A المجهرية نموذج رواية لمنتبذ، جناح كتلة جدار الصدر، الغدة الصعترية، وزرع القلب في الفئران

Summary

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Abstract

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.^1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

Introduction

Cardiac transplantation is the treatment of choice for end-stage heart failure. Both technical advancements and pharmacological innovations have propelled the field to early graft acceptance rates above 90%.^12,13 Despite this, 60-80% 5-year graft survival is at a standstill and chronic rejection, characterized by transplant vasculopathy, remains inevitable.^14-16 Furthermore, patients are subjected to multiple surgical procedures and lifelong immunosuppression, which are associated with chest wall deformities and medical sequelae and toxicities, respectively. The need for innovative approaches to extend allograft survival, minimize the immunosuppressive requirements, and offer reconstructive options for anatomical deformities is pressing.

Vascularized composite allotransplantation offers a unique strategy for improving heart transplant outcomes both from an immunological aspect as well as a reconstructive perspective.¹⁷ Vascularized composite allografts are also unique in a way that they have an inherent source of donor-derived hematopoietic stem cells which has shown a favorable ability to reduce immunosuppression and induce and sustain mixed chimerism.^1-8 Additionally, co-transplantation of the thymus has shown to prolong survival of both, solid organ transplants and vascularized composite allografts.^2,9-11 Combining these strategies with heart transplantation offers a novel solution to the aforementioned challenges facing heart transplantation.¹⁸

Murine models serve as excellent platforms for mechanistic in vivo investigation because of the availability of antibodies and well-defined inbred and knockout strains.^19-21 Although heart transplantation in mice is commonly studied using a heterotopic intraabdominal microsurgical suture transplant model^22-25, a heterotopic, cervical, non-suture cuff technique model has shown to be extremely replicable, reliable, and carries fewer rates of thrombosis.^19,26,27 The goal of this study is to develop a heterotopic en bloc osteomyocutaneous chest wall, thymus, and heart transplant technique in mice to study the immunological mechanisms of combined solid organ and vascularized composite allotransplantation using a cervical non-suture cuff technique. This cluster allograft is perfused through the anastomosis of the donor descending aorta to the right common carotid artery and the donor pulmonary artery to the right external jugular vein. Preservation of the internal thoracic vessels and associated thymus branches is paramount to perfusing the chest wall (sternum, ribs, muscles, and skin) and thymus.

Protocol

تم الانتهاء من جميع الإجراءات المنطوق في الامتثال مع جامعة جونز هوبكنز وزارة الزراعة في الولايات المتحدة ومتطلبات الخدمة الصحية العامة. يتبع هذا البروتوكول لجنة جامعة جونز هوبكنز رعاية الحيوان واستخدام، وافق مجلس المراجعة المؤسسية المبادئ التوجيهية (عدد بروتوكول M013M490). تم تسجيل البيانات بقاء النهائي للإجراءات الجراحية هو موضح أدناه. كل من الحيوانات المانحة والمتلقية تلقي التخدير وقائية باستخدام البوبرينورفين عند 0.1 مغ / كغ الشوري ساعة واحدة قبل الجراحة وفي البوبرينورفين الحيوان المتلقي هو إعادة تدار-في نفس الجرعة بعد زرع وإعادة مداوي حسب الحاجة في أول 48 ساعة بعد الجراحة.

1. المانحة المزروع الانتعاش

ملاحظة: يبدأ الجزء المانحة للزراعة 40 دقيقة في وقت سابق من زرع المتلقية للتقليل من الوقت تخدير المتلقي وتسهيل فترة نهاية في وقت واحد أو الأذن قليلاوقت انتهاء لير مقابل إعداد المتلقي.

1. استخدام أدوات معقمة المجهرية القياسية وقفازات معقمة لهذا الإجراء. مختبرنا يستخدم التعقيم الأوتوكلاف من الأدوات المجهرية.
2. تخدير الماوس المانحة (الذكور) باستخدام الأيزوفلورين تحريض المرذاذ عند 4٪. استخدام كليبرز الميكانيكية ارضحي إزالة الشعر من عنق الرحم، والصدر، ومنطقة البطن. وضع الحيوان في موقف ضعيف والحفاظ على الأيزوفلورين على 1-2٪ من خلال مخروط الأنف. ضمان التخدير المناسب في جميع أنحاء الداخلي من خلال تقييم دوري منعكس قرصة أخمص قدميه الانسحاب.
3. قبل شق الجلد، وإعداد نطاق واسع المنطوق من خلال تطبيق البوفيدون اليود مطهر تليها ايزوبروبيل باستخدام قطعة من القطن المعقم.
4. تبدأ سطحية عرضية شق الجلد مع مقص عبر الجلد عنق الرحم والبطن. ربط كل من شقوق بشكل ثنائي على غرار منتصف الإبط.
5. باستخدام ملقط المجهريةتشريح المنطقة العنقية ثنائيا لتحديد وligate وتقسيم عروق الوريد الخارجية مع 6-0 خياطة الحرير ومقص. ثم استخدام كهربي تقسيم عضلات القصية الترقوية الخشائية لفضح عروق الوريد الداخلية والشرايين السباتية المشتركة، على المستوى الثنائي. تمرير الخيط الحرير 6-0 تحت اليسار من جانب والحق من جانب والشريان السباتي المشترك وعروق الوريد الداخلية في الأزياء بالجملة.
   ملاحظة: وسوف تكون مرتبطة ومقسمة في وقت لاحق في الخطوة 1.9.
6. بشدة تقسيم عضلات حزام وما يرتبط بها من الأنسجة الهالي فضفاضة، وتقع الأمامي إلى القصبة الهوائية، وذلك باستخدام مقص لتحرير المرفقات المتبقية من منطقة عنق الرحم.
7. باستخدام كهربي ثنائي القطب وتشريح حاد، وتقسيم العضلات الصدرية الكبرى والترقوة لفضح السفن تحت الترقوة وligate (6-0 خياطة الحرير) وتقسيم قريب.
8. المقبل، بلطف، فهم وسحب القضيب الحيوان. على طول ظهر القضيب تصور الوريد الظهري للقضيب، وتطهيرالمنطقة مع ايزوبروبيل. باستخدام إبرة 30 G، وضخ 30،000 وحدة من الهيبارين عن طريق الوريد عن طريق الوريد الظهري والسماح القضيب لترتد مرة أخرى إلى موضعه الأصلي. قد يحدث تسرب جزء من الحل الهيبارين في الأنسجة المحيطة بها.
9. باستخدام العلاقات السائبة وضعت سابقا حول الشريان السباتي المشترك وحبل الوريد الداخلي، ligate وتقسيم الهياكل، على المستوى الثنائي.
10. استخدم المقص المقبلة لجعل شق intrabdominal عرضية. سلب الأمعاء لفضح infrahepatic الوريد الأجوف السفلي وحقن 2 مل من البرد حل شلل القلب الأوروبية كولينز في infrahepatic الوريد الأجوف السفلي. ضمان حقن السليم من خلال وضع تصور تلون الكبد ووقف ضربات القلب قبل التقدم إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول اليورو كولينز في المختبر لدينا، انظر الجدول الكواشف وأدوات محددة.
11. باستخدام مقص الوصول إلى تجويف داخل الصدر عبر diaph الثنائيةشق ragmatic من البطن عرضة للخطر. تمديد شق رأسيا من خلال العضلات intercostals والضلوع. تعكس جدار الصدر تعريض القلب والغدة الصعترية، والأوعية الدموية الكبرى مع ضمان الحفاظ على الأوعية الصدرية الداخلية على طول جدار الصدر في وقت واحد.
12. حقن فوق الكبد الوريد الأجوف السفلي مع 4 مل من البرد حل شلل القلب الأوروبية كولينز.
13. تحديد جذر الشريان الأورطي وتتبع بشكل أقصى للالأبهر النازل. خفض حاد في الشريان الأورطي النازل (الحفاظ على طول القصوى).
14. التعرف على الجذع الرئوي وتقسيم عادل الأقرب إلى نقطة فرعه (الحفاظ على طول القصوى). ثم باستخدام 2 مل من البرد حل شلل القلب الأوروبية كولينز، تدفق الجذع الرئوي والقلب عن طريق وضع البلاستيك اللين طرف القسطرة في التجويف من الجذع الرئوي.
15. باستخدام 6-0 خياطة الحرير، ligate وتقسيم الوريد الأجوف السفلي، التقاء الأوردة الرئوية، وفروع التبعي من الثنائي الوريد الأجوف العلوي. ثم رفعوتشريح رأسيا القلب من المرفقات على طول القصبات الهوائية الجذعية الرئيسية والقصبة الهوائية مع الحرص على عدم دخول مجرى الهواء. باستخدام كهربي حاد وثنائي القطب تشريح جدار الصدر والغدة الصعترية، والقلب تحريرها تماما من الماوس المانحة.
16. وأخيرا، وتقليم جدار الصدر المزروع خارج الحي إلى حجم أصغر، وذلك باستخدام مقص، وعلى طول القص والأضلاع الجانبية، مع الحرص على عدم تعطيل السفن الصدرية الداخلية (الشكل 1A). لتقليل النزف بعد إعادة التوعي، استخدم electrocauterization ثنائي القطب على طول حدود القص osteomusculocutaneous.
17. وضع المزروع في 10 مل من البرد (4 ^س مئوية) حل اليورو كولينز إذا لم يتم إعداد المتلقي لأقحم. ومع ذلك، إذا كان المستفيد هو على استعداد لأقحم، ونقل المزروع مباشرة إلى الميدان المتلقي المنطوق.

2. إعداد مستلم

ملاحظة: لتقليل وقت تخدير المتلقي،بدء إعداد المتلقي في محطة منفصلة المنطوق حوالي 40 دقيقة قبل الانتهاء من حصاد المزروع المانحة.

1. استخدام مجموعة منفصلة من الأدوات المجهرية العقيمة القياسية وقفازات معقمة لهذا الإجراء.
2. تخدير الماوس المتلقي (ذكر أو أنثى) باستخدام الأيزوفلورين تحريض المرذاذ عند 4٪. استخدام كليبرز الميكانيكية ارضحي إزالة الشعر من حق المنطقة العنقية والصدرية.
3. ضع الماوس في موقف ضعيف وزاوية الطرف العلوي الأيمن قليلا دون المستوى تشكيل زاوية 110 درجة بين الرأس والطرف العلوي الأيمن. الحفاظ على التخدير على 1-2٪ الأيزوفلورين من خلال مخروط الأنف.
4. وضع النفط مرهم للعين على العيون الماوس باستخدام قضيب من القطن طرف. قبل شق الجلد، وإعداد نطاق واسع في موقع الجراحة باستخدام البوفيدون اليود مطهر تليها الإيزوبروبيل.
5. باستخدام مقص، وجعل شق الجلد من خط الوسط على طول بور أدنى الصحيحدير للفك السفلي وتوسيع شق infero-أفقيا إلى منطقة الصدر الأيمن. عن طريق تشريح حادة مع ملقط الاوعية الدموية الدقيقة، وحشد من حبل الوريد الخارجي من قبل حرة محيطي السفينة من الأنسجة الرخوة والبرانية. تقسيم جميع فروع باستخدام كهربي، وإزالة الفص الأيمن من الغدة تحت الفك السفلي باستخدام تشريح حادة وكهربي إلى مساحة حرة للالمزروع.
6. ضمان طول ما يكفي من حبل الوريد الخارجي لإيفرت على الكفة، وligate الوريد الخارجي الوريد باستخدام خياطة 6-0 الحرير. إدراج الوريد من خلال تجويف صفعة قبل القطع بوليميد واستخدام الاوعية الدموية الدقيقة المشبك بلدغ لإصلاح مجمع سفينة الكفة في المكان. ثم استخدام مقص، وتقسيم قريب من حبل الوريد الخارجي، إيفرت على الكفة، وإصلاح في مكان مع خياطة 10-0 النايلون. (الشكل 1B)
7. تقسيم العضلات القصية الترقوية الخشائية اليمنى مع كهربي ثنائي القطب لفضح الشريان السباتي المشترك. الغوغاء محيطيilize الشريان رأسيا إلى القاصي معظم نقطة داخل منطقة عنق الرحم. ويتم إنجاز ذلك باستخدام تشريح حادة السفينة مع ملقط لإزالة الأنسجة الرخوة والبرانية المحيطة بها.
8. باستخدام 6-0 خياطة الحرير، ligate وتقسيم الشريان السباتي المشترك. يمر الشريان من خلال تجويف صفعة قبل القطع بوليميد، وإصلاحه في مكان مع البلدغ الاوعية الدموية الدقيقة المشبك أقرب إلى مدخل الصدر وقت ممكن. تقسيم السفينة بشكل أقصى، تمدد بلطف السفينة باستخدام موسع المجهرية، إيفرت على الكفة، وإصلاح في مكان مع خياطة 10-0 النايلون. (الشكل 1B)
   ملاحظة: يتم وصف موسع المجهرية محدد في الجدول من الكواشف وأدوات محددة.

3. المزروع أقحم

1. الحفاظ على الأجهزة معقمة القياسية وقفازات معقمة لوضع المزروع داخل منطقة عنق الرحم المتلقي في رأسا على عقب وموقف منحرف.
2. بعد ذلك، وضع منطقة المسؤولية الهابطة المانحةالتجويف التشنج على بناء صفعة الشرياني للمتلقي، وإصلاحه في مكان مع خياطة 10-0 النايلون (الشكل 1C و1D).
3. أزياء نفس مفاغرة كما في الخطوة 3.2 بين الشريان الرئوي المانحة ومقلوبة الخارجي بناء الوريد الوداجي مرتجلا من الماوس المتلقي (الشكل 1C و1D).
4. أولا إزالة المشبك الاوعية الدموية الدقيقة وريدي (الخارجية الوداجي المنوال المشبك) ثم الافراج عن المشبك الشرياني (الشريان السباتي المشترك الشريان المشبك). خلال ضخه في الشرايين، وفحص مجمل المزروع لمعالجة أي نزيف. إذا تصور النزيف، تطبيق المشبك الشرايين لتقليل فقدان الدم والتخفيف من مصدر النزيف باستخدام كهربي ثنائي القطب.
5. تفقد الكسب غير المشروع والتأكد من الارقاء. إطلاق سراح وإزالة المشبك الاوعية الدموية الدقيقة في الشرايين. مراقبة القلب تظهر علامات ضخه، والتي سوف تكون واضحة على الفور مع التوسع السريع في حجم حجرات القلب، وانتظر بتناول أن تبدأ خلال 0.5-1 دقيقة. استخدام المياه المالحة الدافئة (35 درجة مئوية) لترطيب القلب.
6. ثنى جدار الصدر إلى الوضعية التشريحية حتى لا تحفز أي مجعد أو التوترات على anastomoses. إغلاق الجلد من الجروح يستخدم 6-0 خيوط النايلون المستمرة (الشكل 1E).

4. بعد العملية الجراحية العناية

1. تدير 0.3 مل العادية المالحة السائل داخل الصفاق البلعة على الفور بعد العمل الجراحي لاستبدال السوائل.
2. ثم حقن تحت الجلد البوبرينورفين (0.1mg / كغ) وenrofloxacin (5mg / كغ) للألم والإصابة الوقاية، على التوالي.
3. وضع الحيوان تحت مصباح الحرارة حتى الاستيقاظ من التخدير والعودة إلى الاستلقاء القصية. خلال فترة الانتعاش، وفحص الرقبة لتصور القلب النابض fibrillating للالمزروع ضمان نضح المزروع كاف.
4. مرة واحدة مستيقظا وفي وضعية الاستلقاء، وعودة الماوس إلى قفص منفصل (دون رفقة الفئران الأخرى) حيث يمكن الحصول على الغذاء والمياه الإعلانية libitum. بسبب أي اقتراح المقيدة الطفيفة المؤقتة في الطرف العلوي الأيمن، وترك مصدر الغذاء الجيلاتين على أرضية القفص.
5. مراقبة الماوس المتلقي لمدة 1 ساعة بعد العمل الجراحي ومن ثم إعادته إلى مرفق القفص حيث يمكن الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية ويتم فحص ثلاث مرات في اليوم لمدة ساعة 24 الأولى للنشاط والحصة الغذائية. مراقبة الفئران لعلامات الألم والضيق وإعادة الجرعة مع البوبرينورفين (0.1mg / كلغ) تحت الجلد مرتين يوميا حسب الحاجة للساعة 72 الأولى. فحص الحيوانات يوميا بعد ذلك ووزن لهم كل أسبوع.
6. التشاور مع موظف البيطري إذا تعرض أي الفئران علامات الألم والضيق، أو انخفضت كمية الأعلاف. النظر في القتل الرحيم في وقت مبكر (في بروتوكول لدينا أسلوب القتل الرحيم توظف CO ₂ جرعة زائدة لمدة 7 دقائق، تليها خلع عنق الرحم).
7. يتم تعريف وقف ضربات القلب المزروع بمثابة نقطة نهاية محددة مما دفع الماوس لتكون الصورةacrificed.

النتائج

مسانج C57BL / 6 زرع حققت البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. أثبتت تصميم المزروع (الشكل 1) أن تكون ناجحة من وجهة نظر البقاء على قيد الحياة الحيوانية والقدرة على تقييم بقاء المزروع مستمر. وقد تجلى ذلك من خلال الجلد المغطي قابلة للحياة، ونشط نمو الشعر المزروع ال...

Discussion

هناك العديد من الظواهر التي تؤثر في التحقيق المناعية من زرع الطعم الخيفي، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على آليات الرفض الحاد والمزمن، تقديم المستضد المباشر وغير المباشر، وتوعية المتلقي، أو تحريض الخيمرية مختلطة. وأصبحت ¹⁹ النماذج الحيوانية يتم تطبيق معيار الذهب ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d