisi.
8. katlanarak büyüyen MCF1 transfekte2 (a: h, 100 ng 1 bir plasmid / transfeksiyon ayıracı oranı hazırlanması Adım 5.7 MTS-Cdk1 RFP veya MTS CyclinB1-GFP plazmidler ile 0A hücreleri (1.5 x 10 ⁴ hücre 96 oyuklu plakalar üzerine tohumlandı) : 100 ul serum- ve antibiyotik içermeyen ortam içinde 0.2 ul).
9. Nem kontrolü (% 5 _CO2 ve% 95 bağıl nem) bir _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 48 saat boyunca plazma / reaktif karışımı hücreleri inkübe edin.
10. DMSO, 100 ul bir toz, 50 ug çözündürülmesiyle mitokondriyal kırmızı ve yeşil floresan boyalar 1 mM stok çözelti hazırlayın. stok solüsyonları 1 seyreltin: 400 1x PBS çözümler çalışan 2.5 mcM elde etmek. stok çözeltileri, bir yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
11. 50 nM nihai konsantrasyon hazırlamak için kültür ortamı 98 ul kırmızı boya 2.5 uM 2 ul karıştırın.
12. kırmızı boya 2 dakika boyunca orta içeren (adım 5.8 oluşturulan) MCF10A taşıyan hücrelerin CyclinB1-GFP hücre kültür ortamı değiştirin. TekrarlaCdk1-RFP taşıyan MCF10A hücreleri için yeşil boya ile aynı prosedür.
13. , Fazla boyama solüsyonu kurtulmak 96 oyuklu plakaya PBS 1X 100 ul 100 ul 1 x PBS ile iki kez yıkanır.
14. ve Cdk1 RFP (565 560 nm ve emisyon ile uyarma - 620 nm), 40X büyütme ile floresan mikroskop altında 96 oyuklu plakalar üzerinde - mitokondri ve CyclinB1-GFP (536 nm, 488 nm ve emisyon 494 de uyarılma) görselleştirme.

2D-DIGE ile Farklı Olarak fosforillenmiş proteinlere 6. tanımlanması

1. Örnek hazırlama
   1. mitokondri izole edin ve Adım 1.3 gibi mitokondriyal kesirler lyse. 15 sn için her bir örnek ve vorteks% 20 TCA (su içinde trikloroasetik asit) eşit hacim. proteinler çözeltiden çökelebilir 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
   2. Santrifüj örnekleri, ardından 5 dakika boyunca 4 ° C'de 9,300 x g'de, süpernatant kaldırmak ve 60 ul soğuk aseton (% 100) ekleyin de5 dakika boyunca 4 ° C'de 9,300 x g'de santrifüj.
   3. Aseton yıkama adımı (adım 6.1.2) bir kez daha tekrar süpernatant kaldırmak ve 50 ul DIGE markalama tamponu (7 M üre, 2 M tioüre,% 4 CHAPS, 30 mM Tris, pH 8.5) 'de numuneler yeniden askıya.
2. Floresan boyalar hazırlanması
   1. stok çözelti hazırlayın: 1 nmol / ul nihai konsantrasyona kadar taze dimetil formamid (DMF), 5 ul boyalar (5 nmol) çözündürülür. Bir kaç ay için kullanılana kadar -20 ^o C'de stok boya çözeltisi saklayın.
   2. çalışma çözeltisi hazırlayın: boya, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ayarlamak için izin verin. 200 pmol / ul nihai konsantrasyona DMF 4 ul boya 1 ul seyreltilir. Kullanım sırasında buz üzerinde tutun. Not: çalışma çözeltisi 3 hafta boyunca -20 ^o C'de muhafaza edilebilir.
3. etiket Proteinler
   1. 12.5 mikrogram protein başına boya çözeltisi çalışma 1 ul karıştırın. Gerektiği gibi büyütmek. toplanmış standartları için 6 eklemek1 'dir; protein toplanmış 300 ug, Cy2'nin hazır çözeltinin l.
   2. 12,000 x g'da 30 saniye boyunca 4 ° C 'de 30 saniye ve santrifüj vorteksleyin. 30 dakika daha karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. kullanılan çalışma çözeltinin 1 ul başına 10 mM lisin 1 ul ekleyerek etiketleme durdurun. İyice karıştırın ve 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin.
   3. Havuz ayrı numuneler etiketlenir ve rehidrasyon tamponu (7 M üre, 2 M tioüre,% 4 CHAPS,% 1.2 destreak,% 1 pharmalytes, bromofenol mavi) ile karıştırın. Toplam hacim 125 ul olacak.
   4. Vorteks 30 saniye boyunca numune ve numuneler, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında ayarlamak için izin verir. Yük 7 cm pH 4 üzerine numunelerin 125 ul - 9, izoelektrik odaklama (İEF) şeritler.
4. İlk Boyut Elektroforez
   1. şerit sahipleri tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olun, elektrot plaka üzerinde şerit tutucuları (tabut) yerleştirin. Tüm tabut boyunca eşit yayılan bir tabut içine 125 ul örnekleri pipetle.
   2. Tweeze kullanarakrs, dikkatle İEF şerit pick up plastik koruyucu kapağı çıkarın ve tabut / rehidrasyon tamponu içine (aşağı jel tarafı) yerleştirin. Hava kabarcıklarını yakalama kaçının. Yavaşça tabutu doldurmak - mineral yağ ile (1 1.5 ml) ve tabut tabut üzerine kapakları yerleştirin.
   3. Tablo 2'de protokol takip izoelektrik odaklama başlayın:
      Not: Çalışma tamamlandıktan sonra, şeritler -80 ^o C'de plastik tüplerde depolanır veya doğrudan dengeleme ve ikinci boyuta taşındı olabilir.
5. İkinci Boyut - Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)
   1. Dengeleme
      1. SDS dengeleme tamponu (şerit başına 8 ml 6 M üre,% 30 gliserol,% 2 SDS) çözülme. ditiotreitol tartılır (DTT SDS dengeleme tamponu 1 ml başına 10 mg DTT). 4 mi SDS dengeleme tamponu içine DTT içinde çözülür.
      2. IAA (iodoasetamid, SDS dengeleme tamponu ile 1 ml başına 25 mg IAA) tartılır.4 mi SDS dengeleme tamponu içine IAA çözündürülür.
      3. daha sonra kullanılmak üzere bir su banyosu içinde agaroz çözeltisi sızdırmazlık 1 ml eritin.
      4. şeritler dondurulmuş olsaydı, onları tamamen çözdürün izin verin. Yeri nedeniyle büzülme tepsisine yukarıya jel tarafını soyarak. Her bir şerit, DTT ile SDS dengeleme tamponu 4 ml ilave edilir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edin.
      5. DTT ile tüm SDS dengeleme tampon kapalı dökün. Her bir şerit IAA SDS dengeleme tamponu 4 ml ilave edilir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika daha inkübe edilir. IAA tamponu ile dengelendikten sonra, SDS dengeleme tamponu dökün.
   2. SDS-PAGE
      1. Mini jeller paketini tarak kaldırmak ve jel ve GKD ₂ O. ile kuyu durulayın çalıştırmadan önce jelin alt kısmında beyaz bandı çıkarın. doğru jel üzerinde şerit yönlendirmek, jel oryantasyon nokta kesim için kritik öneme sahiptir.
      2. kadar olan küçük plaka ve jel üst bakan, e ile tezgahın üzerine jel düz yerleştirinxperimenter. anodik ucu ile uzun boylu tabağa şeridi Lay jel sol tarafına bakan (++ barkodlu sona). Bir cetvel kullanarak, yavaş yavaş jel yüzeyine aşağı şerit itin. şerit ve jel arasındaki hava kabarcığı kaçının. Bir cam levha stand jel yukarı durun.
      3. kasetinin açılması sıcak mühürleme agaroz çözeltisi 1 ml. Tüm hava kabarcıkları düz cetvel kullanılarak basıldığında emin olun. cihaz monte edin ve 90 dakika boyunca sabit bir 125 V jel üzerinde çalıştırıldı.
      4. Jel çalışmasını bitirdiğinde, 2 ml GKD ₂ O ile biyomoleküler kamera üzerinde jel yerleştirin ve 635 nm uyarma lazer ve 665 nm emisyon filtresi floresan edinim modunda jel tarayın.
   3. phosphoprotein Boyama
      1. iki kez 30 dakika için% 50 metanol ve% 10 asetik asit karışımı (10 mL) ile jel sabitleyin. ardından, 90 dakika - 10 mi 60 leke fosfoprotein 10 dakika süreyle 10 ml su ile üç kez ve leke yıkayın30 dakika için üç kez çözeltiye destain 10 ml lekenin.
      2. 532 nm / 560 nm uyarma / emisyon bir lazer jel tarayıcı ile jel 5 dk kez 10 ml su ile yıkayın ve görüntü.
   4. Protein sindirimi ve Kimlik
      1. Tüketim diferansiyel her üreticinin talimatlarına uygun olarak bir robot nokta seçici mikrolevha kullanılarak kuyu içine jel protein noktalar şeklinde ifade ve jel parçaları destain için oda sıcaklığında 1 saat süreyle 100 mM amonyum bikarbonat (2 mi) ilave edin. 30 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcısı içinde iki kez kuru yıkama 2 ml% 100 asetonitril ile kurutmak.
      2. 37 ° C'de 16 saat süre ile 50 mM amonyum bikarbonat içinde 13 ng / | il modifiye domuz tripsin 100 ul jel parçaları rehidrate. Süpernatantlar toplamak ve 30 dakika daha% 50 asetonitril içinde% 5 trifloroasetik asit 100 ul protein ekstrakte edin.
      3. Vakum santrifüj concent aşağı 5 ul peptidler Konsantreesyasi ve Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Destekli Matrix ile analiz - Flight Time - tandem Kütle Spektrometre analizi (MALDI TOF-MS / MS) ^17.

Vitro kinaz deneyi 7.

1. Substratlar hazırlanması
   1. pGEX-5X-1 vektörüne farklı olarak fosforilatlanmış Cdk1 hedefleri olarak tanımlanır alt klonu Kompleks I (CI) alt birimi (NDUFV1, NDUFV3, NDUFS2, NDUFB6 ve NDUFA12), glutation-S-transferaz (GST) etiketli üretmek için bakteriyel ekspresyon ¹¹ plazmidler. Aşağıdaki protokol, aşağıdaki yüksek afiniteli glutatiyon kolonları kullanılarak Cl alt birimleri arındırın.
      1. Kültür 0.6 ulaşıldı arasında bir optik yoğunluğa (OD) kadar Luria-Bertani (LB) 37 ^o C'de bir çalkalayıcı ampisilin, 50 ug / ml suyu Escherichia coli soy BL-21 ihtiva eden Cl altbirimini GST etiketli. kültüne izopropil-BD-tiyo-galaktopiranosid (IPTG) ekleyin0.1 mM'lik bir son konsantrasyonda ure ve fazladan bir 3 saat daha inkübe edilir.
      2. bakterileri toplamak ve 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj 5 DTT 5 mM, 1 x proteinaz inhibitörü kokteyli içeren 1 x PBS tamponu mi, ve% 0.1 lizozim yeniden askıya. Lyse yirmi 5 s patlamaları için sonikasyon ile hücreler ve 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak.
      3. Süpernatant toplayın ve 4 hacim oranında glutation-agaroz 4B boncuklarla inkübe: oda sıcaklığında 1 saat için: (boncuk süpernatant) 1.
      4. glütation elüsyon tamponu 3 ml boncuklardan GST-füzyon proteinleri elüte (molekül ağırlığı kesme 12 molekül gözenekli membran boru içinde diyalize ayrıştırılan proteinleri (10 mM, 50 mM Tris-HCI, pH 8.0 içinde indirgenmiş glutation) ve konu 1 x PBS / 1 mM EDTA -14 kilodalton). 80 ^o C - en saflaştırılmış proteinlerin Mağaza
2. CDK1 Kinaz Deneyi
   1. kinaz eşek başlamadan önceAy, 30 ° C ve 100 ° C'ye ısıtılarak engeli. Çözülme ticari CyclinB1 / Cdk1 enzim kompleksi ve buz üzerinde yüzeyler.
   2. Buz üzerinde, reaksiyon karışımı hazırlayın. ^32P ATP izotopu dahil olduğu için, radyoaktivite yayılmasını önlemek için bir O halkası içeren vidalı kapaklarla 1.5 ml'lik bir numune tüpleri içinde bütün reaksiyon karışımları hazırlayın.
      Dikkat: radyoaktif madde koruma kurallarını uygulayın. En azından bir kol boyu 8 mm kalınlığında koruyucu Pleksiglas ve çalışmayı kullanma. su ile herhangi bir kontamine bölgeyi silin.
   3. 1 x Cdk1 tamponu (50 mM Tris-HCI, 10 mM MgCI2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA,% 0.01 Brij 35, pH 7.5), 0.6 mM soğuk ATP, 0.1 uCi ^32P ATP ihtiva eden bir 30 ul reaksiyon tamponu hazırlayın 2 CyclinB1 / CDK1 birimleri ve yüzey proteininin 6 ug. GKD ₂ O. ile 30 ul ses seviyesini ayarlamak Pozitif kontrol reaksiyonu için 0.01 mM Histon H1, iyi bilinen bir CyclinB1 / Cdk1 alt-tabaka ile alt tabaka değiştirin.
      1. Negatif contro içinl reaksiyonları, (1) ya da GST yalnızca protein ve (2) + 0.5 uM RO-3306 0.01 mM Histon H1, seçici bir Cdk1 inhibitörü ile alt-tabakanın yerini ile birlikte alt-tabakanın yerini.
   4. kirlenme riskini en aza indirmek, tüpün dibine tüm sıvı getirmek için pipet ve santrifüj ile iyice karıştırın. 60 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   5. Reaksiyonu durdurmak ve 10 dakika boyunca 100 ^° C'de denatüre 5x SDS örnek tampon 6 ul ekle. 2 saat 160 V% 10 SDS-PAGE jel örnekleri çalıştırın, ya da boya ön kadar jelin sonuna ulaşmıştır. bir kromatografi kağıdı üzerine jel aktarın ve plastik wrap ile sarın.
      Dikkat: Radyoizotoplarla ile temas eden tüm sıvı radyoaktif atık olarak işlem ve kurumsal rehberlere göre çevre sağlığı ve güvenliği hizmetleri tarafından sağlanan 5 galonluk poli damacana olarak imha edilmelidir.
   6. 1 gün boyunca X-ışını filmine jel ortaya çıkarma radyoizotopun spesifik aktivitesi ile ilgili olarak 1 hafta kadar -20 ^oC kullanılanve enzim.

8. mevkiye-yönelik mutagenez Dominant Negatif CDK1 (D146N) oluşturmak üzere

1. Tasarım mutajenez primerleri; birbirlerine tamamlayıcı olan iki primer, mutant bölgesi içeren her iki tarafında ¹¹ 20 bazlar ile çevrili (G, N yerine D amino asidi kodlamak için bir nükleotid değiştirilir).
2. 50 ul Polimeraz Zincir Reaksiyonu 1x reaksiyon tampon içeren (PCR) karışımı, 2.5 mM dNTP, 10 primerlerin uM (ileri hem de geri), şablonun 40 ng ve GKD ₂ O hazırlayın reaksiyona DNA polimerazı 2.5 U ekleyin.
3. Aşağıdaki PCR programı çalıştırmak: 95 ° C 3 dakika, 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 dakika, 68 ° C'de 6 dakika; 16 döngü (Not: 68 ° C inkübasyon süresi DNA boyutu tarafından belirlenir 1 dak / kb 10 kb ≤ DNA için gerekli olan daha büyük bir DNA, 2 dakika / kb artı döngü başına 10 sn.).. 68 ° C, 7 dakika ile izleyin ve kullanımı için hazır olana kadar 4 ° C'de tutun.
4. eklemekBen tampon Dpn I restriksiyon enzimi (10 U / ul) ve 5.7 ul DPN 2 ul, parmakla hafif dokunuşla iyice karıştırın ve 1 saat süreyle 37 ^o C'de reaksiyonu kuluçkaya yatmaktadır.
5. Aktarım 10 ul Dpn transformasyonu için DH5α yetkin hücre 50 ul halinde PCR ürünleri ile tedavi. 42 ^o C'de 45 saniye ısı şoku, ardından 30 dakika buz üzerinde 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. LB 500 ul ekleyin ve LB-agar plakaları üzerine kaplama önce 1 saat süreyle 37 ^o C'de çalkalanır. 37 ^o C de O / N inkübe
6. O bir koloni seçin / N steril sarı pipet kullanarak agar plakaları yetiştirilen, LB 5 ml içeren bir tüp içine ucu açılan ve 37 ^o C çalkalayıcı O / N büyür. Bir miniprep kiti kullanılarak plazmid izole etmek ve üreticinin protokolüne uygun olarak değişimi tespit etmek plazmid dizisi.

Edu Ortaklığımız Testi ile Hücre Döngüsü Faz Uzunlukları 9. Belirlenmesi

1. Hücre Ayırma
   1. Transfect gösterilen vektörler ile 2 x 10 ⁵ hücre (MTS-GFP / TTT MTS-CyclinB1-GFP / Cdk1-wt RFP veya MTS Cdk1-DN-RFP) 1 ile 6-çukurlu plaka içindeki: 2 (ağ: hac 2.5 ug: DNA 5 ul) oranı: Transfeksiyon Reaktif 48 saat boyunca 2.5 mi serum- ve antibiyotik içermeyen kültür ortamı içinde karışım hazırlanmıştır. Canlı sıralama hücreleri stabil akış sitometresi aracılığı ile GFP etiketli Cdk1 ve RFP etiketli CyclinB1 proteinleri ifade.
      1. 1 x PBS ile yıkayın hücreleri çanak içine tripsin 100 ul eklenir ve 5 dakika boyunca 37 ^{C 'de} inkübe edilir. hücreleri toplamak ve tek bir hücre süspansiyonu üretmek için 70 um'lik bir filtreden onları geçmek için kültür ortamı 2 ml ilave edilir. akış sitometresi üzerinde yüklemeden önce PBS (FCS / PBS) içinde% 1 fetal buzağı serumu, 500 ul tek bir hücre süspansiyonu yıkayın.
      2. Kurulan protokolleri GFP ve RFP hem boyanmış çift pozitif hücreler için ¹⁸ yolluk aşağıdaki sıralama parametrelerini ayarlamak. sıralanmış hücreler tüp contai içine Sitometre çıkan toplamakNing hücre kültür ortamı ve protokol 9.2 olarak edu Darbe kovalayıcı etiketleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin analiz için bu hücreleri kullanır.
2. Edu Etiketleme Sitometrisi Test kullanma Hücre Döngüsü Uzunluğu Ölçümü
   1. Bir _CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ^C 'de de Kültür O / N başına 2.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalarda Tohum kriteri hücreleri. 25 uM'lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına edu ekleyin. 1 saat boyunca bir CO ₂ inkübatör 37 ^o C'de inkübe edin.
   2. 500 ul PBS içinde% 1 BSA ile hücrelerden yıkayıp 10 toplam 2 saatlik aralıklarla, 1.5 ml bir tüp içinde toplayan - 12 saat süredir.
   3. Santrifüj hücreleri 5 dakika boyunca 350 xg'de, süpernatant atın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (edu etiketleme kiti içinde üretici tarafından sağlanan) tespit eden bir çözelti, 100 ul ekleyerek pelet çıkarmak ve iyice karıştırın.
   4. PBS üç kez% 1 BSA, 1 ml hücreleri yıkayın. düzeltmekHücreler tekrar 4 ^O ° C'de% 70 etanol O / N, 0.5 ml
      Not: Etanol sabitleme bağlı yeniden birleştirici etiketli protein ekspresyonu, iç GFP / RFP floresan sönmesi için kritik öneme sahiptir.
   5. 5 dakika boyunca 350 x g hızında tekrar hücreleri santrifüj ve bir kez PBS içinde 1 ml% 1 BSA ile pelet yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca permeabilizasyon tamponu (PBS içinde% 0.1 Triton-X-100,% 1 BSA, 0.2 mg / ml RNase A) 1 ml hücrelerin yeniden askıya.
   6. bir kez PBS içinde% 1 BSA, 1 ml hücreleri yıkayın. Her bir tüpe, reaksiyon kokteyl 0.5 mL ekleyin ve iyice karıştırın. Karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı inkübe edin.
   7. PBS içinde 1 ml% 1 BSA içinde 50 ug / ml propidyum iyodür (PI), 1 kez PBS içinde% 1 BSA ilave edildi ve leke DNA ile yıkayın.
   8. Edu-pozitif nüfusu takip flow sitometri hücreleri analiz edin. DNA içeriği için boyanmış Edu-işaretli hücrelerin (PI boyama, X ekseni) ve Edu (Alexa 647 boyama, Y ekseni) Mevcut dağılım nokta arsa.
      1. Alex için APC kanalı kullanıntüm ışık varken bu filtreyi isabet az 685 nm bir 670/30 bant geçiren filtre kullanan A647-Edu; tüm ışık mevcut bu filtreyi isabet az 600 nm önünde bir 581/15 bant geçiren filtre ile PI ve fikoeritrin (PE) kanal.
      2. flow sitometri içine ilk tüp içeren hücreleri takın ve satın alma için bir standart yolluk strateji kullanın: hücre boyama için PI (PE kanalı) izledi morfolojisi X Alexa647-edu (APC kanalı) için Plot FSC-Alan X SSC-Alan. Tüm tüpler numune başına 10.000 olayları satın tek tek için kayıt verileri.
      3. Kurulan protokolleri ^11,30 aşağıdaki veri analizi yazılımı sitometri akışı ile hücreler ve faz uzunluklarının hücre döngüsü faz dağılımının belirlenmesi.

Sonuçlar

CyclinB1 ve CDK1 Alt mitokondrial yerelleştirme

Sodyum karbonat ekstraksiyonu, bir protein mitokondri içinde ya da dış yüzeyi, yani, dış zar üzerinde yer olup olmadığını belirlemek için kullanılır. bir protein mitokondri içinde lokalize olduğu gösterilmiştir sonra, alt mitokondriyal yerelleştirme daha belirlenmesi proteaz sindirimi ile birlikte mitoplasting ile yapılabilir. CyclinB1 ya CDK...

Tartışmalar

Diğer hücre içi organellere için mukadder proteinler gibi, mitokondriyal hedeflenen proteinler ayrıntılı protein translocating ve katlama makineleri ^21,22 yardımı ile organel onları yönlendirmek onların birincil veya ikincil yapı içinde hedefleme sinyalleri sahiptirler. Bu COX8 olarak sadece mitokondriyal yerleşik proteinlerden elde dizileri (MTS) hedefleme mitokondri, mitokondri ^11,23,24 üzerine belirli proteinleri hedef için bir gen sekansının N-terminalinden eklenebilir. Burad...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
32P ATP	PerkinElmer	BLU002001MC
Anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11003	Alexa-546 conjugated
Anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11029	Alexa-488 conjugated
ATP	Research Organics	1166A	For in vitro kinase assay
Cdk1 antibody	Cell Signaling Technology	9112
Cdk1 kinase buffer	New England Biolabs	P6020S
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Life Technologies	C10337	For cell cycle analysis with EdU labeling
COX IV antibody	Cell Signaling Technology	4844S	For mitochondrial immunostaining
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-752
CyclinB1/Cdk1 enzyme complex	New England Biolabs	P6020S	Avoid freeze/thaw
CyDye DIGE Fluor Labeling Kit	GE Healthcare Life Sciences	25-8009-83
DIGE Gel and DIGE Buffer Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9480-26 AA
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	319937	DMF
Dithiothreitol	Bio-Rad	161-0611	DTT
dNTP	EMD Millipore	71004	For site-directed mutagenesis
Dpn I enzyme	Stratagene	200519-53	For site-directed mutagenesis
Dry Strip cover fluid	GE Healthcare Life Sciences	17-1335-01	Used as mineral oil
EDTA	J.T. Baker	4040-03
EGTA	Acros Organics	409910250
Eppendorf Vacufuge Concentrator	Fisher Scientific	07-748-13	Used as vacuum centrifuge concentrator
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01	Anti-fade mounting solution
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences	649908	For cell cycle analysis with EdU labeling
Histone H1	Calbiochem	382150	For in vitro kinase assay
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For purifying DNA fragments from agarose gels
Immobiline DryStrip Gels	GE Healthcare Life Sciences	18-1016-61	IEF (isoelectric focusing) strips
Immobilized Glutathione	Thermo Scientific	15160	Glutathione-agarose beads
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	I1149	IAA
IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE Healthcare Life Sciences	11-0033-64	IPGphor strip holders
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside	RPI Corp	156000-5.0	IPTG
Leupeptin	Sigma Aldrich	L9783	For cell lysis buffer
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027	Transfection reagent
Lysine	Sigma Aldrich	L5501	For CyDye labeling
Lysozyme	EMD Chemicals	5960
Mitoctracker Red/Green	Invitrogen	M7512/M7514	Mitochondrial fluorescent dyes
MOPS	EMD Chemicals	6310
pEGFP-N1	Clonetech	6085-1	GFP-expressing vector
Pfu	Stratagene	600-255-52
pGEX-5X-1	GE Healthcare Life Sciences	28-9545-53	GST-expressing vector
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Shelton Scientific	IB01090	PMSF
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040	PBS
Spectra/Por 4 dialysis tubing	Spectrum Labs	132700	as porous membrane tubing for dialysis
Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain	Life Technologies	P-33300	For staining phosphoproteins on 2D gels
Proteinase inhibitor cocktail	Calbiochem	539134	For cell lysis buffer
QuikChange site-directed mutagenesis kit	Stratagene	200519-5
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	MiniPrep Plasmid Isolation Kit
RO-3306	Alexis Biochemicals	270-463-M001	Cdk1 inhibitor
Rotenone	MP Biomedicals	150154	Complex I inhibitor
Sodium carbonate	Fisher Scientific	S93359
Sodium chloride	EMD Chemicals	SX0420-5	For cell lysis buffer
Sodium orthovanadate	MP Biomedicals	159664	For cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate decahydrate	Alfa Aesar	33385	For cell lysis buffer
Sodium β-glycerophosphate	Alfa Aesar	L03425	For cell lysis buffer
SpectraMax M2e	Molecular Devices	M2E	Microplate reader
Sucrose	Fisher Scientific	57-50-1
Tissue Grinder pestle	Kimble Chase	885301-0007	For mitochondria isolation
Tissue Grinder tube	Kimble Chase	885303-0007	For mitochondria isolation
Trichloroacetic acid solution	Sigma Aldrich	T0699	TCA
Tris	MP Biomedicals	103133
Triton-x-100	Teknova	T1105
Trypsin	Calbiochem	650211
Typhoon Imager	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Laser gel scanner fro 2D-DIGE
Ubiquinone	Sigma Aldrich	C7956