Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

Resumen

Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.

Resumen

Este manuscrito describe un ensayo de PCR duplex digitales (EntHF183 dPCR) para la cuantificación simultánea de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-fecal asociada humano. El EntHF183 dúplex dPCR (denominado en adelante como EntHF183 dPCR) ensayo utiliza las mismas secuencias de cebadores y sondas como sus homólogos individuales publicados por PCR cuantitativa (qPCR). Del mismo modo, las mismas de filtración de agua y extracción de ADN procedimientos que se realiza antes de la qPCR se siguen antes de ejecutar dPCR. Sin embargo, el ensayo dPCR duplex tiene varias ventajas sobre los ensayos de qPCR. Lo más importante, el ensayo dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo y la variabilidad asociada, mediante la cuantificación directa de sus objetivos. Además, mientras que a doble cara (es decir, la cuantificación simultánea) Enterococcus y HF183 en qPCR a menudo conduce a una subestimación grave del objetivo menos abundantes en una muestra, dPCR proporciona cuantificación coherente de ambos objetivos, amolasu cuantificó individualmente o simultáneamente en la misma reacción. El ensayo dPCR también es capaz de tolerar concentraciones de inhibidor de PCR que son de uno a dos órdenes de magnitud mayores que las toleradas por qPCR. Estas ventajas hacen que el ensayo EntHF183 dPCR particularmente atractivo, ya que al mismo tiempo proporciona información precisa y repetible en tanto la contaminación fecal general y asociada humano en aguas ambientales sin la necesidad de ejecutar dos ensayos de qPCR separadas. A pesar de sus ventajas sobre qPCR, el límite de cuantificación superior del ensayo dPCR con instrumentación disponible actualmente es de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más baja que la que puede conseguirse por qPCR. En consecuencia, se necesita dilución para la medición de altas concentraciones de organismos diana tales como los observados típicamente siguiente derrames de aguas residuales.

Introducción

Los métodos cuantitativos de PCR (qPCR) han sido ampliamente utilizados para el seguimiento de recreo calidad del agua y aplicaciones de seguimiento de fuente microbiana porque son más rápidos, más flexible y específica en comparación con los métodos tradicionales basadas en el cultivo. En consecuencia, la qPCR se recomienda para lograr rápidos resultados de monitoreo de aguas fecales para los indicadores generales, tales como Enterococcus spp., En los criterios de calidad del agua recreativa USEPA ¹ revisado. Muchos ensayos de qPCR también se han desarrollado y validado para la identificación de las fuentes de contaminación fecal en las aguas ambientales ^2. Entre estos, los ensayos de marcadores HF183 se encuentran entre los más utilizados para la identificación de la contaminación fecal humana ^asociada-3.

Sin embargo, los resultados qPCR a menudo pueden estar sesgados porque se basan en las curvas de calibración para la cuantificación. qPCR cuantifica concentraciones desconocidas de diana en las muestras por interpolación de su ciclo de cuantificación (CQ) de un stancurva Dard que describe una relación lineal entre Cq y cantidad logarítmica de un conjunto de patrones diluidos en serie. Por lo tanto, la falta de material de referencia estándar fiable y consistente puede sesgar en gran medida los resultados qPCR. Los estudios demostraron que qPCR resultados diferían usando patrones de aproximadamente la mitad de un registro de diferentes proveedores ⁴ y 2 veces usando diferentes lotes de normas del mismo vendedor ^5.

La tecnología digital de PCR (dPCR) cuantifica una muestra desconocida contando la frecuencia de casos positivos en un gran número de informes de terminación en miniatura que se generan mediante la partición de la PCR cuantitativa a granel en miles o millones de nanolitros uniforme o reacciones picolitros ^6. Se hace referencia como PCR gotita digital (es decir, en este artículo) o cámara de PCR digital, respectivamente, si las particiones son gotitas de agua-en-aceite (es decir, este artículo) o pequeñas cámaras en un chip. Una concentración de la muestra mayor resultará en presencia de ADN diana(PCR, por tanto, positiva) en una mayor proporción de particiones, una relación aproximada por distribución de Poisson. Como tal, los resultados binarios (PCR positivo o negativo) se registran y la frecuencia de las gotitas de positivos se utiliza para calcular las concentraciones de muestras desconocidas directamente a través de Poisson aproximación, eliminando la necesidad de una curva estándar como en qPCR.

Esta naturaleza binaria de la cuantificación de PCR digital proporciona ventajas adicionales sobre qPCR ^7. Debido a que la amplificación retrasado todavía puede producir una PCR positiva, dPCR cuantificación es más robusto frente a la inhibición que reduce la eficiencia de amplificación. Del mismo modo, dPCR cuantificación no se ve afectada por la variabilidad en valores Cq como es qPCR, lo que aumenta la precisión de dPCR comparación con qPCR ^8-10.

Además, el proceso de partición asegura una muy pequeña cantidad de ADN diana presente en cada gota, minimizando efectivamente la competencia sustrato (durante amplification de diferentes dianas de ADN) que son obstáculos comunes para lograr la impresión a doble cara (es decir, un ensayo mide simultáneamente dos dianas de ADN) en la qPCR. Como tal, si carrera en duplex o simplex (es decir, un objetivo se mide en un único ensayo) dPCR produce cuantificación casi indistinguibles de los dos objetivos de ^7,11.

El objetivo del ensayo de PCR digital (EntHF183 dPCR) descrito en este artículo es obtener cuantificación directa simultánea del indicador fecal general de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-humano fecal asociada con una mayor precisión, reproducibilidad y robustez frente a la inhibición en comparación con su qPCR homólogos. Este ensayo ha sido utilizado con éxito para la cuantificación de la contaminación fecal en agua dulce del medio ambiente, el agua marina, y diversos materiales fecal ^7, pero también puede ser aplicado a cualquier otro tipo de aguas y aguas residuales. Este ensayo representa una gran promesa para el análisis de los sedimentos o suelos debido a sus alta tolerancia a la inhibición, pero se necesitan más pruebas debido a la complejidad de inhibidor se mezcla en este tipo de muestras.

Protocolo

1. Ensayo de la preparación de mezclas

1. Hacer concentraciones de 100 mmol / L de existencias para todos los cebadores en el agua de grado molecular y sondas en TE pH 8. [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Nota: Las sondas para los dos objetivos se marcaron con fluorescencia diferentes fluoróforos ^7, como se indica en la Lista de Materiales / Equipos.
2. Preparar la mezcla maestra mezclando, por reacción planificada, 12 l digital de mezcla de PCR (2x madre, véase Lista de Materiales / Equipos), 0.216 l cada uno hacia adelante y el cebador, 0,06 l cada una sonda fluorescente inversa, y 5.016 l de agua libre de nucleasa (concentración final : 900 nM de cada cebador, 250 nM de cada sonda). Pipetear arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar, teniendo la precaución de no introducir burbujas de aire en la solución.
3. Pipeta de 18 l maestro de la mezcla (del paso 1.2) en un tubo de PCR regular o plato, mezcla en molde de ADN 6 l (extraído como se describe Previouastuta ¹³⁾ para hacer mezcla de ensayo para la generación de gotas. Si el análisis de muestras por duplicado, pipeta de 36 l de mezcla maestra y 12 l plantilla de ADN en cada pocillo. Deje los pocillos duplicados correspondientes vacío en el plato. Se deben incluir controles positivos (véase la lista de materiales / equipo) y no hay controles de plantilla (NTC) (es decir, con agua de grado molecular utilizada como plantilla).
   Nota: El control positivo es necesario para garantizar el ensayo está funcionando correctamente y el NTC es necesario para asegurar que no hay contaminación dentro de la placa y para establecer la línea de base fluorescente más adelante en el análisis de datos. Se recomienda a los usuarios de primera vez de usar las dos muestras de ADN sin diluir y diluidas.

2. Generación de la gotita y PCR Plate Setup

1. Mezclar las mezclas de ensayo pipeteando arriba hacia abajo aproximadamente 15 veces usando una pipeta multicanal. Asegúrese de que la punta de la pipeta se mantiene dentro de líquido para evitar que el exceso de burbujas dentro de la mezcla.
2. insert cartucho 1 (que contiene 8 pocillos) en un soporte de cartucho en blanco y haga clic en el soporte del cartucho cerrada. Cartucho 1 es ahora firmemente en su lugar y no puede ser desalojado del soporte mientras que la generación de gotitas. Usando una pipeta multicanal, transferir suavemente 20 l de mezcla de ensayo en la posición media del cartucho de marcado 'Sample' sin introducir burbujas de aire.
3. Pipetear en 70 l de aceite de generación de gotas hacia el lado izquierdo del cartucho (marcado "Aceite").
4. cartucho de tapa con una junta asegurándose de que la junta es plana y se mantiene de manera uniforme por el 4 garrapatas hacia el borde del cartucho. Presione el botón de luz verde en el generador de gotas para abrir y colocar el cartucho. Pulse el botón verde iluminado de nuevo para cerrar el generador.
   Nota: Una vez que la puerta se cierra, el botón está atenuado, la puerta no puede ser reabierto y la generación de gotas comienza inmediatamente continua durante aproximadamente 1 min.
5. Si hace más de 8 reacciones, el lugar de cartucho 2 en un segundosoporte del cartucho de blanco y preparar de la misma manera como el cartucho 1 mientras que la generación de gotitas está en curso para ahorrar tiempo de instalación total.
6. Abra la puerta del generador de gotas cuando el botón de encendido se ilumina en verde tenue que indica la finalización de la generación de gotas. Retire el soporte blanco cartucho que contiene el cartucho 1, a un lado, y el lugar cartucho 2 en el generador de gotas.
7. Retire la junta de cartucho 1 y desechar. transferir suavemente el volumen total (aproximadamente 40 l) de las gotas generadas a partir de la tercera columna del cartucho (marcado 'Gotitas') sobre una placa de PCR final (mantenida a temperatura ambiente), durante el ciclo térmico.
   Nota: No unclick el soporte del cartucho blanco como la acción puede romper las gotas generadas recientemente; solamente abrir el soporte de cartucho después de que las gotitas se han transferido a la placa final.
8. Repita los pasos 2.1-2.7 para muestras adicionales.
9. Cuando todas las gotas están en la placa de PCR final, coloque un penetrablecubierta de aluminio en la parte superior de la placa y colóquela sobre una lámina de plástico. Ajuste el sellador a 180 ° C, pulse "Play" en el sellador y dejar sellado durante 10 s.

3. ciclos térmicos y de lectura de la gotita

1. Coloque la placa de sellado en el termociclador, uno compatible con la placa de PCR final utilizada en el paso 2.7, y una velocidad de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg.
2. Ejecutar el programa térmico de la siguiente manera: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C y 60 seg a 60 ° C, seguido de un mantenimiento de 10 min a 98 ° C (opcional: asimiento final en 4 o 15 ° C).
3. Una vez finalizado el ciclismo, la transferencia de la placa a un lector de gota para la medición automática de la fluorescencia en cada gotita en cada pocillo. Alternativamente, la placa de almacenar a 4 ° C durante hasta 3 días antes de la lectura de las gotas. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de proceder a la lectura.
   1. Abra el software que acompaña a la configuración de la lectura de las gotas. Enel menú por defecto 'Configuración' que contiene un esquema de una placa de vacío 96, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú contiene tres secciones: 'ejemplo,' 'Ensayo 1' y 'Ensayo 2.'
   2. En la sección "muestra" escriba el ID de la muestra en la casilla "Nombre" y pulse Enter o marcar la casilla a la derecha marcada 'Aplicar'. A continuación, haga clic en el menú desplegable etiquetada 'Experimento' y seleccione 'RED' (detección de eventos raros) y haga clic en entrar.
   3. Mover a la sección denotada 'Ensayo 1.' En la sección "Nombre" llenar el ensayo (por ejemplo, Enterococcus) y haga clic en entrar. En el cuadro de abajo titulada 'Tipo' haga clic en el menú desplegable y seleccione "Canal 1 Desconocido 'y haga clic en entrar.
   4. Mover a la sección denotada 'Ensayo 2.' En la sección "Nombre" llenar el ensayo (por ejemplo, HF183) y haga clic en entrar. En el cuadro de abajo titulada 'Tipo', haga clic en el menú desplegable de un menúd Seleccione 'Channel 2 Unknown "y haga clic en entrar. Toda la información de los pasos 3.3.2 a 3.3.4 está ahora presente en el pocillo A1.
   5. Nombre de todas las subsiguientes pozos que contienen gotitas. Para ahorrar tiempo de configuración total, haga clic 'Shift' o 'Ctrl' para seleccionar múltiples pozos simultáneamente.
   6. Cuando la representación digital de la placa refleja la placa física, pulse "OK" en la parte inferior derecha del menú. En el nuevo menú que aparece en la parte superior de la placa esquemática, en la sección 'Plantilla' elige "Guardar como" y el nombre y guardar la placa.
   7. A la izquierda de la pantalla, haga clic en "Ejecutar" y seleccione apropiada Conjunto colorante presente en la ventana pop-out "Opciones de ejecución". La recolección de datos se inicia y se visualiza en tiempo real en el software.

4. Análisis de los datos y generación de informes

1. Cuando el lector ha terminado y una caja aparece que indica "carrera completa", haga clic en 'Aceptar'.
   Nota: El suavecerámica muestra el archivo de datos final, en la sección "Analizar" del software. En este punto de vista, el software tiene todos los pocillos de la placa y seleccionadas por defecto a la trama de datos '2D Amplitud'.
2. Compruebe la separación entre las gotitas positivos y negativos. Asegúrese de que la fluorescencia en todas las gotas en los pozos NTC están cerca de la línea de base.
3. Haga clic en el botón denominado "Eventos". A la derecha del histograma presentado haga clic en el cuadro llamado "Total" y el cuadro llamado "single" en la parte inferior para mostrar el número total de gotitas aceptados por pocillo. Excluye todos los pozos que contienen <10.000 gotitas ⁷ manteniendo pulsada la tecla Ctrl y haciendo clic en el pozo (s) a ser excluidos.
4. Haga clic en el botón indicado como '1D Amplitud' para establecer el umbral de fluorescencia a aproximadamente una desviación estándar (500-700 unidades de fluorescencia) por encima de las gotitas negativas en pocillos NTC para ambos objetivos. En el extremo izquierdo de la pantalla de la ONUder 'Auto Analyze' muestra dos botones de umbral, seleccione el icono de la derecha que tiene una sólida línea horizontal de color rosa que lo atraviesa.
5. Haga clic en la casilla a la izquierda de "umbral establecido 'en cada una de las gráficas de amplitud e introduzca los valores de umbral de fluorescencia apropiados. Las concentraciones objetivo en copia por reacción de l A continuación se calculan automáticamente.
   Nota: Los umbrales no necesitan ser idénticos para los distintos objetivos.
6. Exportar los resultados en un archivo .csv haciendo clic en el botón "Exportar" en la esquina superior izquierda de la pantalla 1D amplitud. En el archivo .csv, multiplicar la concentración objetivo exportados por 4 para convertirlo de copia de destino (23S gen de Enterococcus spp. O el marcador HF183) por reacción de l copiar del objetivo por l plantilla de ADN.

Resultados

Un buen centro EntHF183 duplex dPCR debe dar lugar a relativamente alto número de gotitas aceptados (ca. 10,000-17,000) y diferencia relativamente grande (ca. 5000) entre los valores de fluorescencia para las gotitas de negativos y positivos ^7. Inusualmente bajo número de gotitas probablemente indica problemas en el proceso de generación de las gotas, y un punto de corte de 10.000 gotitas se sugiere a partir de datos empíricos del sistema dPCR gotita util...

Discusión

Hay unos pocos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la mezcla de las mezclas de ensayo puede ser difícil porque la mezcla maestra es más viscoso que las mezclas convencionales maestros qPCR. agitación simple puede conducir a una mezcla insuficiente, que a su vez conduce a una distribución no uniforme de moldes de ADN en las mezclas de ensayo y, posteriormente, en las gotitas. La técnica de mezcla por pipeteado se describe en el protocolo se debe seguir para asegurar la cuantificación precisa dPCR. En ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.