Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine Duplex - Digital - PCR - Assays (EntHF183 dPCR) für die simultane Quantifizierung von Enterococcus spp. Und dem menschlichen HF183 Marker fäkal-assoziiert. Die EntHF183 Duplex dPCR (bezeichnet als EntHF183 dPCR hereon) Test verwendet die gleichen Primer und Sonden-Sequenzen wie die veröffentlichten Einzel quantitative PCR (qPCR) Pendants. Ebenso wie die gleichen Wasserfiltration und DNA-Extraktionsverfahren vor der qPCR durchgeführt werden, bevor anschließend dPCR zu laufen. Jedoch hat der duplex dPCR Assay mehrere Vorteile gegenüber den qPCR-Assays. Am wichtigsten ist, beseitigt die dPCR Assay die Notwendigkeit für eine Standardkurve ausgeführt wird und somit die zugeordnete Bias und Variabilität, durch direkte Quantifizierung ihrer Ziele. Darüber hinaus, während Duplexing (dh simultane Quantifizierung) Enterococcus und HF183 in qPCR führt oft zu schweren Unterschätzung der weniger reichlich Ziel in einer Probe stellt dPCR konsistente Quantifizierung beider Ziele, wetzensie einzeln oder gleichzeitig in dem gleichen Reaktions quantifiziert. Der dPCR Assay ist auch in der Lage PCR Inhibitorkonzentrationen zu tolerieren, 1.59 Grßenordnungen höher sind als diejenigen, die durch qPCR toleriert. Diese Vorteile machen die EntHF183 dPCR Test besonders attraktiv, weil es bietet gleichzeitig präzise und wiederholbare Informationen über allgemeine und Mensch-assoziierte fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässern ohne die Notwendigkeit zwei getrennte qPCR-Assays auszuführen. Trotz seiner Vorteile gegenüber qPCR, wobei der obere Bestimmungsgrenze des dPCR Assay mit derzeit verfügbaren Instrumentierung ist ungefähr vier Größenordnungen niedriger als die erzielbaren qPCR. Folglich wird Verdünnung für die Messung hoher Konzentrationen von Zielorganismen erforderlich, wie sie typischerweise folgende Abwasser Verschüttungen beobachtet.

Einleitung

Quantitative PCR (qPCR) Verfahren wurden für die Freizeit-Überwachung der Wasserqualität und mikrobiellen Quelle Tracking-Anwendungen weit verbreitet, weil sie schneller sind, flexibler und spezifischer im Vergleich zu traditionellen Kultur-basierten Methoden. Folglich wird qPCR für die Erzielung eines raschen Wasserüberwachungsergebnisse für die allgemeine fäkale Indikatoren wie Enterococcus spp empfohlen. In den überarbeiteten USEPA Erholungswasserqualitätskriterien ^1. Viele qPCR - Assays wurden auch zur Identifizierung von Quellen von fäkale Verunreinigungen in Umwelt Gewässer ² entwickelt und validiert. Unter diesen sind die HF183 Marker - Assays unter den am häufigsten verwendeten zur Identifizierung von Menschen assoziiert fäkale Verunreinigung ^3.

Jedoch kann qPCR Ergebnisse oft vorgespannt werden, da sie auf Standardkurven für die Quantifizierung verlassen. qPCR quantifiziert unbekannten Konzentrationen von Ziel in Proben, die durch ihre Quantifizierung Zyklus Interpolation (CQ) von einem standard Kurve, die eine lineare Beziehung zwischen Cq und logarithmische Menge einer Gruppe von seriell verdünnten Standards beschrieben. Der Mangel an zuverlässigen und konsistenten Standardreferenzmaterial kann daher vorspannen stark qPCR Ergebnisse. Studien zeigten , dass qPCR Ergebnisse um etwa die Hälfte ein Protokoll unter Verwendung von Standards von verschiedenen Anbietern unterschiedlich ⁴ und durch 2-fach verschiedenen Chargen von Standards vom gleichen Hersteller ⁵ verwenden.

Digital PCR (dPCR) -Technologie quantifiziert eine unbekannte Probe durch die Frequenz von Positiven in eine große Anzahl von Miniatur - PCRs zählen , die ⁶ durch Partitionieren eines bulk qPCR in Tausende oder Millionen von gleichförmigen Nanoliter oder Pikoliter - Reaktionen erzeugt werden. Es wird als Tröpfchen digital PCR (dh in diesem Artikel) oder Kammer digitalen PCR jeweils bezeichnet, wenn die Trennwände Wasser-in-Öl - Tröpfchen (dh in diesem Artikel) oder kleine Kammern auf einem Chip sind. Eine höhere Probenkonzentration wird in Anwesenheit von Ziel-DNA führen(Daher positive PCR) in einem höheren Anteil von Trennwänden, eine Beziehung, die durch Poisson-Verteilung angenähert. Als solche sind die binären Ergebnisse (positive oder negative PCR) erfasst und die Frequenz der positiven Tröpfchen verwendet wird unbekannten Probenkonzentrationen direkt über Poisson Approximation zu berechnen, wodurch die Notwendigkeit für eine Standardkurve wie in qPCR eliminieren.

Diese binäre Art der digitalen PCR Quantifizierung bietet zusätzliche Vorteile gegenüber qPCR ^7. Da verzögerte Verstärkung noch eine positive PCR ergeben können, ist dPCR Quantifizierung robuster gegenüber Hemmung, die Verstärkungseffizienz verringert. In ähnlicher Weise wird dPCR Quantifizierung nicht durch Variabilität in Cq - Werte betroffen wie qPCR ist, zu einer höheren Genauigkeit der dPCR führt im Vergleich zu qPCR ^8-10.

Darüber hinaus gewährleistet das Unterteilungsprozesses eine sehr kleine Menge an Ziel-DNA in jedem Tröpfchen, Substrat Wettbewerb effektiv minimiert wird (während amplification der verschiedenen DNA - Targets), die gemeinsame Hindernisse für Duplex- zu erreichen (dh ein Test misst gleichzeitig zwei DNA - Targets) in qPCR. Als solches ob Lauf im Duplex- oder Simplex (dh ein Ziel in einem einzigen Assay gemessen wird) dPCR produziert fast nicht zu unterscheiden Quantifizierung beider Ziele ^7,11.

Das Ziel des digitalen PCR - Assay (EntHF183 dPCR) in diesem Artikel beschriebene gleichzeitige direkte Quantifizierung der allgemeinen fäkale Indikator Enterococcus spp zu erhalten. Und die human-fäkale assoziiert HF183 Marker mit verbesserter Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Robustheit gegenüber Hemmung im Vergleich zu seiner qPCR Pendants. Dieser Assay wurde zur Quantifizierung der fäkalen Kontamination in Umwelt Süßwasser, Meerwasser, und verschiedene Fäkalmaterial ^7, kann aber auch angewendet werden auf andere Arten von Gewässern und Abwässern eingesetzt. Dieser Test ist sehr vielversprechend für Sedimente oder Böden aufgrund seiner Analyses eine hohe Toleranz gegenüber der Hemmung, aber weitere Tests wegen Komplexitäten erforderlich Inhibitor in diesen Arten von Proben vermischt.

Protokoll

1. Assay-Mischung Vorbereitung

1. Machen Sie 100 & mgr; mol / L Lager Konzentrationen für alle Primer in UPW Wasser und Sonden in TE pH 8 - Puffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ^12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 ^3].
   Hinweis: Die Sonden für die beiden Ziele sind fluoreszierend mit unterschiedlichen Fluorophore ⁷ , wie in Liste der Materialien / Ausrüstung bezeichnet.
2. Bereiten Sie Master-Mix durch Mischen, pro Reaktion geplant, 12 ul digitale PCR-Mix (2x Lager, siehe Liste der Materialien / Geräte), 0,216 ul jeder Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 0,06 & mgr; l jeder Fluoreszenzsonde und 5,016 ul Nuclease freies Wasser (Endkonzentration : 900 nM von jedem Primer, 250 nM jede Sonde). Pipette nach oben und unten mindestens 10 Mal zu mischen, während Vorsicht nehmen keine Luftblasen in der Lösung einzuführen.
3. Pipette 18 ul Master-Mix (aus Schritt 1.2) in eine reguläre PCR-Röhrchen oder Platte, Mischen in 6 ul DNA-Matrize (wie frü extrahiertschlauen ¹³⁾ Assay - Mischung zur Tropfenerzeugung zu machen. Wenn laufen die Proben im Doppel, pipettieren 36 & mgr; l Master-Mix und 12 & mgr; l DNA-Matrize in jede Vertiefung. Lassen Sie die entsprechenden Wiederholungsvertiefungen auf dem Teller leer. Fügen Sie positive Kontrollen (siehe Liste der Materialien / Ausrüstung) und keine Template - Kontrollen (NTC) (dh mit UPW Wasser als Vorlage verwendet).
   Anmerkung: Positive Kontrolle ist notwendig, der Test ordnungsgemäß ausgeführt wird, um sicherzustellen, und der NTC ist notwendig, um sicherzustellen, dass keine Kontamination innerhalb der Platte ist und die Fluoreszenzbasislinie einzustellen später in der Datenanalyse. Erstbenutzer sind sowohl unverwässert und verwässert DNA-Proben zu verwenden, empfohlen.

2. Tröpfchenerzeugung und PCR-Platten-Setup

1. Mischen Sie die Testgemische durch Pipettieren von oben nach unten etwa 15-mal mit einer Mehrkanalpipette verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze innerhalb Flüssigkeit bleibt überschüssige Blasen in der Mischung zu vermeiden, zu machen.
2. insert Patrone 1 (mit 8 Vertiefungen) in einen weißen Kassettenhalter und klicken Sie auf den Patronenhalter zu. Kartusche 1 ist jetzt fest an seinem Platz und kann nicht aus dem Halter verdrängt werden, während Tröpfchen zu erzeugen. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Transfer sanft 20 ul Testmischung in die mittlere Position der Kassette markiert 'Sample' ohne Luftblasen einzuführen.
3. Pipettieren in 70 & mgr; l Tropfenerzeugung Öl auf die linke Seite der Kassette (markiert "Öl").
4. Abdeckung Patrone mit einer Dichtung dafür, dass die Dichtung eben ist und gleichmäßig durch die 4 gehalten Zecken auf den Rand der Patrone. Drücken Sie die grüne beleuchtete Taste auf dem Tropfengenerator zu öffnen und die Kassette legen. Drücken Sie die grüne beleuchtete Taste erneut, um den Generator zu schließen.
   Hinweis: Sobald die Tür schließt, wird die Schaltfläche abgeblendet, kann die Tür nicht wieder geöffnet werden und Tropfenerzeugung beginnt sofort für ca. 1 min fortgesetzt.
5. Wenn mehr als 8 Reaktionen zu tun, statt Patrone 2 in einer zweitenweiß Patronenhalter und bereiten in der gleichen Weise wie Patrone 1, während die Tröpfchenerzeugung läuft Gesamtaufbauzeit zu sparen.
6. Öffnen Sie den Tropfengenerator Tür, wenn das trübe beleuchtete Taste grün leuchtet Abschluss der Tropfenerzeugung angibt. Entfernen Sie die weiße Patronenhalter enthaltende Patrone 1, beiseite stellen und Platz Patrone 2 auf den Tröpfchengenerator.
7. Entfernen Sie die Dichtung aus der Patrone 1 und entsorgen. übertragen Sie vorsichtig das Gesamtvolumen (ca. 40 & mgr; l) der erzeugten Tröpfchen aus der dritten Spalte der Patrone (Aufschrift "Droplets ') auf eine endgültige PCR-Platte (bei Raumtemperatur gehalten) für thermische Zyklen.
   Hinweis: Verwenden Sie nicht die weiße Patronenhalter als Aktion unclick die neu erzeugten Tröpfchen brechen; nur öffnen Sie die Patronenhalterung, nachdem die Tröpfchen auf die endgültige Platte übertragen worden sind.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,7 für zusätzliche Proben.
9. Wenn alle Tröpfchen in der letzten PCR-Platte sind, legen Sie eine durchstechbareFolienabdeckung auf der Oberseite der Platte und legen Sie es auf Abklebefolie. Stellen Sie die Versiegelung auf 180 ° C, drücken Sie "Play" auf der Versiegelung und lassen Dichtung für 10 Sekunden.

3. Thermische Radfahren und Droplet Lesen

1. Legen Sie die versiegelte Platte auf dem Thermocycler, ein kompatibel mit dem endgültigen PCR-Platte verwendet in Schritt 2.7 und einer Temperatur Rampengeschwindigkeit von 2,0 ° C / s.
2. Thermo Programm starten wie folgt: 10 min bei 95 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C und 60 Sekunden bei 60 ° C, gefolgt von einer 10 min Halten bei 98 ° C (optional: Endverweilzeit bei 4 oder 15 ° C).
3. Nach Abschluss des Radsports, übertragen Sie die Platte auf ein Droplet Reader zur automatischen Messung der Fluoreszenz in jedem Tröpfchen in jeder Vertiefung. Alternativ speichern Sie die Platte bei 4 ° C bis zu 3 Tage vor Tröpfchen Lesen. Sicherstellen, dass die Tröpfchen bei Raumtemperatur sind, bevor mit dem Lesen fortfahren.
   1. Öffnen Sie die mitgelieferte Software die Tröpfchen Lesen einrichten. Imdie Standard-Menü "Setup" ein Schema einer leeren 96-Well-Platte, klicken Sie doppelt auf gut A1 zu öffnen Sie das Menü mit drei Abschnitte enthält: "Sample", "Test 1" und "Assay 2."
   2. In der 'Sample' Abschnitt geben Sie die Proben-ID in das Feld mit der Bezeichnung "Name" und drücken Sie die Eingabetaste oder die Box auf der rechten markiert überprüfen "Übernehmen". Als nächstes klicken Sie auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung 'Experiment' und geben Sie 'RED' (seltene Ereigniserkennung) und klicken Sie wählen.
   3. Verschieben Sie in dem Abschnitt 'bezeichnet Assay 1. " In der 'Name' Abschnitt füllen Sie den Test (zB Enterococcus) und drücken Sie die Eingabetaste. In der unten stehenden Tabelle als 'Typ' klicken Sie auf das Dropdown-Menü und wählen Sie "Kanal 1 Unknown" und drücken Sie die Eingabetaste.
   4. Verschieben Sie in dem Abschnitt 'bezeichnet Assay 2. " In der 'Name' Abschnitt füllen Sie den Test (zB HF183) und drücken Sie die Eingabetaste. In der unten stehenden Tabelle als 'Typ' klicken Sie auf das Dropdown-Menü eind 'Kanal 2 Unknown "wählen und drücken Sie die Eingabetaste. Alle Informationen aus den Schritten 3.3.2 bis 3.3.4 ist jetzt in gut A1.
   5. Nennen Sie alle nachfolgenden Vertiefungen, die Tröpfchen. Um insgesamt Rüstzeit speichern, klicken Sie auf "Shift" oder "Strg", um mehrere Vertiefungen gleichzeitig wählen.
   6. Wenn die digitale Darstellung der Platte spiegelt die physische Platte, drücken Sie "OK" an der unteren rechten Ecke des Menüs. Im neuen Menü, das an der Oberseite der Platte schematisch, unter der "Vorlage" Abschnitt wählen "Speichern unter" und den Namen und speichern Sie die Platte erscheint.
   7. Auf der linken Seite des Bildschirms klicken Sie auf "Ausführen" und wählen Sie die entsprechende Farbstoffsatz im Pop-out "Ausführungsoptionen" Fenster. Datenerfassung initiiert und wird in Echtzeit in der Software angezeigt.

4. Datenanalyse und Bericht

1. Wenn der Leser beendet ist und ein Feld "Run Schließe" angezeigt, die besagt, klicken Sie auf "OK".
   Hinweis: Die weichenware zeigt die letzte Datendatei unter dem Abschnitt der Software "Analysieren". In dieser Ansicht hat die Software alle Vertiefungen in der Platte ausgewählt und standardmäßig auf das Diagramm "2D-Amplitude".
2. Überprüfen Sie den Abstand zwischen den positiven und negativen Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz in aller Tröpfchen in den NTC-Brunnen in der Nähe von Baseline sind.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung "Events". pro Vertiefung Auf der rechten Seite des dargestellten Histogramm auf das Feld namens 'Total' und die Box namens "Single" am unteren Rand die Gesamtzahl der akzeptierten Tröpfchen anzuzeigen. Schließen Sie alle Vertiefungen , die <10.000 Tröpfchen ⁷ indem Sie die Strg - Taste gedrückt halten und auf die auch (s) ausgeschlossen werden.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche bezeichnet als "1D Amplitude" bei etwa einer Standardabweichung der Fluoreszenzschwelle einzustellen (500-700 Fluoreszenzeinheiten) über die negativen Tröpfchen in NTC Brunnen für beide Ziele. Ganz am linken Bildschirmrand under die "Auto Analysieren 'zeigt zwei Schwellen Tasten, wählen Sie das Symbol auf der rechten Seite, die eine solide rosa horizontale Linie durchzogen.
5. Klicken Sie in das Feld auf der linken Seite 'Set Threshold' unter jedem der Amplitudendiagramme und geben Sie die entsprechenden Fluoreszenzschwellenwerten. Die Zielkonzentrationen in Kopie pro ul Reaktion werden dann automatisch berechnet.
   Anmerkung: Die Schwellen müssen nicht für die unterschiedlichen Ziele identisch.
6. Exportieren Sie die Ergebnisse in einer CSV-Datei, indem Sie den "Export" Button in der linken oberen Ecke einen Klick auf den 1D-Amplitude-Bildschirm. In der CSV - Datei, multiplizieren Sie die exportierte Zielkonzentration von 4 es von Target (23S - Gen von Enterococcus spp. Oder der HF183 Marker) von Kopie zu konvertieren pro ul Reaktion von Ziel pro ul DNA - Vorlage zu kopieren.

Ergebnisse

Eine gute EntHF183 duplex dPCR Lauf in relativ hohe Anzahl von akzeptierten Tröpfchen (ca. 10,000-17,000) und relativ große Differenz (ca. 5000) zwischen Fluoreszenzwerte für negative und positive Tröpfchen ⁷ führen. Ungewöhnlich niedrige Anzahl von Tröpfchen gibt wahrscheinlich Probleme in der Tröpfchenerzeugungsprozess und einen Cutoff von 10.000 Tröpfchen basiert auf empirischen Daten aus dem Tröpfchen dPCR System in diesem Artikel verwendeten vo...

Diskussion

Es gibt einige wichtige Schritte in dem Protokoll. Erstens kann der Testgemische Mischen schwierig sein, da der Master-Mix mehr viskos ist als herkömmliche qPCR Master Mixes. Einfache Vortexen kann zu einer unzureichenden Durchmischung führen, was wiederum zu einer ungleichmäßigen Verteilung von DNA-Matrizen in den Testgemischen und anschließend in den Tröpfchen. Die Misch-by-Pipettiertechnik in dem beschriebenen Protokoll müssen befolgt werden, um genaue dPCR Quantifizierung zu gewährleisten. Zweitens ist es wi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Bind Microtubes	Costar	3207	For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 buffer	FisherSci	BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate	BioRad	HSP-9601	For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film	BioRad	359-0133	To seal sample plate
Droplet Generator	BioRad	186-3002
Droplet Generation Oil	BioRad	186-3005
Cartridge	BioRad	186-4008
DG8 Cartridge Holder	BioRad	186-3051
Gasket	BioRad	186-3009
20 μl pipet tips	Rainin	GP-L10F	For tansferring sample/master mix to cartidge
200 μl pipet tips	Rainin	GP-L200F	For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate	Eppendorf	951020320	For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil	BioRad	181-4040	To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer	BioRad	181-4000
CFX96 Thermalcycler	BioRad	CFX96 and C1000	Only the thermal cycler is needed, no optics
QX100 Droplet Reader	BioRad	186-3001
Droplet Reader Oil	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen.
Positive control			Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.