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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Resumen

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Introducción

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

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Protocolo

Todos los protocolos de investigación descritos han sido revisados ​​por la Universidad de Chicago Junta de Revisión Institucional (IRB). El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y el estudio fue aprobado por la Universidad de Chicago IRB. Un gabinete de seguridad biológica de tipo 2 y los guantes se deben utilizar para la manipulación de tejidos humanos para su protección y para reducir el riesgo de contaminación de las células.

1. Aislamiento y cultivo de células estromales no transformadas primarias

  1. Recogida de tejido humano y preparación.
    1. Obtener muestras de epiplón humana, 2 cm 3, eliminado durante una cirugía abdominal, y sumergirse de inmediato el tejido en solución salina tamponada con fosfato de RT (PBS) (Figura 2). Un pedazo de epiplón 3 cm x 2 cm típicamente produce 1 millón de células mesoteliales primarios humanos (HPMC) y 200.000 fibroblastos humanos primarios o fibroblastos normales omental (NOF).
    2. Gira por la PBS el tejido se sumerge en 0,5 g durante 3min tan pronto como sea posible después de la recogida (<2 h en PBS) y transferir el tejido fresco a 20 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml. Cortar el tejido dentro de 5 mm 3 piezas mediante el picado con escalpelos en un diámetro de 15 cm, placa de cultivo estéril (Figura 2B).
  2. Mesotelial humana primaria aislamiento de células 8
    1. Para aislar HPMC, transferir el tejido picado en 50 ml tubos cónicos y esperar 1 min para los trozos sólidos floten a la parte superior (Figura 2 C + D). HPMC y los glóbulos rojos (RBC) estarán presentes en el líquido en la parte inferior. Usar una pipeta para eliminar el líquido de la parte inferior del tubo y en un nuevo tubo cónico. Girar el líquido hacia abajo a 0,5 xg durante 3 min y aspirar el sobrenadante del sedimento de HPMC / RBC.
      1. Repita el proceso tres veces: añadir 20 ml de PBS al tejido picada, deje el tejido se eleve, eliminar el líquido de la parte inferior con una pipeta y en el tubo de HPMC / RBC, girar hacia abajo, y extraiga laflotante. Después de todos los giros se han completado y se aspira el sobrenadante, el sedimento contiene HPMC y RBC.
    2. Plate todas las células del pellet en un matraz 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (DMEM con 10% de suero bovino fetal [FBS], 1% de vitaminas MEM [93 mg / L], 1% de ácidos MEM aminoácidos no esenciales [81.4 mg / L], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]).
    3. Realizar un lavado PBS secundaria para aislar HPMCs adicionales.
      1. Para lavar el PBS secundaria, agitar el tejido sólido que queda a 200 rpm, 37 ° C durante 10 minutos en 20 ml de PBS, a continuación, espere 1 minuto para el tejido flote a la cima. Retirar el líquido de la parte inferior del tubo en un nuevo tubo, centrifugar a 0,5 xg durante 3 min, y aspirar el sobrenadante.
      2. Placa todo el HPMC / RBC desde el PBS secundaria de lavado en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
    4. Para aislar cualquier remaining HPMC, agitar el tejido picado a 200 rpm, 37 ° C grados durante 10 min en 20 ml de una mezcla 1: 1 0,25% de EDTA mM de tripsina 25: solución de PBS en volumen. Permitir que el tejido se eleve, recoger el líquido en la parte inferior del tubo en un nuevo tubo de 50 ml, y girar hacia abajo en 0,5 gx 3 min.
      1. Aspirar el sobrenadante y la placa todo el HPMC / RBC en un matraz separado 75 cm 2 en 15 ml de medio de crecimiento completo.
    5. Cultivar las células en placas a 37 ° C y 5% de CO 2 en un ambiente humidificado. Alimentación células sembradas por la adición de 15 ml de medio de cultivo completo en los días 3 y 5 sin necesidad de retirar los medios gastados. HPMC puede ser cultivadas durante 5-7 días antes de la división.
      1. Utilice HPMC de bajo paso (hasta el paso 2) en todos los experimentos para minimizar desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio de preferencia con un objetivo de 20x con capacidad de contraste de interferencia diferencial de plástico o objetivo 4-20x con contraste de fase capabilities (filtros de fase de contraste en el microscopio) para tomar todas las imágenes de las células, y un objetivo de 10x () en campo claro para analizar inmunohistoquímica 3,3'-diaminobencidina (DAB) tinción.
    6. Confirme que la HPMC son cúbicas y expresar citoqueratina 8 y vimentina realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3 A, C, E).
  3. NOF aislamiento 8
    1. Preparar 10 ml de un stock de solución de colagenasa de tipo III (10x) mediante la combinación de una mezcla 1: 1 de Pen-Strep 100x:: 1 1.500 unidades de actividad / ml de colagenasa de tipo III: actividad 714 unidades / ml de hialuronidasa en PBS.
    2. Agitar el tejido epiplón picada que permanece después del aislamiento HPMC en 200 rpm, 37 ° C durante 6 horas en 10 ml de el tipo de solución 10x colagenasa III diluido en medio libre de suero (DMEM con 1% de MEM vitaminas [93 mg / l], 1% aminoácidos no esenciales MEM [81.4 mg / L], 1% penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]). Tejido digerido se verá opaca y puede tener algunos escombros fibrosa (Figura 2E).
    3. Centrifugar las células NOF solución que contiene en suspensión a 0,5 × g durante 3 min a RT, aspirar el sobrenadante y el sedimento de la placa en un matraz de 75 cm 2 en 13 ml de medio de crecimiento completo.
    4. Retire los viejos medios y reemplazar con 15 ml de medio de cultivo completo fresco después de 24 horas. NOF puede cultivarse durante 1-3 días antes de la división. Nota proliferación de la NOF cesará cuando las células alcanzan la confluencia.
    5. Confirme que los fibroblastos humanos primarios son células planas, alargadas y expresan vimentina pero no citoqueratina 8 realizando inmunohistoquímica 8 (Figura 3B, D, F). Utilice NOF bajo paso para experimentos (idealmente antes paso 3) para reducir al mínimo desdiferenciación y la modificación del fenotipo inicial. Utilice un microscopio de campo amplio con un objetivo de 20x con plástico capacidades DIC para la toma de todas las imágenes de fase de las células,y un objetivo de 10x en campo claro para analizar tinción inmunohistoquímica DAB.

2. Revestimiento del organotípicos Cultura 8

  1. NOF de lanzamiento del matraz de cultivo 75 cm de un enjuague con 10 ml de PBS, seguido de 3 ml de 0,25% de tripsina / EDTA 25 mM durante no más de 5 min. Neutralizar la tripsina con al menos 3 veces el volumen de medio de crecimiento completo.
  2. Transferencia de las células tratadas con tripsina en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 0,5 gx 3 min. Eliminar el sobrenadante y llevar a las células una copia de seguridad en 5 ml de medio de cultivo completo. Utilice un contador de células para contar las células recuperadas del matraz de cultivo.
  3. Diluir las células en el volumen apropiado de medio de crecimiento completo a la placa 2.000-4.000 NOF por 100 l en una placa de negro, de fondo transparente, de 96 pocillos. Añadir 0,5 g / 100 l de colágeno de cola de rata I de la mezcla de células antes de la siembra. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 4 horas, o hasta que las célulasa adherirse a la superficie de la placa.
  4. Soltar HPMC del matraz de cultivo usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1 y 2.2. Diluir las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento completo a la placa de 10.000-20.000 HPMC por cada 50 l en la parte superior de la NOF ya chapada con colágeno I en placas de 96 pocillos. Deje que las células se sientan a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante al menos 18 horas antes de comenzar los experimentos.
  5. Cultura proteína fluorescente verde (GFP) expresando las células del cáncer de ovario HeyA8 en medio de crecimiento completo. Células de cáncer ovárico HeyA8 están etiquetados con fluorescencia mediante la expresión de un vector lentiviral que expresa copépodos CGFP (Pcdh-CMV-MCS-EF1). Células de cáncer ovárico HeyA8 deben ser 80-90% de confluencia en el día de uso (fase de crecimiento logarítmica). Liberar células de la placa de cultivo y contar usando los mismos métodos descritos en los pasos 2.1-2.2 para las células primarias.
  6. Permitir que las células de cáncer de ovario se recuperen en medio de crecimiento completo para 15-20 minutos a 37 ° C en untubo cónico con la tapa sellada débilmente.

3. Ensayo de adhesión 8

  1. Después de la recuperación, sedimentar las células de cáncer de ovario haciendo girar durante 3 min a 0,5 × g y luego eliminar el sobrenadante y diluir las células en el volumen apropiado de medio libre de suero para lograr una concentración de 50.000 células / 100 l.
  2. Invertir las placas de 96 pocillos con los cultivos organotípicos / NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 100 l de la suspensión de células de cáncer en medio libre de suero a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 30 min a 4 h.
  3. Invierta la placa de 96 pocillos para eliminar los medios de comunicación y las células no adherentes. Utilice una pipeta multicanal a baja potencia para pipetear con cuidado y suavidad 100 l de PBS en cada pocillo, e invertir la placa de nuevo. Repita el PBS lavar una vez más.
  4. Invertir para eliminar PBS y añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Permita que la plancha reposar por 20 millasn para fijar las células. Después de 20 minutos, invierta la placa y añadir 100 l de PBS.
  5. Tenga en cuenta que la fluorescencia total de pozos puede ser reportada o el número de células puede ser cuantificado. Para la cuantificación, primera placa de una curva estándar por duplicado utilizando células HeyA8 a una concentración de 1 millón de células / ml.
    1. Hacer la curva estándar desacelerándose 1 millón de células, la eliminación de los medios de comunicación, y que les permite sentarse en 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 min.
    2. Células girar de nuevo y traer en 1 ml de PBS (células de recuento para confirmar 1.000.000 / ml de concentración). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, y 0 células en cada pocillo en duplicado, y añadir PBS para un volumen total final de 50 l en cada pocillo.
  6. Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm), escalando altos pozos (50.000 en la curva estándar). Utilice la curva estándar para calcular el número de células de cáncer de ovario se adhirieron a la organotypcultura ic en cada pocillo (Figura 4A-C).

4. Ensayo de proliferación de 10

  1. Después de que las células de cáncer de ovario se recuperan (consulte los pasos 2.5 y 2.6 arriba), sedimentar las células por centrifugación durante 3 min a 0,5 xg y luego diluir las células en el volumen apropiado de 1% de FBS medios (DMEM con 1% de FBS, 1% MEM vitaminas [93 mg / l], 1% MEM no esenciales aminoácidos [81,4 mg / l], 1% de penicilina estreptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina]) para lograr una concentración de 4.000 células / 150 l.
  2. Invierta la placa de 96 pocillos con los / cultivos organotípicos NOF HPMC para eliminar medio gastado, y añadir 150 l de la suspensión de células de cáncer en el 1% de medios FBS a cada pocillo. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 72 hr.
  3. Bottom leer la placa de cultivo en un lector de placa fluorescente una vez al día (excitación = 488 nm, emisión = 528 nm) para evaluar la proliferación relativade las células. Continuar el ensayo durante 96 horas, cambiando los medios de comunicación a las 48 h (Figura 5A-C). Tenga cuidado de no molestar a la cultura al cambiar los medios de comunicación (invirtiendo la placa es preferible).

5. Invasión Ensayo 8

  1. Antes plateando la cultura 3D, agregue el colágeno de cola de rata 7,5 g I en 200 l de PBS a un 24 pocillos de inserción placa de cultivo (8 micras de tamaño de poro). Deje que la placa incubado O / N, a continuación, retire con cuidado la PBS con una pipeta inmediatamente antes plateando la cultura organotípico HPMC / NOF en los insertos recubiertos con colágeno (paso 2 anterior).
  2. Preparar las células de cáncer de ovario que en el paso 3.1. Para la placa de las células de cáncer de ovario en los cultivos organotípicos en los insertos, utilice cuidadosamente una pipeta para eliminar el exceso de medios de comunicación de la parte superior de los insertos. Añadir 100 l de la suspensión de células cáncer de ovario en medio libre de suero a cada pocillo.
  3. Añadir 750 l de medio de cultivo completo en el pozo por debajo de la inserción para inducir las células de cáncer eninvasión en los cultivos organotípicos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO 2 en un ambiente humidificado durante 24 hr.
    Nota: células de cáncer ovárico que invaden el cultivo organotípico cruzará el inserto y permanecer en el lado inferior del inserto.
  4. Después de 24 horas, sujete el inserto con pinzas y brevemente enjuague en un vaso de precipitados de PBS, a continuación, mueva el inserto en un pozo vacío. Frote la parte superior de cada inserto con ambos lados de un hisopo de algodón para un total de 1 min. Colocar rápidamente el inserto en una placa que contiene 750 l de paraformaldehído al 4% en cada pocillo. Permitir que cada inserto para sentarse en paraformaldehído durante 10 min antes de transferir los insertos en los pozos llenos con 750 l de PBS.
  5. Ver las células invadidas (adheridas y se fija a la parte inferior de inserciones) con un microscopio con un aumento de 2,5 veces. Cuando todo el bien está dentro del campo de visión, ajustar la ampliación de 10x y tomar 5 fotos, uno cerca del centro y 1 en cada cuadrante del pozo, evitandotomando imágenes que están demasiado cerca de los bordes. Siga el mismo patrón para cada pozo.
  6. Utilice el programa del fabricante para contar el número de células en cada imagen para obtener un número medio de células invadidas por campo en cada pocillo (Figura 6A-C) de acuerdo con su protocolo.

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Resultados

El cultivo organotípico se ensambló mezclando primero los fibroblastos humanos primarios con colágeno de tipo I y luego superponiendo esta cultura con 5 veces el número de células mesoteliales. El cultivo se incubó durante al menos 18 horas antes de que se añadieron células de cáncer de ovario para estudiar la adhesión, invasión o proliferación. Cada ensayo se repitió con múltiples (n = 3-5) culturas 3D obtenidos de diferentes pacientes y numerosos pozos fueron probados en cada condición para la adhesión...

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Discusión

Se estableció un modelo organotípico del microambiente peritoneal para evaluar la función individual y colectiva (s) de ambos los componentes celulares y innatas del microambiente en la diseminación del cáncer de ovario. Se proporcionan los protocolos específicos para el chapado y personalizar el cultivo organotípico 3D para investigar la adhesión de células de ovario cáncer, la proliferación y la invasión. Células epiplón humanos primarios mesoteliales y fibroblastos fueron aisladas de los pacientes y se ...

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Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

Referencias

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