JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Abstract

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introduction

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تم استعراض جميع بروتوكولات البحوث التي وصفها جامعة شيكاغو المؤسسي مجلس مراجعة (IRB). تم الحصول على الموافقة المسبقة من كل مريض قبل الجراحة وتمت الموافقة على الدراسة من جامعة شيكاغو IRB. A السلامة البيولوجية نوع مجلس الوزراء (2) وقفازات وينبغي أن تستخدم عند التعامل مع الأنسجة البشرية للحماية والحد من مخاطر تلوث الخلايا.

1. العزلة والثقافة من خلايا انسجة هو دون تغيير الابتدائية

  1. جمع الأنسجة البشرية والتحضير.
    1. الحصول على عينات من الثرب البشري، 2 سم 3، وإزالتها خلال عملية جراحية في البطن، وتزج الأنسجة فورا في RT الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الشكل 2A). قطعة من الثرب 3 سم × 2 سم وعادة ما ينتج 1000000 الخلايا الأولية الإنسان الظهارية (HPMC) و 200،000 الخلايا الليفية الإنسان الأساسية أو الخلايا الليفية الثرب العادية (NOF).
    2. تدور باستمرار PBS كانت مغمورة الأنسجة في عند 0.5 x ج لمدة 3دقيقة في أقرب وقت ممكن بعد جمع (<2 ساعة في PBS) ونقل الأنسجة لالطازج 20 مل PBS في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تقطيع الأنسجة في 5MM 3 قطع من قبل تنميق مع المشارط في 15 سم القطر، صحن الثقافة العقيمة (الشكل 2B).
  2. الأولية الخلية الظهارية الإنسان العزلة 8
    1. عزل HPMC، ونقل الأنسجة المفروم إلى 50 مل أنابيب مخروطية وانتظر 1 دقيقة لقطع صلبة لتطفو إلى الأعلى (الشكل 2C & D). سوف HPMC وخلايا الدم الحمراء (RBC) تكون موجودة في السائل على الجزء السفلي. استخدام الماصة لإزالة السائل من أسفل الأنبوب وإلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تدور السائل أسفل عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق ونضح طاف من بيليه HPMC / RBC.
      1. كرر هذه العملية ثلاث مرات: 20 مل PBS إضافة إلى الأنسجة المفروم، تسمح الأنسجة في الارتفاع، وإزالة السائل من أسفل مع ماصة وداخل الأنبوب HPMC / RBC، تدور باستمرار، وإزالةطاف. بعد الانتهاء من جميع يدور ويستنشق طاف، وبيليه تحتوي على HPMC وRBC.
    2. لوحة كافة الخلايا من بيليه إلى 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل (DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني [FBS]، 1٪ الفيتامينات MEM [93 ملغ / L]، 1٪ الأحماض MEM الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغم / لتر]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]).
    3. إجراء غسل PBS الثانوي لعزل HPMCs إضافي.
      1. ليغسل PBS الثانوي، يهز الأنسجة الصلبة المتبقية في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من برنامج تلفزيوني، ثم انتظر 1 دقيقة للأنسجة لتطفو إلى الأعلى. إزالة السائل من أسفل الأنبوب إلى أنبوب جديد، الطرد المركزي عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق، ونضح طاف.
      2. لوحة كل HPMC / RBC من PBS الثانوي يغسل في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
    4. لعزل أي صemaining HPMC، يهز الأنسجة المفروم في 200 دورة في الدقيقة، 37 ° درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من 1 1 0.25٪ التربسين 25 ملي EDTA: حل PBS من حيث الحجم. السماح للأنسجة في الارتفاع، جمع السائل في الجزء السفلي من أنبوب إلى أنبوب جديد 50 مل، وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق.
      1. نضح في وطاف لوحة كل HPMC / RBC في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
    5. ثقافة الخلايا مطلي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في بيئة مرطب. تغذية الخلايا مطلي بإضافة 15 مل من وسائط النمو الكامل في أيام 3 و 5 دون إزالة وسائل الإعلام المستهلك. HPMC يمكن أن يكون مثقف لمدة 5-7 أيام قبل تقسيم.
      1. استخدام المنخفض مرور HPMC (حتى مرور 2) في جميع التجارب لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال ويفضل مع الهدف 20X مع الفارق البلاستيك قدرات التدخل التباين أو الهدف 4-20x مع النقيض من المرحلة capabilitieالصورة (الفلاتر المرحلة على النقيض المجهر) لاتخاذ كافة الصور من الخلايا، والهدف 10X () في حقل مشرق لتحليل المناعى 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) تلطيخ.
    6. تأكد من أن HPMC هي مكعبة والتعبير عن cytokeratin 8 و vimentin قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3A، C، E).
  3. NOF العزلة 8
    1. إعداد 10 مل من مخزون من نوع كولاجيناز III الحل (10X) عن طريق الجمع بين 1: 1 خليط من 100X القلم بكتيريا: 1 1500 وحدة النشاط / مل من نوع كولاجيناز الثالث: النشاط 714 وحدات / مل من هيالورونيداز في برنامج تلفزيوني.
    2. هزة الأنسجة الثرب مفروم التي تبقى بعد HPMC العزلة في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في 10 مل من 10X كولاجيناز النوع الثالث محلول مخفف في مصل الدم خالية من وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]). سوف الأنسجة هضمها تبدو مبهمة ويمكن أن يكون بعض الحطام ليفي (الشكل 2E).
    3. أجهزة الطرد المركزي في محلول يحتوي على خلايا NOF في تعليق عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق على RT، نضح في وطاف لوحة بيليه في 75 سم 2 قارورة في 13 مل من وسائط النمو الكامل.
    4. إزالة وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع 15 مل من جديدة وسائل الاعلام النمو الكامل بعد 24 ساعة. يمكن تربيتها NOF لمدة 1-3 أيام قبل تقسيم. سوف نلاحظ انتشار وNOF تتوقف عندما تصل الخلايا confluency.
    5. تأكد من أن الخلايا الليفية الإنسان الأساسية هي خلايا مستطيلة مسطحة والتعبير عن vimentin ولكن ليس cytokeratin 8 قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3B، D، F). استخدام NOF المنخفض مرور للتجارب (مثالي قبل مرور 3) لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال مع الهدف 20X مع البلاستيك قدرات DIC لاتخاذ جميع الصور المرحلة من الخلايا،والهدف 10X في حقل مشرق لتحليل المناعى DAB تلطيخ.

2. الطلاء وعضوي الثقافة 8

  1. NOF الإفراج عن 75 سم الثقافة قارورة من قبل الشطف مع 10 مل من PBS تليها 3 مل من 0.25٪ التربسين / 25 ملي EDTA لمدة لا تتجاوز 5 دقائق. تحييد التربسين مع 3 مرات على الأقل حجم وسائط النمو الكامل.
  2. نقل الخلايا trypsinized إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق. إزالة طاف وجلب خلايا احتياطية في 5 مل من وسائط النمو الكامل. استخدام عداد الخلية إلى عدد الخلايا المستخرجة من قارورة الثقافة.
  3. تمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائط النمو الكاملة لوحة 2،000-4،000 NOF لكل 100 ميكرولتر على لوحة سوداء، واضحة القاع، 96-جيدا. إضافة 0.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من الفئران الذيل الكولاجين الأول للخليط الخلية قبل الطلاء. السماح الخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 4 على الأقل ساعة، أو حتى الخلاياالتمسك سطح اللوحة.
  4. الإفراج HPMC من القارورة ثقافة باستخدام نفس الأساليب المذكورة في الخطوات 2.1 و 2.2. تمييع الخلايا في كمية مناسبة من وسائط النمو الكامل لوحة و10،000-20،000 HPMC في 50 ميكرولتر على رأس NOF مطلي بالفعل مع الكولاجين أنا في لوحات 96-جيدا. السماح للخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 18 ساعة على الأقل قبل بدء التجارب.
  5. ثقافة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -expressing HeyA8 خلايا سرطان المبيض في وسائل الاعلام النمو الكامل. وصفت HeyA8 خلايا سرطان المبيض التي fluorescently التعبير عن ناقلات lentiviral معربا عن الكوبيبودا cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). وينبغي أن يكون HeyA8 خلايا سرطان المبيض 80-90٪ متكدسة في يوم من الاستخدام (مرحلة النمو لوغاريتمي). الافراج عن الخلايا من لوحة الثقافة والعد باستخدام نفس الأساليب هو موضح في الخطوات 2،1-2،2 للخلايا الأولية.
  6. السماح خلايا سرطان المبيض للتعافي في وسائل الاعلام النمو الكامل لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية فيأنبوب مخروطي الشكل مع غطاء مختومة فضفاضة.

3. التصاق الفحص 8

  1. بعد الشفاء، بيليه خلايا سرطان المبيض من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم إزالة طاف وتمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائل الإعلام خالية من المصل لتحقيق تركيز من 50000 خلية / 100 ميكرولتر.
  2. عكس لوحات 96-جيدا مع HPMC الثقافات عضوي النمط / نوف لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات.
  3. عكس لوحة 96-جيدا لإزالة وسائل الإعلام والخلايا غير ملتصقة. استخدام الماصة متعددة في الطاقة المنخفضة لبعناية وبلطف الماصة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر، وعكس لوحة مرة أخرى. كرر PBS يغسل مرة واحدة أكثر من ذلك.
  4. عكس لإزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ إلى كل بئر. السماح لوحة للجلوس لمدة 20 ميلن لإصلاح الخلايا. بعد 20 دقيقة، عكس لوحة وإضافة 100 ميكرولتر PBS.
  5. لاحظ أن مضان إجمالي عدد الآبار يمكن الإبلاغ أو عدد الخلايا يمكن كميا. لالكمي، لوحة أول منحنى القياسية في نسختين باستخدام خلايا HeyA8 بتركيز من 1 مليون خلية / مل.
    1. جعل منحنى القياسية من خلال الدوران بنسبة 1 مليون خلية، وإزالة وسائل الإعلام، والسماح لهم الجلوس في 1 مل 4٪ لامتصاص العرق لمدة 20 دقيقة.
    2. خلايا تدور مرة أخرى وتنشئة في 1 مل PBS (خلايا إعادة فرز الأصوات لتأكيد 1000000 / تركيز مل). لوحة 50000، 40000، 30000، 20000، 10000، 5000، 1000، و 0 الخلايا في كل بئر من نسختين، وإضافة PBS لالحجم الكلي النهائي من 50 ميكرولتر في كل بئر.
  6. أسفل قراءة لوحة الثقافة على القارئ الفلورسنت لوحة (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر)، وتوسيع نطاق الآبار عالية (50،000 على منحنى قياسي). استخدام منحنى القياسية لحساب عدد خلايا سرطان المبيض انضمت إلى organotypثقافة جيم في كل بئر (الشكل 4A-C).

4. انتشار الفحص 10

  1. بعد استعادة خلايا سرطان المبيض (انظر الخطوات 2.5 و 2.6 أعلاه)، بيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم تمييع الخلايا في حجم مناسب من 1٪ FBS وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ FBS، 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]) لتحقيق تركيز 4000 الخلايا / 150 ميكرولتر.
  2. عكس لوحة 96-جيدا مع HPMC / ثقافات عضوي النمط عندها لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 150 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في 1٪ FBS وسائل الإعلام إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 72 ساعة.
  3. أسفل قراءة لوحة الثقافة على قارئ لوحة الفلورسنت مرة واحدة يوميا (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر) لتقييم انتشار نسبيمن الخلايا. مواصلة الفحص لمدة 96 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام في 48 ساعة (الشكل 5A-C). يجب الحرص على عدم تعكير صفو الثقافة عند تغيير وسائل الاعلام (لوحة للقلب هو الأفضل).

5. الغزو الفحص 8

  1. قبل الطلاء الثقافة 3D، إضافة 7.5 ميكروغرام الفئران الذيل الكولاجين أنا في 200 ميكرولتر PBS إلى 24 جيدا لوحة الثقافة إدراج (8 ميكرون حجم المسام). السماح للO لوحة احتضان / N، ثم إزالة بعناية PBS مع الماصة على الفور قبل الطلاء ثقافة عضوي النمط HPMC / NOF على إدراج المغلفة الكولاجين (الخطوة 2 أعلاه).
  2. إعداد خلايا سرطان المبيض كما في الخطوة 3.1. لوحة للخلايا سرطان المبيض على الثقافات عضوي النمط على إدراج، استخدم بعناية الماصة لإزالة وسائل الاعلام الزائدة من الجزء العلوي من تدرج. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية سرطان المبيض في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب.
  3. إضافة 750 ميكرولتر من وسائل الاعلام النمو الكامل في البئر دون إدراج للحث على الخلايا السرطانية فيvasion في الثقافات عضوي النمط. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: خلايا سرطان المبيض التي تغزو والثقافة عضوي النمط عبور إدراج ويبقى على الجانب السفلي من إدراج.
  4. بعد 24 ساعة، فهم إدراج مع ملقط لفترة وجيزة شطفه في كوب من برنامج تلفزيوني، ثم نقل إدراج في بئر فارغة. فرك الجزء العلوي من كل إدراج مع كلا الجانبين من مسحة القطن ليصبح المجموع 1 دقيقة. المكان بسرعة إدراج في لوحة تحتوي على 750 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في كل بئر. تسمح كل إدراج للجلوس في امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة قبل نقل إدراج في آبار مليئة 750 ميكرولتر PBS.
  5. عرض الخلايا غزت (الالتزام وثابتة على الجزء السفلي من إدراج) مع المجهر في 2.5x التكبير. عندما البئر كله داخل مجال الرؤية، وضبط التكبير إلى 10x و تأخذ 5 صور، واحدة بالقرب من مركز و 1 في كل رباعي من البئر، وتجنبالتقاط الصور التي هي قريبة جدا من الحواف. تتبع نفس النمط لكل بئر.
  6. استخدام برنامج الشركة المصنعة لحساب عدد الخلايا في كل صورة للحصول على متوسط ​​عدد الخلايا غزت لكل حقل في كل بئر (الشكل 6A-C) وفقا لبروتوكول الخاصة بهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم تجميعها ثقافة عضوي النمط عن طريق خلط أولا الليفية الإنسان الأساسية مع نوع الكولاجين I ثم تتراكب هذه الثقافة مع 5 أضعاف عدد الخلايا الظهارية. وقد حضنت ثقافة لا يقل عن 18 ساعة قبل أضيفت خلايا سرطان المبيض لدراسة الالتصاق، والغزو أو الانتشار. وتكرر كل مقايسة مع متعددة (?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أنشئ نموذج عضوي النمط من المكروية البريتوني لتقييم وظيفة الفردية والجماعية (ق) من كل من المكونات الخلوية والفطرية المكروية في نشر بسرطان المبيض. وتقدم بروتوكولات محددة لطلاء وتخصيص ثقافة عضوي النمط 3D للتحقيق في المبيض التصاق الخلايا السرطانية، والانتشار، والغزو. ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

References

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved