Роман микрохирургические модели для Гетеротопическая, Собственная Блока грудной стенки, тимус, и Трансплантация сердца у мышей

Резюме

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Аннотация

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.^1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

Введение

Cardiac transplantation is the treatment of choice for end-stage heart failure. Both technical advancements and pharmacological innovations have propelled the field to early graft acceptance rates above 90%.^12,13 Despite this, 60-80% 5-year graft survival is at a standstill and chronic rejection, characterized by transplant vasculopathy, remains inevitable.^14-16 Furthermore, patients are subjected to multiple surgical procedures and lifelong immunosuppression, which are associated with chest wall deformities and medical sequelae and toxicities, respectively. The need for innovative approaches to extend allograft survival, minimize the immunosuppressive requirements, and offer reconstructive options for anatomical deformities is pressing.

Vascularized composite allotransplantation offers a unique strategy for improving heart transplant outcomes both from an immunological aspect as well as a reconstructive perspective.¹⁷ Vascularized composite allografts are also unique in a way that they have an inherent source of donor-derived hematopoietic stem cells which has shown a favorable ability to reduce immunosuppression and induce and sustain mixed chimerism.^1-8 Additionally, co-transplantation of the thymus has shown to prolong survival of both, solid organ transplants and vascularized composite allografts.^2,9-11 Combining these strategies with heart transplantation offers a novel solution to the aforementioned challenges facing heart transplantation.¹⁸

Murine models serve as excellent platforms for mechanistic in vivo investigation because of the availability of antibodies and well-defined inbred and knockout strains.^19-21 Although heart transplantation in mice is commonly studied using a heterotopic intraabdominal microsurgical suture transplant model^22-25, a heterotopic, cervical, non-suture cuff technique model has shown to be extremely replicable, reliable, and carries fewer rates of thrombosis.^19,26,27 The goal of this study is to develop a heterotopic en bloc osteomyocutaneous chest wall, thymus, and heart transplant technique in mice to study the immunological mechanisms of combined solid organ and vascularized composite allotransplantation using a cervical non-suture cuff technique. This cluster allograft is perfused through the anastomosis of the donor descending aorta to the right common carotid artery and the donor pulmonary artery to the right external jugular vein. Preservation of the internal thoracic vessels and associated thymus branches is paramount to perfusing the chest wall (sternum, ribs, muscles, and skin) and thymus.

протокол

Все оперативные процедуры были завершены в соответствии с Университета Джонса Хопкинса и Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства и требований системы общественного здравоохранения. Этот протокол следует университет комитет Джонса Хопкинса уходу и использованию животных, Экспертный совет утвердил руководящие (номер протокола M013M490). Данные выживаемости Окончательное был записан для хирургических процедур, описанных ниже. Оба доноров и получателей животные получают преимущественные анестезией бупренорфин в дозе 0,1 мг / кг подкожно один час до операции и в животного-реципиента бупренорфина повторно вводят в той же дозе после трансплантации и повторно дозируют при необходимости в течение первых 48 часов после операции.

1. Донор аллотрансплантата Восстановление

Примечание: Начните доноров часть трансплантата 40 мин раньше, чем пересадки получателя, чтобы свести к минимуму время получатель анестезии и для облегчения одновременной время окончания или слегка ухолжец время окончания против подготовки реципиента.

1. Используйте стандартные стерильные микрохирургических инструментов и стерильных перчаток для процедуры. Наша лаборатория использует автоклав стерилизации микрохирургических инструментов.
2. Обезболить доноров мыши (мужской), используя ИФ индукции испаритель на 4%. Использование атравматичные механические машинки для стрижки удалить волосы с шейки матки, грудной и брюшной области. Поместите животное в положении лежа на спине и поддерживать изофлурана на 1-2% через носовой конус. Обеспечить достаточную анестезию всей процедуры периодически оценке ОО щепотка снятие рефлекс.
3. До рассечения кожи, широко подготовить оперативным путем применения повидон йод антисептическим последующим изопропилового спирта с использованием стерильного ватного тампона.
4. Начните с поверхностной поперечной разрез кожи с помощью ножниц по всей шейного и кожи живота. Соедините оба разрезы на двусторонней основе по линии midaxillary.
5. Использование микрохирургических щипцырассекать шейном отделе на двусторонней основе, чтобы определить, перевязывать и разделить внешние яремной вены с 6-0 шелковой нити и ножницы. Затем, используя электрокоагуляция разделить кивательной мышцы, чтобы выставить внутренние яремные вены и общих сонных артерий, на двусторонней основе. Пройдите 6-0 шелковой нити под левосторонний и правосторонний общей сонной и внутренней яремной вены в объемной моды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут привязаны и разделен позже в шаге 1.9.
6. Резко разделить ремешок мышцы и связанных с ними свободную рыхлой соединительной ткани, расположенные кпереди от трахеи, используя ножницы, чтобы освободить оставшиеся вложения в шейном отделе.
7. Использование биполярного электрокоагуляции и резкое рассечение, разделить большой грудной мышцы и ключицы, чтобы разоблачить подключичной сосуды и перевязывать (6-0 шелковой нити) и разделить проксимально.
8. Далее, аккуратно, понять и вывести пенис животного. По спинке полового члена визуализировать спинной вены полового члена и продезинфицироватьрегион с изопропилового спирта. С помощью иглы 30 G, вводят 30000 единиц гепарина внутривенно через заднюю вену и позволяют пенису отдачи обратно в исходное положение. Частичное утечки раствора гепарина в окружающие ткани могут возникнуть.
9. Используя ранее размещенные сыпучих связей по всему общей сонной артерии и внутренней яремной вены, перевязывать и разделить структуры, на двусторонней основе.
10. Следующая ножницы использовать, чтобы сделать поперечную intrabdominal разрез. Eviscerate кишечник, чтобы разоблачить infrahepatic нижнюю полую вену и вводят 2 мл холодной кардиоплегии раствором Евро-Коллинз в infrahepatic нижней полой вены. Обеспечить надлежащее инъекции по визуализации обесцвечивание печени и прекращение сердцебиения до продвижения к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: решение Евро-Коллинз подготовлен в нашей лаборатории, см таблицу специфических реагентов и приборов.
11. Использование ножницы доступ внутригрудное полость с помощью двусторонней diaphragmatic разрез с открытой брюшной полости. Расширьте разрез медиальнее через межреберных мышц и ребер. Отражение грудной стенки подвергая сердце, тимус и большие сосуды одновременно обеспечивая сохранение внутренних грудных сосудов вдоль стенки грудной клетки.
12. Внедрить suprahepatic нижнюю полую вену с 4 мл холодной кардиоплегии раствором Евро-Коллинз.
13. Определить корень аорты и проследить дистальнее нисходящей аорты. Резко сократить нисходящей аорты (сохраняя максимальную длину).
14. Определить легочный ствол и разделить только ближний к его точке ветвления (сохраняя максимальную длину). Затем с помощью 2 мл холодного раствора кардиоплегии Евро-Коллинз, промыть легочного ствола и сердце путем размещения мягкую пластиковую кончика катетера в просвет легочного ствола.
15. Использование 6-0 шелковой нити, перевязывать и разделить нижнюю полую вену, слияния легочных вен и аксессуаров ветви двустороннего верхней полой вены. Затем поднятьи анализировать сердечную краниально от привязанностей вдоль главного стебля бронхов и трахеи с осторожностью, чтобы не войти в дыхательные пути. Использование острый и биполярного электрокоагуляции рассекать грудная стенка, тимус, и сердце полностью высвобождая его из мыши-донора.
16. Наконец, обрезать аллотрансплантата грудной стенки Экс Vivo до меньшего размера, с помощью ножниц, вдоль грудины и боковой ребрышками, с осторожностью, чтобы не нарушить внутренней грудной сосуды (рис 1а). Чтобы свести к минимуму кровотечение после реваскуляризации, использовать биполярный электрокаутеризации вдоль границ osteomusculocutaneous грудины.
17. Поместите аллотрансплантата в 10 мл холодной ⁽⁴ O Цельсия) решение Евро-Collins, если получатель не готов к вставке. Однако, если получатель готов к вставке, передать аллотрансплантата прямо получателя операционного поля.

2. Получатель Подготовка

Примечание: Для того, чтобы свести к минимуму время получатель анестезии,начать подготовку получатель на отдельном оперативного станции примерно 40 мин до завершения уборки донор трансплантата.

1. Используйте отдельный набор стандартных стерильных инструментов и микрохирургических стерильные перчатки для процедуры.
2. Обезболить мышь получатель (мужчина или женщина), используя ИФ индукции испаритель на 4%. Использование атравматичные механические ножницы удалить волосы с правой шейного и грудного региона.
3. Наведите в положении лежа на спине и угла правой руке слегка книзу, образуя угол 110 градусов между головой и правой верхней конечности. Поддержание анестезии на 1-2% изофлуран через носовой конус.
4. Поместите нефтяной глазной мази на глазах мыши, используя хлопка аппликатора. До разрез кожи, широко подготовить место операции с помощью йодповидон антисептическое последующим изопропилового спирта.
5. Используя ножницы, сделать разрез кожи от средней линии вдоль правой нижней Бордер нижней челюсти и расширить разрез InFero-сбоку от правой грудной области. Использование тупым пинцетом с микрососудистых, мобилизовать внешние яремной вены по окружности свободного судна из мягкой ткани и адвентиции. Разделите все ветви, используя электрокоагуляции, и снимите правую мочку подчелюстной слюнной железы с использованием резкого рассечение и электрокоагуляции, чтобы освободить место для аллотрансплантата.
6. Обеспечить достаточную длину наружной яремной вены выворачивания над манжету, и лигировать вену внешнего использованием яремную вену 6-0 шелковой нити. Вставьте вену через просвет нарезанные полиимидной манжеты и использовать бульдожьего микрососудистой зажим для фиксации сосуда манжеты комплекс на месте. Затем, используя ножницы, проксимально разделить внешний яремную вену, Эверт на манжете, и закрепить в месте с 10-0 нейлона шва в. (1В)
7. Разделите правильный кивательной мышцы с биполярным электрокоагуляции, чтобы выставить общую сонную артерию. По окружности мобilize артерии медиальнее дистальной большей точки в шейном отделе. Это достигается с помощью тупой диссекции сосуда щипцами для удаления мягких тканей и окружающей адвентиции.
8. Использование 6-0 шелковой нити, перевязывать и разделить общую сонную артерию. Пропустите через артерию в просвет нарезанные полиимидной манжеты и закрепить его на месте с бульдогом микрососудов зажима как можно ближе к грудной входе, как это возможно. Разделите судно дистально, мягко расширяются судно, используя микрохирургической расширитель, Эверт на манжете, и закрепить в месте с 10-0 нейлона шва в. (1В)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретная микрохирургическая расширитель описано в таблице конкретных реагентов и приборов.

3. Врезка Аллотрансплантат

1. Поддержание стандартного стерильного инструментария и стерильные перчатки, чтобы разместить аллотрансплантата в течение получателя шейного отдела в перевернутом положении и наклонном.
2. Далее, поместите донор нисходящую AORтик просвет над артериальной манжеты конструкции получателя и зафиксируйте его в месте, которое он с 10-0 нейлона шва в (рис 1С и 1D).
3. Моды же анастомоза, как в шаге 3.2 между донорами легочной артерии и вывернутой внешней яремной вены манжеты конструкции мыши-реципиента (рис 1С и 1D).
4. Сначала удалите венозный зажим капилляров (наружная яремная вена) зажим, а затем отпустите артериальной зажим (зажим общей сонной артерии). Во время реперфузии артериальной осмотрите полноту аллотрансплантата для решения любой кровоизлияния. Если кровоизлияние визуализируется, повторно артериальное зажим, чтобы минимизировать потери крови и смягчить источника кровотечения с помощью электрокоагуляции биполярного.
5. Осмотрите трансплантата и обеспечить гемостаз. Отпустите и полностью удалить артериальной микрососудов зажим. Соблюдайте сердце, чтобы показать признаки реперфузии, которые будут мгновенно очевидно с быстрым расширением объема камер сердца, и ждать беды, чтобы начать в течение 0,5-1 мин. Используйте теплую солевой раствор (35 ° по Цельсию), чтобы увлажнить сердце.
6. Накройте грудной стенки в анатомическом положении, чтобы не вызвать каких-либо перегибов или напряженности на анастомозов. Закройте кожу хирургической раны, используя 6-0 в непрерывных швов нейлон (рис 1E).

4. Послеоперационный

1. Администрирование 0,3 мл физиологического раствора внутрибрюшинно болюс жидкости немедленно после операции по замене жидкости.
2. Затем подкожно вводят бупренорфин (0,1 мг / кг) и энрофлоксацин (5 мг / кг) за боль и инфекции профилактики, соответственно.
3. Поместите животное под тепловой лампой до пробуждения от наркоза и вернуться к грудины лежачее положение. Во время восстановления, проверьте шею визуализировать фибрилляцию сердцебиение аллотрансплантата обеспечения адекватного трансплантата перфузии.
4. После того, как проснулся и в лежачем положении, вернуться мыши отдельной клетке (без компании других мышей), Где он может получить пищу и воду без ограничений. Из любого временного незначительной ограничительного движения правой верхней конечности, оставить источник пищевой желатин на полу клетки.
5. Соблюдайте мышь получатель в течение 1 часа после операции, а затем вернуть его в клетку, где ей можно получить пищу и воду без ограничений и проверяемого три раза в день в течение первых 24 ч для деятельности и потребления питания. Монитор мышей на наличие признаков боли и страданий и повторной дозы бупренорфина с 0,1 мг (кг /) подкожно два раза в день по мере необходимости для первого 72 ч. Изучите животных ежедневно после этого и взвесить их каждую неделю.
6. Проконсультируйтесь с ветеринарным сотрудника, если какие-либо мыши обнаруживают признаки боли, бедствия или снижение потребления корма. Рассмотрим раннее эвтаназии (в нашем протоколе метод эвтаназии использует _СО 2 передозировки в течение 7 минут, после чего цервикальной дислокации).
7. Прекращение аллотрансплантата сердцебиения определяется как конкретной конечной точки наведении мыши, чтобы быть сacrificed.

Результаты

Сингенная C57BL / 6 трансплантации достигается долгосрочное выживание. Дизайн аллотрансплантата (рис 1) оказался успешным с точки зрения выживания животных и способность оценивать текущую выживание трансплантата. Это было продемонстрировано через вышележащие кожи оставаясь жи...

Обсуждение

Есть множество явлений, фактор в иммунологическом исследовании аллотрансплантации, которые включают, но не ограничиваются ими механизмов острой и хронической отторжение, прямых и косвенных презентации антигена, получатель сенсибилизации, или индукции смешанной химеризма. ¹⁹ Жи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d