JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Abstract

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

Introduction

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today1. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat2. Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population3. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage4. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.

Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat5 and decomposed samples6 but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork9, beef10 and catfish11. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available12, and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States1. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats.

Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses13, but it is rarely used for identifying proteins in meat14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

Protocol

أخلاقيات الإعلان: تم إجراء هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من الجامعة الوطنية تشيايي، ID موافقة: 99022. ويسمح باستخدام عينة الحوتيات بواسطة مجلس الزراعة في تايوان (تصريح بحوث 100M-02.1-C-99).

إعداد نموذج 1. العضلات وSDS-PAGE

ملاحظة: عينات العضلات من 23 نوعا منها 16 نوعا من الثدييات البحرية، 5 أنواع من الثدييات الأرضية، واستخدمت التونة والدجاج في هذه الدراسة (الجدول 1). تم الحصول على عينات من العضلات الحيتان من الأفراد الذين تقطعت بهم السبل، الصيد العرضي السمكية، والمصادرة. تم الحصول على الأرانب، والفئران، والكلب، والأنسجة العضلية الدجاج من مركز التشخيص الأمراض الحيوانية من الجامعة الوطنية جايبور. تم شراء عينات من لحم البقر والخنزير والضأن، وسمك التونة من المتاجر المحلية. عينة العضلات لميناء ختم (PHOCA vitulina ) تم توفيره من قبل فارغلوري حديقة المحيط. وقد استخدم دوديسيل كبريتات الصوديوم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) لفصل بروتينات قابلة للذوبان مع أوزان جزيئية مختلفة في عينات العضلات.

  1. تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. هاون قبل بارد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ثم وضع 3 غرام من عينة العضلات المجمدة في ذلك.
  3. تجانس العينة مع 10 مل من بارد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الخالط الأنسجة.
  4. أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع supernatants وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. إعداد 5 مل من 5٪ التراص هلام (3.07 مل من الماء المقطر، 1.25 مل من العازلة هلام العلوي 4x والرقم الهيدروجيني 6.8، 625 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 50 ميكرولتر من 10٪ فوق كبريتات الأمونيوم (APS)، و 5 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine ( TEMED)) و 10 مل من 15٪ يفصل هلام (3.65 مل من الماء المقطر، 2.5 مل من 4X أقل عازلة هلام الرقم الهيدروجيني 8.8، 3.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 100 ميكرولتر من 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية،و4 ميكرولتر من TEMED).
    1. في الخلية الكهربائي، صب جل التراص (5٪ الأكريلاميد) على أعلى من هلام فصل (15٪ الأكريلاميد) بعد أن وطدت هذه الأخيرة. إدراج مشط هلام في هلام التراص.
  6. أداء PAGE وفقا للشروط التالية: حالة المدى الأولية: 100 فولت، 20 دقيقة، وحالة النهائية: 120 فولت و 40 دقيقة.
  7. وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق اللامع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى الجل الأزرق بشكل موحد في اللون.
    ملاحظة: تلطيخ اكتمال عندما هلام لم يعد مرئيا في محلول الصبغة.
  8. يزيل اللون مع حل حامض الخليك (10٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. وسوف يبدأ البولنجر على ما يبدو. تواصل destaining في 4 درجات مئوية خلال الليل حتى خلفية واضحة.

2. الببتيد التجميعي وحيدة النسيلة جسم إنتاج

  1. استرداد تسلسل الأحماض الأمينية ميغابايت من بنك الجينات بما في ذلك سمك التونة والدجاج والنعام والثدييات المحلية، وختم 18 نوعاالثدييات البحرية (الجدول 2).
  2. محاذاة تسلسل باستخدام البرامج المناسبة 16:
    1. إطلاق مستكشف محاذاة طريق تحديد محاذاة: تعديل / بناء التوافق على شريط الإطلاق؛ حدد إنشاء محاذاة جديد ثم انقر فوق موافق. سيظهر مربع حوار يسأل "هل بناء الحمض النووي أو البروتين تسلسل المحاذاة؟"
    2. انقر فوق الزر المسمى "البروتين". تحديد البيانات: فتح: استرداد سلاسل من الملفات وحدد ملف تسلسل. حدد تعديل: حدد جميع الأوامر القائمة لتحديد جميع المواقع لكل تسلسل في مجموعة البيانات لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة.
    3. اختر محاذاة: محاذاة بواسطة ClustalW من القائمة الرئيسية لمحاذاة البيانات تسلسل المحدد باستخدام خوارزمية ClustalW. حدد "BLOSUM"، كما البروتين الوزن مصفوفة ثم انقر فوق الزر موافق.
  3. تحليل تسلسل المحاذاة:
    1. التركيز على 5 سي التفاعلي الأنتيجينقسم التدريب والامتحانات 17: الموقع 1 (AKVEADVA، 15-22)، موقع 2 (KASEDLK، 56-62)، الموقع 3 (ATKHKI، 94-99)، الموقع 4 (HVLHSRH، 113-119)، والموقع (5 KYKELGY، 145- 151) والعثور على جزء المحفوظة بين الثدييات البحرية. * (علامة النجمة، رمز إجماع في محاذاة (بروتوكول 2.2.3)) إلى المواقف التي لديها واحدة، وبقايا الحفظ تماما. تم العثور على شظايا الحفظ التالية في الحيتان: تسلسل KASEDLKKHG (والذي يتضمن الموقع 2)، وتسلسل HVLHSRHP (والذي يتضمن الموقع 4).
  4. توليف مرشح تسلسل شظايا وفقا لتحليل تسلسل، والمترافقة مع بروتين ألبومين البيض (OVA) كما البروتين الناقل باستخدام الخدمات التجارية.
    1. إضافة الأحماض الأمينية مسعور (على سبيل المثال، ميثيونين) إلى N-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لمنع الببتيد من التحلل (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG).
    2. إطالة C-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لفضح الموقع الأنتيجين الأساسية لخلية مناعية. وعلاوة على ذلك، conjuبوابة الببتيد مع OVA بإضافة السيستين (السيستئين، C) إلى C-محطة (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. يستحلب مساعد الكامل فرويند لمستمنع 1 أو مساعد ناقصة فرويند لمستمنع 2 مع حجم مساو من كل الببتيد الاصطناعية في برنامج تلفزيوني (3 مل، نهائي تركيز 30-50 ميكروغرام / 100 ميكرولتر).
  6. تطعيم مستمنع 1 (0.1 ملغ) تحت الجلد في كل من 5 إناث الفئران BALB / ج.
  7. أداء حقن منشطة تحت الجلد خمس مرات باستخدام مستمنع 2 على فترات لمدة أسبوعين، وجمع الأمصال الاختبار عن طريق أخذ العينات ذيل مقطع من الفئران قبل كل معززة.
  8. تحديد عيار الأمصال للفحص الأول.
    1. حل 100 ميكروغرام من الببتيد مجانا في 25 مل من رد فعل العازلة وقسامة 50 ميكرولتر من الحل في كل بئر من لوحة 96-جيدا. إضافة 10 ميكرولتر حل اقتران الكاشف في كل بئر وتخلط لوحة. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة محتويات البئر،غسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر، ومنع لوحة بإضافة 200 ميكرولتر من عرقلة الحل. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة محتويات وغسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر.
    3. أداء إليسا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7) لتحديد الأمصال عيار لفحص الأول. اختيار الماوس وفقا لأعلى عيار (أعلى كثافة ضوئية) لجمع الطحال.
  9. قبل ثلاثة أيام لجمع الطحال، تطعيم 0.1 ملغ من مستمنع 1 تحت الجلد في الماوس تقديم أعلى عيار.
  10. جمع خلايا الطحال من الفئران تحصين المختارة والصمامات مع خلايا المايلوما الفئران F0 (SP2 / 0-Ag14) للحصول على خلايا هجين لتوليد ماب 18.
  11. بعد 14 يوما الانصهار، حدد استنساخ إيجابية عن طريق فحص والتفاعل من supernatants هجين نحو الببتيد الاصطناعية مجانا باستخدام الاليزا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7).
  12. تمييع الخلايا لعدد مناسب لكل بئر لmaximizجي نسبة الآبار التي تحتوي على نسخة واحدة واحدة فقط (تخفيف الاستنساخ).
    1. إضافة 100 ميكرولتر من مستنبت الخلية لجميع الآبار في لوحة 96-جيدا إلا A1 الآبار التي تبقى فارغة.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من خلية إلى تعليق A1 جيدا. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من A1 إلى B1 ومزيج من قبل pipetting بلطف. كرر هذه 1: 2 التخفيفات أسفل العمود بأكمله، ثم تنقلب 100 ميكرولتر من H1 بحيث ينتهي مع نفس الحجم مثل الآبار فوقه.
    3. إضافة 100 ميكرولتر إضافية من المتوسطة إلى العمود 1 مع micropipette 8 قنوات. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود 1 لتلك الموجودة في العمود 2 باستخدام نفس ماصة، ومزيج من قبل pipetting بلطف.
    4. باستخدام نفس النصائح، كرر هذه 1: 2 التخفيفات عبر لوحة كاملة. تجاهل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود الأخير.
    5. جلب الحجم النهائي من جميع الآبار إلى 200 ميكرولتر بإضافة 100 ميكرولتر المتوسطة إلى كل بئر. احتضان جيش التحرير الشعبى الصينىدون عائق الشركة المصرية للاتصالات عند 37 درجة مئوية في ترطيب CO 2 الحاضنة.
    6. التحقق من كل جانب وعلامة جميع الآبار التي تحتوي على مجرد مستعمرة واحدة. تنفيذ اثنين أو أكثر من clonings حتى> 90٪ من الآبار التي تحتوي على الحيوانات المستنسخة واحدة إيجابية لإنتاج الأجسام المضادة.
  13. فحص الحيوانات المستنسخة لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6). ثم المستعمرات ثقافة فرعية من الآبار إلى السفن الكبيرة إلى توسيع الخلايا للحصول على ماب. وعادة ما يتم نقل كل استنساخ في بئر واحدة في لوحة 12- أو 24-جيدا.
  14. قياس تقارب بين MABS ومقتطفات العضلات من البقر والماعز والخنازير والكلاب والأرانب والتونة والدجاج، وختم، وأربعة أنواع الحيتان تمثيلية لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6).
  15. تطعيم الخلايا هجين مختارة (ما يصل الى 3 × 10 6) البريتونى في الفئران للحث على استسقاء. انتفاخ البطن عادة ما يبدو في غضون 7-10 آخر أيام حقن هجين. جمع السائل باستخدام إبرة تحت الجلد(أقل من قياس 20).
  16. أجهزة الطرد المركزي سائل الاستسقاء (10000 x ج لمدة 10 دقيقة) لإزالة الخلايا والحطام. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون. إضافة 1-20 مل من العينة، 15 مل العازلة ملزمة، و3-5 مل من شطف العازلة في البروتين العمود G سيفاروز. جمع الكسر شطف تحتوي على الأجسام المضادة تنقيته من السوائل استسقاء الفئران.
  17. تحديد نمط إسوي الأجسام المضادة من قبل الأجسام المضادة عدة isotyping باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.

3. ويسترن وصمة عار

  1. إعداد العازلة تحميل 2X تحتوي على بيتا المركابتويثانول (BME) عن طريق خلط 950 ميكرولتر من عينة العازلة 2X Laemmli مع 50 ميكرولتر من أساسيات إدارة الأعمال. تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في العازلة تحميل مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 01:50 (الحيتان والفقمة) و 1: 5 (الحيوانات الأليفة وأسماك التونة) عند استخدام الأجسام المضادة ميغابايت الأرنب بولكلونل مكافحة الإنسان، و 1: 1 (الخنازير والأرانب والدجاج والتونة)، 1: 5 (البقر والماعز والكلاب)، و01:25 (الحيتان والفقمة) عندماntibody هو من طاف هجين.
  2. عينة الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نماذج تحميل في الآبار من هلام SDS-PAGE (4٪ الأكريلاميد التراص و 12٪ الأكريلاميد فصل) جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي. تشغيل هلام لمدة 5 دقائق في 50 V ثم زيادة الجهد إلى 150 فولت لإنهاء التشغيل في حوالي 1 ساعة.
  3. وضع الجل في المخزن نقل 1X لمدة 15 دقيقة. نقل البروتين فصلها لالنيتروسليلوز (NC) الأغشية بعد أن يتم فصل في الصفحة. ويمكن أن يتم نقل 100 V ل60-90 دقيقة.
  4. يعد حل حجب ما يلي: 1X PBS تحتوي على 0.1٪ توين 20 مع 5٪ الحليب الجاف الخالي. منع غشاء NC في 25 مل من عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما مع 15 مل الفوسفات مخزنة المالحة مع توين 20 (PBST).
  5. احتضان الغشاء والأجسام المضادة الأولية (استسقاء السائل أو طاف هجين) في 10 مل العازلة تخفيف الأجسام المضادة المخفف مع 5٪ عرقلة الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  6. غسل MEMBRANالبريد ثلاث مرات مرة أخرى مع PBST لتنظيف قبالة الأجسام المضادة المفرط.
  7. احتضان الغشاء مع القلوية الفوسفاتيز مترافق الماعز المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في محلول مانع مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في 5 برومو-4-كلورو-3-indolyl كلوريد الفوسفات / ف تترازوليوم نتروبلو (BCIP / NBT) الفوسفاتيز الركيزة الخليط لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
  9. وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.

4. نقطة وصمة عار

  1. تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في 5٪ الزلال المصل البقري (BSA) في PBST مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 1: 5 للحيوانات المحلية والتونة، و01:25 لالحيتان والفقمة. بقعة 5 ميكرولتر من العينات على الغشاء. تقليل المنطقة أن الحل تخترق (عادة قطرها ملم 3-4) عن طريق تطبيق ببطء.
  2. يجف الغشاء في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، </ م> في تدفق الصفحي لمدة 30-60 دقيقة)، منعه مع عرقلة الحل في طبق بتري لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBST.
  3. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (ماب من طاف هجين في 1: 10000 أو السائل الاستسقاء في 1: 100،000 المخفف في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. استخدام PBST لغسل غشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل لإزالة الأجسام المضادة الزائد، ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (القلوية الماعز الفوسفاتيز مترافق المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة .
  5. يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في BCIP / NBT خليط الفوسفاتيز الركيزة في غضون 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
  6. وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.

5. غير المباشر ELISA

  1. إعداد غسل العازلة (0.002 M ايميدازول مخزنة المالحة مع 0.02٪ توين 20). غسل لوحة 3 مرات مع الغسيلالعازلة بين كل خطوة التالية (بروتوكول 5،2-5،5).
  2. إعداد 1:25 التخفيف من supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في المخزن الطلاء. معطف 96-جيدا لوحة ELISA مع 100 ميكرولتر supernatants المخففة عند 4 درجات مئوية خلال الليل ومنعه مع عازلة تمنع (1٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد 1: 2000 تخفيف من ماب النقي مع عازلة المخفف وإضافة 100 ميكرولتر من ماب المخفف إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة الماعز المضادة للمفتش الماوس مترافق مع البيروكسيديز الفجل (1: 200 التخفيف في المخزن المخفف) لمزيد من الحضانة.
  5. إضافة البيروكسيديز الركيزة على كل جانب (100 ميكرولتر / جيد)، واحتضان لمدة 10-15 دقيقة.
  6. وقف رد فعل الانزيم من قبل وقف الحل البيروكسيداز (100 ميكرولتر / جيد) عندما لوحظ اللون التنمية.
  7. قراءة الكثافة البصرية في 450 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة.

6. إعداد ماب المسمى الذهب الغروية

ملاحظة: لون حل الذهب الغروية والخليط يجب أن تكون دائما حمراء. ضبط درجة الحموضة، وتركيز ماب، سرعة أجهزة الطرد المركزي عندما يلاحظ راسب أسود. الخطوات 6.1 و 6.2 خطوات الأمثل.

  1. إضافة تنقيته كشف ماب (50 ميكروغرام / مل، و 3 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية مع قيم الرقم الهيدروجيني متفاوتة 5-9. ويعتبر الحد الأدنى من درجة الحموضة التي تحافظ على اللون الأحمر لمدة ساعتين كما أن درجة الحموضة المثلى. ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام 0.1 M كربونات البوتاسيوم لضبط الذهب الغروي (40 نانومتر) حل لدرجة الحموضة 8.0 (درجة الحموضة المثلى).
  2. إضافة كمية مختلفة من تنقية كشف ماب (500 ميكروغرام / مل، 1-20 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية في درجة الحموضة 8.0. ملاحظة: إن تركيز الأمثل في هذه الدراسة هو 6 ميكروغرام / مل (أي راسب أسود).
  3. وفقا لنتائج المذكورة أعلاه، إضافة 60 ميكروغرام من تنقية كشف ماب قطرة من الحكمة إلى 10 مل من محلول الذهب الغروي. استحلب الخليط بلطف على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ميلاديد 2 مل من محلول 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى الخليط ويستحلب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للحد من التدخل في الخلفية.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. إزالة طاف مع الأجسام المضادة اللامقترن بعناية وتعليق الكريات الناتجة في 4 مل PBST تحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ توين 20، وكرر الطرد المركزي وتعليق عدة مرات.
  6. تعليق رواسب النهائية في 1 مل PBST وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

7. بناء قطاع المناعي

ملاحظة: يبين الشكل 1 تصميم الشريط المناعي. إعداد وتجميع الشرائط في الرطوبة منخفضة الظروف البيئية مختبر (<20٪ الرطوبة النسبية) للحياة تخزين لفترات طويلة (> 1 سنة). أبعاد منصات وغشاء هي: المكورات وحة 300 مم × 10 مم، وسادة ماصة 300 مم × 24 مم، وسادة العينة 300 مم × 24 مم، NC غشاء 300 مم × 25 مم، كرتون 300مم × 80 مم.

  1. إضافة الغروي حل المسمى الذهب ماب من الخطوة 6.6 مع micropipette لتشبع لوحة المترافقة ثم جففه في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل تجميع.
  2. توزيع محددة ماب (500 ميكروغرام / مل) على منطقة الاختبار التقاط مستضد، وأرنب لمكافحة فأر مفتش (500 ميكروغرام / مل) على المنطقة المراقبة للكشف عن ماب على الغشاء NC باستخدام طابعة ماصة أو immunostrip. الحفاظ على مسافة (> 5 ملم) بين المنطقتين لتفادي أي تشويش.
  3. لصق لوحة مترافق، وسادة ماصة والأغشية NC على الكرتون مع الشريط على الوجهين.
    ملاحظة: تداخل منصات على كل جانب من الغشاء NC بنحو 2 مم. وبناء قطاع غير لائق يؤدي إلى اختبار غير مكتملة.
  4. وضع لوحة العينة على لوحة المترافقة (2 ملم) ولصقها على ورق مقوى.
  5. إنشاء شرائح واسعة 6 ملم مع ورقة القاطع. حزمة شرائح في كيس رقائق الألومنيوم مع المجففة، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

8. عبر التفاعل الاختبار

  1. التجانس 0.03 غرام من عينة العضلات الخام مع 1 مل PBS (التي تحتوي على 0.1٪ BSA) في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل باستخدام عصا الخيزران أو طحن قضيب.
  2. عقد قطاع كتبها العكس حد للمناطق اختبار وتراجع الجزء وحة العينة إلى العينة لمدة 5-10 دقيقة ومراقبة نتيجة مباشرة.
    1. اختياري: جمع 500 ميكرولتر طاف وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
      ملاحظة: اقترح هذه الخطوة إذا كانت إشارة ليست واضحة عندما يتم استيعابه الشريط مباشرة في طاف.
  3. اختبار عينات العضلات المختلفة في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: نحن هنا اختبار التونة، الدجاج، ختم، 15 نوعا من الثدييات و 5 أنواع من الثدييات الأرضية.
  4. لدينا خمسة مفتشين مستقلين يكرر 8.3 لخمس مرات، أي استخدام 575 شرائط في المجموع.

النتائج

خصائص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة

وضعنا اثنين مفتش 1 MABS (CGF5H9 وCSF1H13) الاعتراف اثنين من الببتيدات الاصطناعية (MKASEDLKKHGNTVLC وAIIHVLHSRHPAEFGC)، على التوالي، من الحوتيات ميغابايت، وكانت تستخدم هذه لبناء شطيرة من نوع الذهب الغرو...

Discussion

باستخدام الببتيد الاصطناعية مترافق إلى البروتين الناقل هو ملحوظ أكثر فعالية مقارنة مع البروتين وما شابه ذلك. لمعدات القائم على شطيرة، لأنه يتم تطوير ماب باستخدام الحواتم مع المواقع النسبية المعروفة، وMABS اثنين في هذه الدراسة من غير المحتمل أن تتداخل مع تفاعل كل منهم...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We appreciate the colleagues in Taiwan Cetacean Society, Marine Biology and Cetacean Research Center of National Cheng Kung Univerisy, Farglory Ocean Park, and Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universiy for sample collection. This project was funded by grant to WCY from the Council of Agriculture of Taiwan (100AS-02.1-FB99).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered salineAMRESCOJ373
Protein G HP SpinTrap GE Healthcare28-9031-34spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping KitRoche11493027001Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Nitrocellulose membraneWhatmanZ613630
Antibody blocker solution LTK BioLaboratoriesTo minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate KPL50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-MouseKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plateThermo Fisher ScientificEW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader Thermo Electron Corporation51118170
Colloid gold (40 nm) solution REGA biotechnology Inc.40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albuminGibco15561-020
Rapid test immno-strip printerREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman))REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant Sigma-AldrichF5881, F5506Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) ProtechGel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250Bio-Rad1610436Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanolBio-Rad1610737, 1610710Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels

References

  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -. C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -. H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved