وPCR الفحص دوبلكس الرقمي للوقت واحد الكمي ل<em&gt; المعوية النيابة.</em&gt; وما يرتبط بها من البراز-الإنسان HF183 علامة في المياه

Summary

توضح هذه المخطوطة فحص المزدوجة الرقمي PCR التي يمكن استخدامها لتحديد وقت واحد المعوية النيابة. وعلامات وراثية HF183 كمؤشرات للتلوث برازي العام والمرتبط الإنسان في المياه الترفيهية.

Abstract

توضح هذه المخطوطة على الوجهين الرقمي فحص PCR (EntHF183 dPCR) لتقدير وقت واحد من المعوية النيابة. والإنسان البرازية المصاحب علامة HF183. وEntHF183 دوبلكس dPCR (على النحو المشار إليه EntHF183 dPCR الآن فصاعدا) يستخدم فحص نفس التمهيدي والتحقيق متواليات كما نظرائه الكمي PCR (QPCR) الفردية المنشورة. وبالمثل، يتم اتباع نفس الإجراءات تنقية المياه واستخراج الحمض النووي كما يؤديها قبل QPCR قبل تشغيل dPCR. ومع ذلك، فإن الوجهين dPCR فحص لديها العديد من المزايا على المقايسات QPCR. الأهم من ذلك، فحص dPCR يلغي الحاجة لتشغيل منحنى القياسية، وبالتالي، فإن التحيز المرتبطة وتقلباته، من خلال القياس المباشر أهدافه. وبالإضافة إلى ذلك، في حين الوجهين (أي الكمي في وقت واحد) المعوية وHF183 في QPCR غالبا ما يؤدي إلى التقليل الشديد من هدف أقل وفرة في عينة، يوفر dPCR الكمي ثابت من كل من الأهداف، شحذلها كميا بشكل فردي أو في وقت واحد في نفس رد الفعل. فحص dPCR هي أيضا قادرة على تحمل تركيزات مثبط PCR التي 1-2 أوامر من حجم أعلى من تلك التي تحملها بواسطة QPCR. هذه المزايا تجعل الفحص EntHF183 dPCR جذابة بشكل خاص لأنه يوفر وقت واحد معلومات دقيقة وقابلة للتكرار في كل عام ويرتبط البشري التلوث البرازي في المياه البيئية دون الحاجة إلى تشغيل اثنين من المقايسات QPCR منفصلة. وعلى الرغم من مزاياه أكثر QPCR، والحد الكمي العلوي من فحص dPCR مع الأجهزة المتوفرة حاليا ما يقرب من أربعة أوامر من حجم أقل من ذلك الذي يتحقق عن طريق QPCR. ونتيجة لذلك، لا بد من تخفيف لقياس تركيزات عالية من الكائنات المستهدفة مثل تلك التي لوحظت عادة بعد تسرب مياه الصرف الصحي.

Introduction

وقد استخدمت الأساليب الكمية PCR (QPCR) على نطاق واسع لرصد نوعية المياه الترفيهية والميكروبية تطبيقات تتبع مصدر لأنها أسرع وأكثر مرونة ومحددة بالمقارنة مع الطرق التقليدية القائمة على الثقافة. ونتيجة لذلك، ينصح QPCR لتحقيق نتائج مراقبة المياه السريعة للمؤشرات البرازية العامة مثل المكورات المعوية النيابة. في وكالة حماية البيئة المائية الترفيهية تنقيح معايير الجودة ^1. كما تم تطوير العديد من فحوصات QPCR والتحقق من صحتها لتحديد مصادر التلوث البرازي في المياه البيئية ^2. ومن بين هذه المقايسات HF183 علامة هي من بين الأكثر استخداما لتحديد المصاحب الإنسان تلوث برازي ^3.

ومع ذلك، النتائج QPCR وغالبا ما تكون متحيزة لأنها تعتمد على المنحنيات القياسية لتقدير. QPCR الكمي تركيزات غير معروفة الهدف في عينات من التحريف دورة تحديد قيمتها (الكلوروكوين) من ستانمنحنى المعيارية التي تصف وجود علاقة خطية بين الكلوروكوين وكمية لوغاريتمي من مجموعة من المعايير تخفيفه بشكل متسلسل. وبالتالي قد يكون الافتقار إلى المواد المرجعية القياسية موثوقة ومتسقة التحيز إلى حد كبير النتائج QPCR. وأظهرت الدراسات أن النتائج QPCR اختلفت قبل ما يقرب من نصف سجل باستخدام معايير من مختلف البائعين ⁴ وبنسبة 2 أضعاف باستخدام دفعات مختلفة من المعايير من نفس البائع ^5.

PCR (dPCR) التكنولوجيا الرقمية يقيس عينة مجهولة عن طريق عد تردد من الايجابيات في عدد كبير من تقارير إنجاز المشروعات المصغرة التي تم إنشاؤها بواسطة تقسيم لQPCR بالجملة إلى الآلاف أو الملايين من نانولتر موحد أو ردود فعل بيكو لتر ^6. ويشار إلى PCR بالقطيرات الرقمي (أي هذه المقالة) أو غرفة الرقمي PCR، على التوالي، إذا كان أقسام هي قطرات الماء في الزيت (أي هذه المقالة) أو دوائر صغيرة على رقاقة. وهناك تركيز العينة العالي يؤدي إلى وجود الحمض النووي الهدف(PCR بالتالي إيجابي) في نسبة أعلى من الجدران، علاقة يقترب من توزيع بواسون. على هذا النحو، يتم تسجيل النتائج الثنائية (إيجابية أو سلبية PCR)، ويستخدم تردد من قطرات الإيجابية لحساب تركيز عينة مجهولة مباشرة عن طريق بواسون التقريب، مما يلغي الحاجة لمنحنى القياسية كما هو الحال في QPCR.

هذا النوع من ثنائي الكمي PCR الرقمي يوفر مزايا إضافية خلال QPCR ^7. بسبب تأخر التضخيم لا تزال تسفر عن PCR إيجابي، dPCR الكمي هو أكثر قوة ضد تثبيط الذي يقلل من كفاءة التضخيم. وبالمثل، لا يتأثر dPCR الكمي من التباين في القيم الكلوروكوين كما هو QPCR، مما يؤدي إلى دقة أعلى من dPCR مقارنة QPCR ^8-10.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التقسيم يضمن كمية صغيرة جدا من الهدف الحمض النووي موجودة في كل قطرة، والتقليل من فعالية المنافسة الركيزة (خلال amplificatioن من الأهداف الحمض النووي مختلفة) التي هي العقبات المشتركة لتحقيق الطباعة على الوجهين (أي فحص يقيس وقت واحد هدفين DNA) في QPCR. على هذا النحو، سواء كان التشغيل في الوجهين أو البسيط (أي يقاس هدف واحد في فحص واحد) dPCR تنتج الكمي لا يمكن تمييزها تقريبا من كل من الأهداف ^7،11.

الهدف من فحص PCR الرقمي (EntHF183 dPCR) الموضحة في هذه المقالة هو الحصول على القياس المباشر المتزامن لمؤشر البراز العام المعوية النيابة. وعلامة HF183-البراز البشري يرتبط مع تحسن الدقة، واستنساخ ومتانة ضد تثبيط مقارنة QPCR لها نظرائه. وقد استخدم هذا الاختبار بنجاح لقياس التلوث البرازي في المياه العذبة البيئة والمياه البحرية، ومختلف المواد البرازية ^7، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على أي أنواع أخرى من المياه ومياه الصرف الصحي. هذا الاختبار يحمل وعودا كبيرة لتحليل الرواسب أو التربة بسبب ذلكق التسامح عالية لكبت، ولكن مطلوب مزيد من التجارب بسبب تعقيدات المانع تمزج بين هذه الأنواع من العينات.

Protocol

1. الفحص خليط التحضير

1. جعل تركيزات الأسهم 100 مكرومول / L لجميع الاشعال في الماء الصف الجزيئية وتحقيقات في TE درجة الحموضة 8 عازلة [المعوية F1A، المعوية R1، GPL813TQ ^12؛ HF183-1، BthetR1، BthetP1 ^3].
   ملاحظة: تحقيقات لأهداف هما fluorescently المسمى مع fluorophores مختلفة ⁷ كما هو مبين في قائمة المواد / المعدات.
2. تحضير مزيج الرئيسي عن طريق خلط، في رد الفعل المخطط لها، 12 ميكرولتر مزيج PCR الرقمي (2X الأسهم، انظر قائمة المواد / المعدات)، 0.216 ميكرولتر كل الأمام وعكس التمهيدي، 0.06 ميكرولتر كل مسبار الفلورسنت، و5،016 ميكرولتر المياه nuclease مجانا (التركيز النهائي : 900 نانومتر كل التمهيدي، 250 نانومتر كل مسبار). ماصة صعودا وهبوطا لا يقل عن 10 مرات لخلط مع الأخذ الحذر على عدم إدخال فقاعات الهواء في الحل.
3. ماصة 18 ميكرولتر مزيج الرئيسي (من الخطوة 1.2) في أنبوب PCR العادي أو لوحة، والخلط في قالب الحمض النووي 6 ميكرولتر (المستخرج كما بريفيو صفهخبيث ¹³⁾ لجعل الخليط فحص لتوليد بالقطيرات. في حالة تشغيل عينات من نسختين، الماصة 36 ميكرولتر من مزيج الرئيسي و 12 قالب الحمض النووي ميكرولتر في كل بئر. ترك الآبار تكرار المقابلة فارغة على لوحة. وتشمل الضوابط الإيجابية (انظر قائمة المواد / المعدات) وعدم وجود ضوابط قالب (NTC) (أي مع الماء الصف الجزيئية المستخدمة كقالب).
   ملاحظة: هي السيطرة الإيجابية اللازمة لضمان الفحص يعمل بشكل صحيح والمجلس الوطني الانتقالي هو ضروري لضمان عدم وجود تلوث في لوحة ووضع الأساس الفلورسنت في وقت لاحق في تحليل البيانات. وينصح المستخدمين لأول مرة في استخدام كل عينات من الحمض النووي غير مخفف والمخففة.

2. الجيل الحبرية والإعداد لوحة PCR

1. مزج خليط من فحص من قبل pipetting صعودا هبوطا نحو 15 مرات باستخدام الماصة متعدد القنوات. تأكد من أن طرف الماصة يبقى داخل السائل لتجنب الوقوع في فقاعات الزائدة داخل الخليط.
2. إنسخرطوشة ERT 1 (التي تحتوي على 8 آبار) إلى حامل خرطوشة الأبيض وانقر على اغلاق حامل خرطوشة. خرطوشة 1 هي الآن راسخة في مكانها ولا يمكن طردت من صاحب أثناء إنشاء قطرات. باستخدام الماصة متعدد القنوات، ونقل بلطف 20 ميكرولتر من خليط فحص في موقف وسط من خرطوشة ملحوظ 'نموذج' دون إدخال فقاعات الهواء.
3. الماصة في 70 ميكرولتر من النفط جيل قطرة إلى الجانب الأيسر من خرطوشة (ملحوظ 'النفط').
4. خرطوشة غطاء مع طوقا التأكد من طوقا مسطح وعقد بالتساوي من قبل 4 القراد نحو حافة خرطوشة. اضغط على الزر الأخضر مضاءة على مولد الحبرية لفتح ووضع خرطوشة. اضغط على زر أخضر مضاءة مرة أخرى لإغلاق المولد.
   ملاحظة: عندما يغلق الباب، خافتا على زر، والباب لا يمكن إعادة فتحها ويبدأ جيل قطرات مستمرة على الفور لحوالي 1 دقيقة.
5. إذا فعل أكثر من 8 ردود الفعل، مكان خرطوشة 2 في الثانيةحامل خرطوشة الأبيض وإعداد بنفس الطريقة كما خرطوشة 1 في حين أن الجيل قطرة جار لحفظ مجموع وقت الإعداد.
6. فتح الحبرية مولد الباب عندما يتحول زر قاتمة مضاءة الأخضر يشير إلى الانتهاء من جيل بالقطيرات. إزالة حامل الأبيض خرطوشة تحتوي على خرطوشة 1، جانبا، ومكان خرطوشة 2 على مولد قطرة.
7. إزالة طوقا من خرطوشة 1 وتجاهل. نقل بلطف الحجم الإجمالي (حوالي 40 ميكرولتر) من قطرات الناتجة عن العمود الثالث من خرطوشة (ملحوظ "قطرات") على لوحة PCR النهائية (الحفاظ على درجة حرارة الغرفة) لركوب الدراجات الحرارية.
   ملاحظة: لا قم بإلغاء النقر على حامل خرطوشة البيضاء كما عمل قد كسر قطرات لدت حديثا. فتح فقط حامل خرطوشة بعد أن تم نقل قطرات على لوحة النهائية.
8. كرر الخطوات من 2،1-2،7 لعينات إضافية.
9. عند كافة قطرات في لوحة PCR النهائية، وضع pierceableتغطية احباط على أعلى لوحة ووضعها على سداده لوحة. تعيين سداده إلى 180 درجة مئوية، اضغط على "اللعب" على سداده، والسماح ختم لمدة 10 ثانية.

3. ركوب الدراجات الحرارية والقطرة القراءة

1. وضع لوحة مختومة على cycler الحرارية، واحد متوافق مع لوحة PCR النهائية المستخدمة في الخطوة 2.7، وسرعة التعلية درجة الحرارة 2.0 درجة مئوية / ثانية.
2. تشغيل برنامج الحراري على النحو التالي: 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية، تليها 40 دورة من 30 ثانية في 94 درجة مئوية و 60 ثانية في 60 درجة مئوية، تليها على عقد مدة 10 دقيقة في 98 ° C (اختياري: عقد النهائي في 4 أو 15 ° C).
3. عند الانتهاء من ركوب الدراجات، ونقل لوحة لقارئ القطرة لقياس التلقائي للمضان في كل قطرة في كل بئر. بدلا من ذلك، تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل القراءة الحبرية. ضمان قطرات هي في درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في القراءة.
   1. فتح البرنامج المصاحب لإعداد القراءة الحبرية. في"إعداد" القائمة الافتراضية التي تحتوي على التخطيطي من 96 لوحة جيدا فارغة، انقر نقرا مزدوجا على ما يرام A1 لفتح القائمة التي تحتوي على ثلاثة أقسام: 'نموذج' 'الفحص 1 "و" الفحص 2. "
   2. في قسم 'نموذج' اكتب معرف عينة في المربع المسمى 'اسم' ودخول الصحافة أو علامة في المربع إلى اليمين ملحوظ "تطبيق". بعد ذلك، انقر على القائمة المنسدلة المسمى "تجربة" واختيار "RED" (نادر كشف الحدث) وانقر فوق دخول.
   3. الانتقال إلى القسم يرمز "الفحص 1." في قسم 'اسم' ملء الفحص (مثل المكورات المعوية) وانقر فوق دخول. في المربع أدناه "نوع" المسمى انقر على القائمة المنسدلة واختيار "القناة 1 غير معروف 'وانقر فوق دخول.
   4. الانتقال إلى القسم يرمز "الفحص 2." في قسم 'اسم' ملء فحص (على سبيل المثال HF183) وانقر فوق دخول. في المربع أدناه المسمى "النوع"، انقر على القائمة المنسدلة لد اختيار "القناة 2 غير معروف 'وانقر فوق دخول. جميع المعلومات من خطوات 3.3.2 إلى 3.3.4 هو الآن تقدم في A1 جيدا.
   5. تسمية جميع الآبار اللاحقة التي تحتوي على قطرات. لتوفير الوقت الإجمالي الإعداد، انقر فوق "التحول" أو "السيطرة، في اختيار آبار متعددة في وقت واحد.
   6. عندما تصوير الرقمي لوحة يعكس لوحة المادية، اضغط على "موافق" في أسفل اليمين من القائمة. في القائمة الجديدة التي تظهر في الجزء العلوي من لوحة التخطيطي، تحت قسم "قالب" اختيار "حفظ باسم" واسم وحفظ لوحة.
   7. إلى اليسار من الشاشة انقر 'تشغيل' وحدد صبغ مجموعة المناسب في نافذة منبثقة "خيارات تشغيل". جمع البيانات يبدأ ويتم عرض في الوقت الحقيقي في البرنامج.

4. تحليل البيانات وإعداد التقارير

1. عند الانتهاء من القارئ ومربع تظهر تفيد "تشغيل كاملة"، انقر فوق "موافق".
   ملاحظة: ناعمةيعرض وير ملف البيانات النهائية ضمن قسم "تحليل" من البرنامج. في هذا الرأي، فإن البرنامج لديه جميع الآبار في لوحة مختارة والتخلف إلى مؤامرة بيانات "2D السعة".
2. تحقق الفصل بين قطرات الإيجابية والسلبية. تأكد من أن مضان في كل قطرات في الآبار المجلس الوطني الانتقالي وبالقرب من خط الأساس.
3. انقر على الزر المسمى "الأحداث". على يمين الرسم البياني عرض انقر فوق خانة اسمه "المجموع" ومربع يدعى "وحيد" في أسفل لعرض عدد من قطرات مقبولة لكل بئر. استبعاد أي الآبار التي تحتوي <10000 قطرات ⁷ عن طريق الضغط على مفتاح Ctrl والنقر على البئر (ق) سيتم استبعادها.
4. انقر على زر يرمز لها '1D السعة "لتعيين عتبة الفلورسنت على ما يقرب من الانحراف المعياري (500-700 حدات مضان) أعلاه قطرات السلبية في الآبار المجلس الوطني الانتقالي لكل من الأهداف. في اليسار جدا من الامم المتحدة الشاشةدير في "تلقائي تحليل" تظهر اثنين من الأزرار عتبة، اختر رمز للحق يحتوي على خط أفقي وردي الصلبة الذي يمر بها.
5. انقر فوق المربع إلى يسار "عتبة تعيين" تحت كل من الرسوم البيانية السعة وأدخل القيم عتبة مضان المناسبة. ثم يتم حساب تركيزات هدف في نسخة لكل رد فعل ميكرولتر تلقائيا.
   ملاحظة: عتبات لا تحتاج إلى أن تكون مطابقة لأهداف مختلفة.
6. تصدير النتائج في ملف .csv عن طريق النقر على زر 'تصدير' في أعلى الزاوية اليسرى على الشاشة 1D السعة. في ملف .csv مضاعفة تركيز الهدف تصديرها بنسبة 4 إلى تحويله من نسخة من الهدف (23S الجين المعوية النيابة. أو علامة HF183) في رد فعل ميكرولتر لنسخ من هدف في ميكرولتر قالب الحمض النووي.

النتائج

ينبغي أن يؤدي وخير EntHF183 دوبلكس dPCR التشغيل في عدد كبير نسبيا من قطرات مقبولة (حوالي 10،000-17،000) والفرق كبير نسبيا (حوالي 5000) بين القيم مضان لقطرات السلبية والإيجابية ^7. عدد منخفض بشكل غير عادي من قطرات من المرجح يشير القضايا في عملية توليد...

Discussion

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. أولا، خلط خليط الفحص يمكن أن يكون صعبا بسبب مزيج الرئيسي هو أكثر لزوجة من يمزج سيد QPCR التقليدية. vortexing لبسيط قد يؤدي إلى عدم كفاية الاختلاط، وهذا بدوره يؤدي إلى توزيع غير موحدة من قوالب الحمض النووي في خليط فحص وبعد ذلك ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.