JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مع ABC نقل الفئران Bcrp1 (Abcg2) على سبيل المثال، تعرض البروتوكولات في سيليكون للكشف عن استخدام المروج بديل في الجينات وأعرب في الأنسجة الماوس، وتقييم الأداء الوظيفي من المروجين بديل تحديدها باستخدام المقايسات مراسل.

Abstract

وغالبا ما يسيطر التعبير الجيني في أنسجة مختلفة من قبل المروجين البديل الذي يؤدي في تركيب مرنا مع فريدة من نوعها - عادة غير مترجمة - الإكسونات الأولى. Bcrp1 (Abcg2)، وorthologue الفئران من ABC نقل الثدي البروتين السرطان المقاومة (BCRP، ABCG2)، وأربعة على الأقل المروجين البديلة التي يتم تحديدها من قبل أربعة الإكسونات الأولى البديلة المناظرة التي تنتجها: E1U، E1A، E1B، وE1C. هنا، يتم عرض البروتوكولات في سيليكون للتنبؤ استخدام المروج بديل للBcrp1. وعلاوة على ذلك، وصفت وسائل مراسل فحص لإنتاج بنيات مراسل المروجين بديل وتحديد وظيفة من المروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة التي يتم تحديدها.

Introduction

أكثر من نصف الجينات البشرية التي ينظمها المروجين البديل 1. يمكن أن تحتوي على كل المروج البديل العناصر التنظيمية التي قد تكون مختلفة عن تلك الموجودة في المروجين بديل آخر. المروج (ق) المستخدمة في نسيج واحد قد تختلف عن تلك المستخدمة في أنسجة أخرى. على سبيل المثال، فمن الممكن أن تفعيل مسار إشارات معينة قد تؤدي إلى مروج بديل لجين المستخدمة في نسيج واحد، ولكن ليس لها أي أثر أو قمع المروج بديل مستقل لنفس الجين الذي يستخدم في أنسجة أخرى.

يخضع التعبير عن الجينات Bcrp1 قبل المروجين بديل. Bcrp1 هو orthologue الفئران من الجين الثدي البشري السرطان المقاومة البروتين (BCRP). BCRP هو ملزم ATP كاسيت (ايه بي سي) نقل، وعينت رسميا ABCG2 2 و 3. باعتبارها قمي بلازما بروتين الغشاء، BCRP / وظائف Bcrp1 إلى هروب رأس المال مجموعة متنوعة واسعة من ركائز الطبيعية وأجنبي بيولوجيا 3، 4. في البشر والفئران، وأعرب عن BCRP / Bcrp1 غاية في الأجهزة المختصة في صناعة الأدوية مثل الكبد (الصفراء نفيق) والأمعاء، والكلى، وكذلك أجهزة بحواجز الدم الأنسجة مثل المشيمة والمخ والخصية 2، 5-12. التعبير عن BCRP / Bcrp1 في للدم والخلايا الجذعية الأخرى، بما في ذلك الخلايا الجذعية السرطانية، قد تمنح مقاومة هذه الخلايا إلى الاكسيوبيوتك والسرطان أدوية العلاج الكيميائي 3.

في العمل في وقت مبكر لفهم تنظيم التعبير BCRP في الخلايا الطبيعية والأورام، تم تنفيذ 5 "التضخيم السريع لغايات كدنا] (5'-RACE) تحليل BCRP مرنا لتحديد موقع بداية النسخي المحدد لها 13. لا لم يكن هناك سوى عدة مواقع بداية النسخي وجدت. واجه أيضا كانت ثلاثة أشكال بديلة من اكسون الأول، وهو غير مترجمة في BCRP. هذه الإكسونات الأولى بديلة - المعين E1A، E1B، E1c - وأعرب عن مختلف في مجموعة متنوعة من الأنسجة البشرية. تم اكتشاف نوعين مختلفين إضافية اكسون الأولى في البحث انفجار في قاعدة البيانات EST الإنسان باستخدام اكسون الثاني من BCRP 13. كشفت أربع مباريات في أول اكسون> 70 كيلوبايت المنبع من اكسون 2 التي كانت مخصصة E1u. كشفت أربع مباريات أخرى BCRP مرنا التي تفتقر الى اكسون الأول تماما، والتي كانت مخصصة E1- 13. ويعتبر وجود الإكسونات زعيم بديلة ليكون مظهرا من مظاهر استخدام المروج بديل 14.

في الفئران، وصفت أربعة الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 التي قد تتوافق مع المروجين البديلة التي تحكم Bcrp 1 النسخ في أنسجة مختلفة الماوس. وتتم تسمية هذه الإكسونات / المروجين E1U، E1A، E1B وE1C، وتقع حوالي 70، 58، 15، و 5 كيلو بايت المنبع من Bcrp1 اكسون 2 5، 15. تم العثور على الإسوي E1A مرنا هو السائد في murinالبريد الخلايا الجذعية المكونة للدم والقلب والرئة والطحال، والدماغ، في حين أعرب عن الإسوي E1B في الأمعاء الماوس، وخلايا الكبد الجنين، والخلايا محمر السلائف في نخاع العظام 5، 15. وقد أظهرت المروج المنبع من E1B أن يكون المروج البديل الرئيسي الذي يحكم النسخ Bcrp1 في الأمعاء الماوس، ينظم على الأقل جزئيا، من خلال الفوسفات-دوري-AMP عنصر استجابة بروتين (ف CREB) وعنصر استجابة CREB فريدة من نوعها لهذا البديل Bcrp1 المروج 16. يتم التعبير عن الإسوي E1C مرنا في الغالب في الكبد الفئران الكبار والكلى 5. شكل الإسوي E1U غير قابل للكشف في معظم الأنسجة اختبار باستثناء الخصية في الفئران، حيث هو شكل الإسوي الغالبة أعرب 5. وأعرب Bcrp1 في الخصيتين الفئران وجدت في كل جسدية (تقاطعات البطانية ضيقة، خلايا شبه عضلية peritubular، وخلايا سيرتولي) والخلايا الجرثومية (في البطانة المنوية، حيث حفظه نطفة أرومية في وقت متأخر من المرحلة 4). ليموزينأيون المنبع من E1U يحتوي على عنصر استجابة وظيفية لالستيرويدي المنشأ عامل 1 (SF-1) 5. يتم تخفيض Bcrp1 مرنا والبروتين بشكل ملحوظ في الخصيتين من سيرتولي خلية محددة SF-1 الفئران خروج المغلوب، مما يوحي بأن Bcrp1 التعبير في خلايا سيرتولي الفئران تسيطر عليها SF-1 5.

البروتوكولات المعروضة أساليب التفاصيل للكشف عن الإكسونات الأولى بديلة للBcrp1 في سيليكون، وإقامة فحوصات مراسل القائم على وسيفيراز للمروجين المفترض المنبع من الإكسونات الأولى البديلة المحددة.

Protocol

1. في السيليكو التنبؤ البديل exons متماثلة الأولى من Bcrp1 عن طريق تحليل انفجار في قاعدة البيانات ماوس EST

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول كيفية البحث في الماوس أعرب تسلسل العلامة (EST) قاعدة بيانات عن التكنولوجيات السليمة بيئيا مع تسلسل التشابه لاكسون 2 من Bcrp1 (الذي يحتوي على الموقع بداية متعدية) ثم كيفية محاذاة مطابقة متواليات EST لتسلسل الجينوم للتأكد من الموقع في الجين الماوس Bcrp1 نسبة إلى نهاية 5 'من Bcrp1 اكسون 2.

  1. الحصول على تسلسل للماوس Bcrp1 اكسون 2 عن طريق إدخال مرنا تسلسل إشارة معرف (NM_011920.3) في نافذة البحث في متصفح Ensembl الجينوم 17، انقر على "جو GO". في الشاشة التالية، حدد تسلسل كامل طول (يحتوي على 16 الإكسونات):
    1. في الشاشة التالية ( "العرض القائم على نسخة")، حدد "16 exons متماثلة." وهذا عرض شاشة تحتوي على تسلسل بكل exons من Bcrp1. واكسون 2 من Bcrp1 قراءة "59؛ -AAAGGC ... TATCAA-3 "النتائج التي تم الحصول عليها سوف تكون مشابهة لتلك التي تظهر في اشارة 18.
    2. انقر على خيار "تحميل تسلسل". في الشاشة التالية، اختر تنسيق FASTA، ثم اضغط على "معاينة". في الشاشة التالية، قم بنسخ تسلسل معاينة من اكسون 2 في الحافظة.
  2. انتقل إلى موقع الانفجار 19 على المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) موقع 20.
    1. حدد "ماوس" الجينوم. لصق تسلسل اكسون 2 من الحافظة في مربع البحث.
    2. حدد "التكنولوجيات السليمة بيئيا" من القائمة المنسدلة قاعدة البيانات، وتحسين ل "متواليات مشابهة للغاية"، ثم اختر "انفجار". وقت التشغيل سوف يستغرق بضع دقائق. عندما المدى انفجار كاملة، وسوف تظهر "نتائج" صفحة.
    3. تحت عنوان فرعي "الوصف" من "نتائج" الصفحة، حدد "ALL"، ثم "تحميل"، ثم "FASTA (كاملةتسلسل) "في القائمة المنسدلة، ثم اختر" متابعة "ستظهر ملف txt؛ مفتوحة ونسخ الملف بأكمله إلى الحافظة وملف txt يحتوي على تسلسل من كل التكنولوجيات السليمة بيئيا مع ارتفاع تسلسل التشابه مع exon2 الماوس Bcrp1. ولكن ليس موقفهم فيما يتعلق اكسون 2 في جين Bcrp1.
      ملاحظة: تحليل أجريت على 15 أبريل 2015 تحديد 14 التكنولوجيات السليمة بيئيا الفئران التي تتماشى مع Bcrp1 اكسون 2. يتم سرد هذه في الجدول 1.
  3. تحديد موقع تسلسل بتوقيت شرق الولايات المتحدة التي هي 5 'إلى اكسون 2 في جين Bcrp1. يقع هذا الجين الماوس Bcrp1 في contig NC_000072.6 كروموسوم 6 (GI: 372099104).
    1. على الصفحة الرئيسية لانفجار تحت عنوان فرعي "انفجار المتخصصة"، حدد "محاذاة اثنين (أو أكثر) تسلسل باستخدام انفجار (bl2seq)."
    2. لصق ملف نص من الحافظة في مربع البحث وأدخل 372099104 في مربع تسلسل الموضوع. تحسين ل "متواليات مشابهة للغاية" في إطار برنامجاختيار وتشغيل انفجار.
    3. مرة واحدة يظهر إطار النتائج، عرض التحالفات بيانيا عن طريق النقر على "الرسومات" في إطار "الأحلاف". استخدم السهمين الأيمن والأيسر والتكبير للتركيز على Bcrp1 / Abcg2 والاصطفافات تسلسل.
    4. حفظ التحالفات تسلسل: حدد "ALL" في خانة "الوصف"، ثم تحت "تحميل" القائمة المنسدلة حدد "ضرب الطاولة (CSV)"، ثم انقر على "متابعة". يحتوي هذا الملف على تسلسل محاذاة Bcrp1 اكسون 2 والتنسيق بين جميع متواليات EST مع تسلسل التشابه إلى Bcrp1 Exon2 النسبية لترقيم النيوكليوتيدات في contig كروموسوم الماوس 6. كل تسلسل EST الكامل قد تولد التحالفات متعددة تغطي المناطق 5 "و 3" لاكسون 2 بما في ذلك تسلسل متداخلة مع Bcrp1 اكسون 2.
    5. لأن الموقف من نهاية 5 'من اكسون 2 سوف تتوافق مع النوكليوتيدات 58655638 في contig كروموسوم 6، تعيين هذا النحو+1، ومن ثم حساب موقف تسلسل جزئية من كل EST 5 'إلى 58655638. يتم إعطاء النتائج لل14 التكنولوجيات السليمة بيئيا في الجدول 1.
      ملاحظة: كن حذرا لتحليل تسلسل بتوقيت شرق الولايات المتحدة التي هي 5 'إلى +1 (أي لها قيمة النوكليوتيدات السلبية) كما الإكسونات الأولى المحتملة. على سبيل المثال، في اثنين من التكنولوجيات السليمة بيئيا التي تتماشى مع Bcrp1 اكسون 2 هو مبين في الجدول رقم 1 (AI647825 وAI664571) كان التسلسل المتبقية 3 "لاكسون 2.

2. تقييم Bcrp1 البديل المروج وظيفة

  1. تصميم مراسل يبني لBcrp1 E1U، E1A، E1B والمروجين E1C
    1. باستخدام تسلسل E1U تم الحصول عليها من البحث في قاعدة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة، تعين أول "النوكليوتيدات 5 من E1U كما +1.
    2. الحصول على كروموسوم اصطناعي البكتيرية (BAC) نسخة من كروموسوم الماوس 6 الذي يحتوي على تسلسل الجين Bcrp1 / Abcg2 وتسلسل لا يقل عن 100 كيلو بايت من المنبعBcrp1 / Abcg2 الجين (انظر قائمة المواد والمعدات).
      1. تحديد ناقلات مراسل مناسبة مثل وسيفيراز مراسل البلازميد pGL3 الأساسية.
      2. تحديد مواقع الاستنساخ متعددة في ناقلات المراسل. KpnI، ساسي، Mlu1، NheI، SmaI، XhoI، BglII وHindIII هي مواقع تقييد نوكلياز داخلية في موقع استنساخ متعددة من ناقلات pGL3 الأساسية، في 5 'إلى 3' التوجه.
        ملاحظة: تسلسل المواقع الهضم هو متاح من كتالوجات المنتجات من الشركات التي تنتج الإنزيمات قيود.
      3. تحديد جميع المواقع الهضم في اكسون E1U والمنطقة 2 كيلوبايت 5 'من E1U باستخدام برامج الحاسب الآلي مثل DNA5. تحديد موقعين على الأقل الهضم في عدة الموقع الاستنساخ-pGL3 الأساسية التي لا توجد في E1U أو المنطقة المنبع 2 كيلوبايت.
        ملاحظة: تأكد من اختيار متعددة موقع تقييد الموقع استنساخ لالتمهيدي إلى الأمام وهذا هو المنبع من اختيار واحد لالتمهيدي العكسي لضمان إدراج فيلل يكون في الاتجاه الصحيح.
    3. إعداد الأمام وعكس الاشعال ل PCR التي تحتوي على تسلسل للمواقع متعددة تقييد الموقع استنساخ نوكلياز داخلية-pGL3 الأساسية المحددة باستخدام خدمات التركيب الجيني / التمهيدي التجارية أو برامج اختيار التمهيدي (انظر قائمة المواد والمعدات). حدد التمهيدي إلى الأمام تقع ~ 2 كيلوبايت المنبع من تسلسل E1U والتمهيدي العكسي ضمن تسلسل E1U. الاشعال المستخدمة في المؤلفين الأعمال السابقة أدرجت موقع ساسي في التمهيدي إلى الأمام، وموقع NheI في التمهيدي العكسي، وتضخيم المنطقة الجينومية من حوالي -1٬906-64 مع أول 5 "النوكليوتيدات E1U على النحو المحدد + 1 (راجع الخطوة 2.1.1 أعلاه)، ويتم توفيرها في اشارة 16.
      1. PCR تضخيم المنطقة الجينومية E1U استخدام هذه الاشعال، ،01-1 ميكروغرام من BAC، ومزيج الرئيسي PCR التي تحتوي على بلمرة طق عالية الدقة (انظر قائمة المواد والمعدات) مع تغيير طبيعة في95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 35-40 دورات PCR، مع التمديد في 72 ° C (2 دقيقة)، والصلب وذوبان درجات الحرارة على أساس الخصائص ذوبان الاشعال المستخدمة.
        ملاحظة: استخدام بلمرة طق عالية الدقة ضروري للمناطق تسلسل المروج التي تحتوي على محتوى GC عالية. عند استخدام كبيرة شظايا الحمض النووي الجيني مثل BAC كقالب، وهيكل ثانوي من الحمض النووي الجيني قد يجعل من الصعب على الاشعال PCR لربط. إذا دعت هذه المشكلة، ويمكن الحصول على النتائج PCR أفضل إذا تم المنفصمة القالب الحمض النووي الجيني طويلة بلطف بواسطة صوتنة قبل تفاعل PCR.
      2. تحقق من طول المنتج PCR تضخيم بمقارنة ضد 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي باستخدام 0.8٪ تاي agarose هلام الكهربائي.
    4. هضم المنتج PCR التي تم الحصول عليها وناقلات pGL3 الأساسية، وذلك باستخدام تقييد نوكلياز داخلي محدد للمواقع الهضم تقييد أدخلت إلى الأمام وعكس الاشعال وفقا الإضافيةtructions المتوفرة مع الانزيمات تقييد الهضم.
      1. تنقية ردود الفعل الهضم باستخدام جل SV التجاري ومجموعة PCR تنظيف أنظمة (انظر قائمة المواد والمعدات)، وبعد عدة البروتوكول 21.
        1. تحقق الهضم والخطية للناقلات عن طريق مقارنتها ضد ناقلات تقطيعه باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام، ثم قص وتنقية الفرقة ناقلات الحمض النووي هضمها. قياس تركيز المنتج PCR المنقى وناقلات تنقيته باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية (انظر قائمة المواد والمعدات).
    5. إعداد مراسل بناء E1U التي كتبها ligating المطهرون، هضم انزيم التقييد PCR المنتج واليراع ناقلات مراسل وسيفيراز-pGL3 الأساسية (الواردة في عدة الفحص مراسل، انظر قائمة المواد والمعدات) في إدراج: نسب متجه 11 و 21 و 31، باستخدام "T4 DNA يغاز عدة ربط سريع" وفقا لتعليمات مجموعة 22، وبالتالي إنتاج ص E1Uبناء eporter، واسمه pGL3-E1U.
      1. استخدام البلازميد pGL3-E1U لتحويل البكتيريا إلى توسيع متطابق بسلالة pGL3-E1U التعليمات التالية في عدة الاستنساخ TA (انظر قائمة المواد والمعدات).
      2. تأكيد التوجه والإخلاص للإدراج من خلال تحليل تسلسل.
    6. يبني إعداد مراسل E1A، E1B وE1C باستخدام منهجية مماثلة لE1U. تأكيد الولاء للإدراج بواسطة التسلسل كما هو الحال في القسم 2.1.5.2.
      ملاحظة: إدراج المروج للE1A، E1B وE1C يجب أن يكون حوالي -1875 / + 10، -1847 / + 60، و-1904 / + 83 نسبة إلى أول "النوكليوتيدات 5 (تسمى +1) من E1A، E1B، أو E1C، على التوالي.
  2. أساليب مراسل مقايسة
    ملاحظة: استراتيجية عامة للفحوصات مراسل: المروج المفترض (5 'المنطقة المنبع) من الجين يتم إدراجها في موقع استنساخ متعددة من "مراسل" ناقلات الفارغة التي تحتوي على "أوردتهمورثات المقاومة "(على سبيل المثال، يراعة وسيفيراز) المصب من موقع استنساخ متعددة. ثم يتم transfected متجه إلى خلايا حقيقية النواة التي تعبر عن هذا الجين من الفائدة. العوامل التي تعمل العابرة التي تعزز التعبير عن الجين في هذه الخلايا يجب تفعيل المروج في ناقلات مراسل transfected، مما تسبب في التعبير عن يراعة luciferase، والتي يمكن قياسها بسهولة مع مقايسة التألق.
    1. حدد خط الخلية المناسب لاستخدامه في فحص المراسل.
      ملاحظة: لتقييم نشاط E1U مراسل البديل المروج بناء، فمن الضروري ل transfect أن بناء في الخلايا التي تعبر عن Bcrp1 تحت سيطرة المروج E1U. خط خلية سيرتولي الفئران TM4 (انظر قائمة المواد والمعدات) يعبر عن بروتين Bcrp1 وBcrp1 مرنا يحتوي E1U، وكذلك E1A، E1B، وE1C 5. ونتيجة لسيطرة سلبية، والنظر في استخدام خط الخلية التي لا يعبر عن بروتين Bcrp1 أو مرنا.
    2. ثقافة م TM4LLS في 24 لوحات جيدة في كثافة الأولية من 200،000 خلايا جيدا / في 1: 1 خليط من المتوسط ​​F12 هام وتعديل المتوسطة النسر Dulbecco ومع 1.2 جم / لتر بيكربونات الصوديوم، تستكمل 15 ملي HEPES مع مصل الحصان 5٪، 2.5٪ مصل الجنين البقري، البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، كما هو موضح سابقا 5.
    3. بعد ست ساعات من وضع الخلايا في الثقافة، transfect الخلايا مع 0.2 ميكروغرام من ناقلات pGL3 الأساسية فارغة أو مع 0.2 ميكروغرام من ناقلات pGL3 تحتوي على E1U -1906 / + 64 أو -1875 / + 10 E1A أو -1847 / + 60 E1B أو -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 الحذف بناء على طول مع 4 نانوغرام من ااا-TK (أ Renilla، معربا عن وسيفيراز ناقلات)، والرقابة الداخلية، وذلك باستخدام مجموعة الحمض النووي ترنسفكأيشن التجارية وبروتوكول الشركة المصنعة 23 (انظر قائمة المواد والمعدات) .
    4. 30 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائط النمو من الثقافيهإد transfected الخلايا. غسل خلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ثم إزالة محلول الغسيل.
      1. قياس اليراع وRenilla luciferase النشاط يستخدم عدة التجارية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة 24.
    5. تعبير عن النشاط لكل أنبوب كنسبة من النشاط يراعة luciferase مقسوما على (وسيفيراز Renilla) للرقابة الداخلية. وأعربت النتائج الإجمالية عادة نشاط كل مراسل بناء النسبي لتلك الخلايا transfected مع فارغة pGL3 ناقلات الأساسي، الذي حصل على القيمة 1.

النتائج

تحديد Bcrp استخدام المروج 1 بديل في الخصية الماوس عن طريق تحليل الإكسونات الزعيم

عندما تم بحثها قاعدة البيانات بتوقيت شرق الولايات المتحدة في NCBI (أبريل 2015) با...

Discussion

وصفت معظم الأساليب والنتائج التمثيلية التي قدمت في أعمال سابقة بعنوان "يتم التحكم ب crp1 النسخ في الخصية الماوس بواسطة مروج المنبع من اكسون الرواية الأولى (E1U) التي تنظمها عامل 1 الستيرويدي المنشأ"، والتي نشرت في عام 2013 5 بالإضافة إلى نتائج تمثيلية يصور ه...

Disclosures

دوغلاس د روس وجامعة ماريلاند، بالتيمور عقد حقوق براءات الاختراع لBCRP البشري.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل جوائز مراجعة الاستحقاق لدوغلاس د روس وعارف حسين من وزارة شؤون المحاربين القدامى.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kitAmbion Inc., Austin, TX, currently available through Life TechnologiesAM17005'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kitLife TechnologiesK450001This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kitNew England BiolabsM2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymeraseSigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagentRoche6366236001
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1910Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprepQiagen27104For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vectorpart of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vectorPromegaE1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vectorPromegaE2241
Bacterial artificial chromosomeBACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CARP23-285A12 and RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALSDenville ScientificV9012
SOFTWARE:
Ensembl softwareEnsembl projecthttp://Ensembl.org The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast softwareNCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 softwareSimgenehttp://simgene.com/Primer3Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide databaseNCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cellsATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715™
INSTRUMENTS:
LuminometerTurner BiosystemsTD-20/20This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometersThermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II softwareBeckmanCoulter Inc, Fullerton, CADU 800

References

  1. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
  2. Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
  3. Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
  4. Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
  5. Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
  6. Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
  7. Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
  8. Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
  9. Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
  10. Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
  11. Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
  12. Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
  13. Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
  14. Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
  15. Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
  16. Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
  17. Promega. . Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
  18. New_England_Biolabs. . Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
  19. Roche. . XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
  20. Promega. . Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
  21. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  22. VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
  23. Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
  24. Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
  25. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
  26. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  27. Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

111 Bcrp1 E1U 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved