Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Özet

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Özet

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG₁). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

Giriş

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today¹. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat². Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population³. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage⁴. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.

Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat⁵ and decomposed samples⁶ but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs^7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork⁹, beef¹⁰ and catfish¹¹. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available¹², and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States¹. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats.

Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses¹³, but it is rarely used for identifying proteins in meat^14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

Protokol

Etik Beyanı: Çalışma Ulusal Chiayi Üniversitesi, onay numarası Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından uluslararası kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi: cetacean örnek kullanımı Tayvan Tarım Konseyi (Araştırma İzni tarafından izin verildi 99022. 100M-02.1-Cı-99).

1. Kas Numune Hazırlama ve SDS-PAGE

Not: Deniz memelilerinin 16 türün, karasal memeli 5 türler de dahil olmak üzere 23 türe kas örnekleri, ton balığı ve tavuk Bu çalışmada (Tablo 1) kullanılmıştır. cetacean kas örnekleri mahsur kişiler, balıkçılık hedef dışı av ve müsadere elde edilmiştir. Tavşan, fare, köpek ve tavuk kas dokuları Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'nden elde edilmiştir. sığır, domuz, kuzu ve orkinos örnekleri yerel bir süpermarketten satın alındı. Liman foku (Phoca vitulina kas örneği ) Farglory Ocean Park tarafından sağlandı. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE), kas örnekleri, farklı moleküler ağırlıklara sahip çözünebilir proteinlerin ayrılması için kullanılmıştır.

1. kullanılana kadar -20 ° C'de tüm örnekler saklayın.
2. -20 ° C'de ön-serin harcı. Sonra içine donmuş kas örnek 3 g koydu.
3. Bir doku homojenleştirici kullanarak soğuk fosfat tamponlu salin içinde 10 ml (PBS) ile örnek homojenize edilir.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de homojenize santrifüjleyin. süpernatantlar toplamak ve kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.
5. (5 mi,% istifleme jeli (3.07 ml damıtılmış suya, pH 6.8,% 40 akrilamid 625 ul,% 10 amonyum persülfat (APS), 50 | il ve tetrametiletilendiamin 5 ul 4x üst jel tamponu 1.25 ml 5 hazırlanması TEMED)) ve 10 ml% 15 ayırma jeli (damıtılmış su 3.65 mi, 4 kere pH 8.8 alt jel tamponu, 2.5 ml% 40 akrilamid 3.75 mi,% 10, 100 ul APSve TEMED 4 ul).
   1. Elektroforez hücresinde, ikinci katılaşmasından sonra ayırma jeli (% 15 akrilamid) üzerine jel (% 5 akrilamid) istifleme dökün. istifleme jel jel tarak yerleştirin.
6. Aşağıdaki koşullara göre PAGE gerçekleştirin: İlk çalışma koşulu: 100 volt, 20 dakika ve son durum: 120 volt, 40 dk.
7. Jel renk eşit mavi olana kadar 30 dakika oda sıcaklığında Coomassie parlak mavisi ile jel leke.
   Not: Jel artık boya çözeltisi görünür olduğunda Boyama tamamlanır.
8. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında asetik asit çözeltisi (% 10) ile destain. Bantları görünmeye başlayacaktır. Arka plan temizlenene kadar bir gecede 4 ° C'de lekenin devam edin.

2. Peptid Sentezi ve Tek klonlu Antikor Üretimi

1. ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil hayvanlar, mühür ve 18 tür dahil olmak üzere, GenBank'tan Mb amino asit sekanslarını almakdeniz memelileri (Tablo 2).
2. Uygun yazılım ¹⁶ kullanarak dizileri hizalayın:
   1. Hizala seçerek Hizalama Explorer'ı başlatın: başlatmak çubuğunda Hizalama kurmak / Edit; Yeni Hizalama Oluştur'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Bir iletişim soran görünecektir "Bir DNA veya protein dizi hizalama oluşturuyor musunuz?"
   2. "Protein" etiketli düğmesini tıklayın; Açık: Verileri seçmek Dosya seçin ve dizi dosyasından dizileri Al; Düzenle'yi seçin: Bir çoklu dizi hizalaması oluşturmak için veri seti her dizisi için tüm siteleri seçmek için Tüm menü komutunu seçin.
   3. Seç Hizalama: ClustalW algoritması kullanılarak seçilen dizileri veri hizalamak için ana menüden ClustalW tarafından hizalayın; Tamam düğmesini tıklatın Protein Kilo Matrix olarak "BLOSUM" i seçin.
3. dizi hizalama analiz:
   1. 5 antijenik reaktif si odaklanıntes ^17: Alanı 1 (AKVEADVA, 15-22), Alanı 2 (KASEDLK, 56-62), Alanı 3 (ATKHKI, 94-99), Alanı 4 (HVLHSRH, 113-119) ve site 5 (KYKELGY, 145- 151) ve deniz memelileri arasında muhafaza fragmanı bulmak. Bir * (yıldız; hizada konsensüs sembolü (Protokol 2.2.3)) tek, tamamen korunmuş kalıntısı pozisyonları gösterir. deniz memelileri aşağıdaki korunmuş parçaları bulundu: (siteyi 2 dahil) dizisi KASEDLKKHG ve dizi HVLHSRHP (hangi siteyi 4 içerir).
4. ticari hizmetlerini kullanarak taşıyıcı protein olarak ovalbümin proteininin (OVA) ile sekans analizi ve konjugat göre aday dizisi fragmanları sentezlemek.
   1. Ayrışma peptidin önlemek için antijenik reaktif site N-terminali hidrofobik amino asitler (örneğin, metionin) ilave (örneğin, E-KASEDLKKHG).
   2. immünosit çekirdek bir antijenik yeri sergilemek için antijenik reaktif sitenin C-terminal uzatır. Bundan başka, konjugatKapı Cı-terminal sistein (Cys; C) eklenerek OVA peptid (örneğin, E-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. imünojen 1 ya da PBS içinde, her sentetik peptit, eşit hacimde (3 mL, nihai konsantrasyon 30-50 g / 100 ul) ile imünojen 2 tam olmayan Freund katkı maddesi için tam Freund katkı maddesi emülsiyon.
6. deri altından 5 dişi BALB / c farelerinin her birine imünojen 1 (0.1 mg), inoküle.
7. İki haftalık aralıklarla subkutan güçlendirici enjeksiyonları immünojen 2 kullanılarak beş kez gerçekleştirin ve her güçlendirici önce farelerden alınan kuyruk klip örnekleme test serumları toplamak.
8. İlk tarama için, sera titresi belirlenir.
   1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, reaksiyon tamponu ve kısım çözeltisi 50 ul 25 ml serbest peptidin 100 ug çözündürülür. Her kuyuya 10 ul birleştirme reajanı solüsyonu eklenir ve plaka karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
   2. , Kuyunun içeriğini kaldırdamıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkama ve bloke etme çözeltisi 200 ul ilave edilerek plaka engeller. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. içeriğini çıkarmak ve damıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkayın.
   3. İlk tarama için sera titresinin belirlenmesi için dolaylı ELISA (Protokol 5,1-5,7) gerçekleştirin. dalak koleksiyonu için en yüksek titre (en yüksek optik yoğunluk) ile fare seçin.
9. Üç gün önce dalak koleksiyonuna, deri altı yüksek titreye sunan fare içine immünojen 1 0.1 mg aşılamak.
10. MAb nesil ¹⁸ için hibridoma hücreleri elde etmek için fare miyelom hücreleri F0 (sp2 / 0-Ag14) ile seçilmiş aşılanmış farelerde ve sigorta dalak hücreleri toplamak.
11. 14 gün füzyon sonra, dolaylı ELISA kullanılarak içermeyen sentetik peptid doğru hibridom üst fazları (Protokol 5,1-5,7) reaktivitesini tarama ile pozitif klonlar seçin.
12. maximiz için oyuk başına uygun sayıda hücreleri sulandırmaksadece tek bir klon (seyreltme klonlama) içeren havuzlara oranını ing.
    1. Boş kalan de A1 hariç 96 oyuklu plaka içerisinde tüm oyuklara hücre kültür ortamının 100 ul ekle.
    2. de A1 hücre süspansiyonu 200 ul ekle. Sonra hızlı bir şekilde B1 A1 100 ul transferi ve hafifçe pipetleme karıştırın. Tüm sütun boyunca 2 dilüsyonları, ve bunun üstünde kuyuları ile aynı hacmi ile biter böylece daha sonra H1 100 ul atmak: Bu 1 tekrarlayın.
    3. 8 kanallı mikropipet ile sütun 1, orta ve ek bir 100 ul ekle. Daha sonra hızlı bir şekilde, aynı pipet kullanarak sütun 2'de kişilerce sütun 1 kuyuların herbirinden 100 ul transfer ve yavaşça pipetleme karıştırın.
    4. tüm plaka üzerinde 2 dilüsyonları: Aynı ipuçlarını kullanarak, bu 1 tekrarlayın. son sütunda kuyuların her birinden 100 ul atın.
    5. Her bir oyuğa 100 ul ortamı eklenerek 200 ul tüm oyuklara nihai hacim getirin. pla inkübeTe nemlendirilmiş _CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C ısıda.
    6. Her çukurun kontrol edin ve sadece tek bir koloni içeren tüm kuyuları işaretlemek. Tek klonlar içeren kuyuların>% 90 antikor üretimi için pozitif olana kadar iki veya daha fazla klonlama yürütmek.
13. Western blot ve Dot blot (protokol 3,1-4,6) ile klonları taramak. Sonra daha büyük kaplara kuyulardan alt kültür koloniler mAb elde etmek için hücreleri genişletmek için. Genellikle, her klon 12 veya 24 oyuklu bir plaka içerisinde, tek bir kuyunun içine aktarılır.
14. mAbs ve inek, keçi, domuz, köpek, tavşan, ton balığı, tavuk, mühür kas özleri ve western blot ve dot blot (protokol 3,1-4,6) dört temsilci cetacean türler arasındaki yakınlık ölçün.
15. Assitler ikna etmek için farelerin periton içine (en fazla 3 x 10 ⁶⁾ seçilen hibridoma hücreleri aşılamak. Karın şişliği 7-10 gün hibridoma enjeksiyon sonrası içinde genellikle açıktır. bir hipodermik bir iğne kullanılarak sıvının toplama(Az 20 ölçü).
16. Santrifüj asit sıvısı (10 dakika 10.000 xg) hücreleri ve enkaz kaldırmak için. 0.45 um'lik bir filtre ile filtrelenir. Protein G Sefaroz kolonuna örnek 1 ila 20 ml bağlama tamponu 15 mi, ve elüsyon tamponu 3 ila 5 ml ilave edilir. farenin asit sıvısı arıtılmış antikor içeren ayırma fraksiyonu toplamak.
17. Üreticinin talimatlarını kullanarak Antikor İzotipleme Kiti ile antikor izotipini belirlemek.

3. Western Blot

1. BME 50 ul 2x Laemmli numune tamponu 950 ul karıştırılarak β-merkaptoetanol (BME) ihtiva eden 2 x yükleme tamponu hazırlayın. Poliklonal tavşan anti-insan Mb antikoru kullanıldığında 5 (evcil hayvanlar ve ton balığı) ve: 01:50 (, deniz memelileri ve mühür) ve 1: iyi sinyaller elde etmek için uygun oranda yükleme tamponu kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltin 1: 1 (domuz, tavşan, tavuk ve ton balığı), 1: 5 (inek, keçi ve köpek) ve 01:25 (deniz memelileri ve mühür) zamanntibody Hibridom yüzey arasındadır.
2. 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısı örneği. moleküler ağırlık belirteçleri ile birlikte SDS-PAGE jel (% 4 akrilamit yığınlama ve% 12 akrilamid ayırma) oyuklarına Numuneleri. V sonra yaklaşık 1 saat içinde koşmak bitirmek için 150 V gerilimi artırmak 50 ° C'de 5 dakika boyunca jel çalıştırın.
3. 15 dakika boyunca 1 x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin. nitroselüloza ayrılan protein aktarın (NC) membranlar da PAGE ile ayrıldıktan sonra. Aktarım 60-90 dakika boyunca 100 V'ta yapılabilir.
4. engelleme çözeltisi hazırlayın: 1X PBS,% 5 yağsız kuru süt ile% 0.1 Tween 20 ihtiva etmektedir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi 25 ml Carolina membran engeller. Tween 20 (PBST), 15 ml fosfat tamponlu tuzlu su ile her biri 5 dakika için üç kez yıkayın.
5. Antikor Seyreltme tampon maddesi gece boyunca 4 ° C 'de% 5 engelleme çözeltisi ile seyreltildi, 10 ml membran ve primer antikor (assit sıvısı veya hibridom üst faz) inkübe edin.
6. zarı yıkayınYine PBST ile e üç kez aşırı antikor temizlemek için.
7. 1 ile alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si ile membran inkübe: 1,250, oda sıcaklığında 1 saat süre ile hafif bir çalkalama ile engelleyici çözelti içinde.
8. Yine zarın yıkanması ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat / p-nitro mavi tetrazolyum klorit içinde inkübe (BCIP / NBT) fosfataz alt-tabaka karışımı 10 ila 20 dakika süreyle renk gelişimi kadar.
9. damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.

4. nokta leke

1. iyi sinyaller elde etmek için uygun bir oran ile PBST içinde% 5 sığır serum albumin (BSA), kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltilir: 1: evcil hayvanlar ve ton 5 ve 1:25 deniz memelileri ve conta için. Noktası zarı üzerine numune 5 ul. Çözelti yavaşça uygulayarak (genellikle 3-4 mm çapında) nüfuz bölgeyi en aza indirin.
2. Oda sıcaklığında (zar kurutun, örneğin <30-60 dakika boyunca, bir laminar akış / em>), oda sıcaklığında, 1 saat süre ile Petri kabındaki çözüm engelleme ile bloke eder ve PBST ile yıkayın.
3. primer antikor ile membran inkübe (mAb 1 ile hibridoma süpernatanından: 10,000 veya assit sıvısı ile 1: 5% engelleme çözeltisi içinde seyreltildi 100,000), oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 Bloklama çözeltisi, 1.250 1 alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si) kullanımı PBST fazla antikor kaldırmak ve daha sonra sekonder antikor ile inkübe edilmesi her biri 5 dakika MEMBRAN üç kez yıkamak .
5. Yine membran yıkayın ve renk gelişimi kadar 10 ila 20 dakika içinde BCIP / NBT fosfataz substrat karışımı içinde kuluçkaya yatmaktadır.
6. damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.

5. Dolaylı ELISA

1. Yıkama tamponu (% 0.02 Tween 20 ile 0,002 M imidazol tamponlu tuz) hazırlayın. plaka yıkama ile 3 kere yıkayınHer bir sonraki aşamada (protokol 5.2-5.5) arasında tampon.
2. kaplama tamponu kas süpernatanları (protokol 1.1-1.4) ve 01:25 seyreltme hazırlayın. Ceket 96-çukurlu bir ELISA gece boyunca 4 ° C'de 100 ul seyreltilmiş supernatantlar plaka ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile tampon (PBS içinde% 1 BSA) ile bloke ile bloke eder.
3. İnceltilmiş tampon ile saflaştırılmış mAb 2.000 seyreltme ve her bir seyreltilmiş, mAb 100 ul 1 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
4. daha inkübasyon için: (seyreltilmiş tampon maddesi içinde 200 seyreltme 1) keçi anti-fare IgG yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş ekleyin.
5. her bir (100 ul / çukur) peroksidaz substratı ilave edin ve 10-15 dakika inkübe edilir.
6. Renk gelişimi gözlemlenir peroksidaz durdurma çözeltisi (100 ul / oyuk) enzim reaksiyonu durdurun.
7. Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 450 nm'de optik yoğunluk okuyun.

Kolloidal Altın etiketli mAb 6. hazırlanması

Not: koloidal altın çözüm ve karışımın rengi her zaman kırmızı olmalıdır. Siyah çökelti fark edildiğinde pH, mAb konsantrasyonu, santrifüj hızını ayarlayın. 6.1 Adımları ve 6.2 optimizasyon adımlardır.

1. 5-9 arasında değişen pH değerleri ile, koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb (50 ug / ml, 3 ul) tespit saflaştınlmış ekleyin. İki saat süre ile kırmızı rengi tutan en az optimum pH değeri pH olarak kabul edilir. Not: Bu çalışmada, 0.1 M potasyum karbonat kolloid altın (40 mil), pH 8.0 (optimum pH) çözüm ayarlamak için kullanıldı.
2. pH 8.0'da koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb tespit saflaştırılmıştır çeşitli bir miktar (500 mg / ml, 1-20 ul) eklenir. Not: Bu çalışmada, optimum konsantrasyonu 6 ng / ml (siyah tortu) 'dir.
3. Yukarıdaki sonuçlara göre, arıtılmış, mAb damla damla kolloid altın çözeltisi 10 ml saptama 60 ug ekleyin. 10 dakika süre ile, oda sıcaklığında, karışımın hafifçe emülsifiye. ilankarışıma PBS içinde% 5 BSA çözeltisi (pH 7.4), 2 ml ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça emülsifiye D interferansı azaltır.
4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin karışımı.
5. dikkatli bir şekilde konjüge edilmemiş antikor ile süpernatantı ve% 1 BSA ve% 0.1 Tween 20 içeren PBST ile 4 ml elde pelet askıya ve santrifüj ve süspansiyon birkaç kez tekrarlayın.
6. 1 ml PBST son çökeltiler askıya alma ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.

Bağışıklık Strip 7. İnşaat

Not: Şekil 1, bağışıklık şerit tasarımı gösterir. Hazırlayın ve <(1 yıl) uzun süreli depolama ömrü için (% 20 Bağıl Nem düşük nem laboratuarı çevre durumda şeritler)> monte edin. pedleri ve zarın boyutları: Birleşmiş Yastığı, 300 mm x 10 mm, emici ped, 300 mm x 24 mm, Örnek Yastığı, 300 mm x 24 mm, NC membranı 300 mm x 25 mm, 300 çalışma alanınamm x 80 mm.

1. Birleşmiş Yastığı, doyurulması ve sonra monte edilmeden önce 1 saat boyunca 37 ° C'de kurutmak için mikropipet ile adım 6.6 arasında kolloid altın etiketli mAB solüsyonu eklenir.
2. Bir pipet ya da İmmunoStrip yazıcı kullanılarak Kuzey Carolina zar üzerinde mAb saptanması için kontrol alanının spesifik antijen yakalama test bölgesi üzerinde mAb (500 ug / ml) ve tavşan anti-fare IgG (500 ug / ml) dağıtın. bir girişimi engellemek için iki bölge arasındaki mesafeyi (> 5 mm) tutun.
3. çift ​​taraflı bant ile çalışma alanında konjuge pad, emici ped ve NC membran yapıştırın.
   Not: yaklaşık 2 mm NC zarın her iki tarafındaki pedleri üzerinden geçin. Uygunsuz şerit inşaat tamamlanmamış bir testte neden olur.
4. eşlenik pedi üzerinde numune pedi (2 mm) yerleştirin ve çalışma alanındaki yapıştırın.
5. Bir kağıt kesici ile 6 mm çapında şeritler oluşturun. kurutucu ile alüminyum folyo çanta içinde şeritler paketleyin ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.

8. Çapraz reaktivite Testi

1. 1.5 ml santrifüj tüpüne 1 ml PBS içeren (% 0.1 BSA) bambu çubuk kullanarak ya da çubuğu taşlama ham kas numunesi 0.03 g homojenize edilir.
2. Test alanlara son tersi şeridi tutun ve 5-10 dakika süreyle numune içine numune pedi parçası daldırma ve doğrudan sonucu gözlemleyin.
   1. İsteğe bağlı: 500 ul süpernatant toplayın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
      Not: şerit doğrudan süpernatant içine batırılmış zaman sinyal açık değilse, bu adım önerilir.
3. üç nüsha olarak çeşitli kas örnekleri test edin.
   Not: Burada orkinos, tavuk, mühür, deniz memelileri 15 tür ve karasal memeli 5 tür test.
4. , Beş bağımsız müfettişler, yani beş kez 8.3 tekrarlayın sahip toplam 575 şeritler kullanın.

Sonuçlar

Monoklonal antikor özelliklerinin

Bu memeli Mb sırasıyla iki sentetik peptidler (MKASEDLKKHGNTVLC ve AIIHVLHSRHPAEFGC) tanıyan, iki IgG ₁ mAb (CGF5H9 ve CSF1H13) geliştirildi ve bu memeli Mb hızlı tespiti için yapılan bir sandviç tipi koloidal altın immünokromatografik test şeridi oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2, CGF5H9 yaklaşık 17 kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın olarak, deniz...

Tartışmalar

taşıyıcı proteine ​​konjüge edilmiş sentetik bir peptidin kullanımıyla kognat proteine ​​kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. mAb bilinen göreceli yerle epitopları kullanılarak geliştirilmiştir, çünkü sandviç temelli bir yöntem için, bu çalışmada iki mAb hedef antigen epitopu ile birbirlerinin etkileşime müdahale olası değildir. Ayrıca, doğal proteinin, sentetik peptit bağı ile bağışıklaştırılan farelerin antikor arasında tepkime nativ protein ve doğal proteinin ^...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membrane	Whatman	Z613630
Antibody blocker solution	LTK BioLaboratories		To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader	Thermo Electron Corporation	51118170
Colloid gold (40 nm) solution	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albumin	Gibco	15561-020
Rapid test immno-strip printer	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)	Protech		Gel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250	Bio-Rad	1610436	Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels