Méthodes à découvrir Alternative Utilisation de promoteur et la régulation transcriptionnelle de Murine BCRP1

Résumé

Avec les anticorps monoclonaux transporteur ABC BCRP1 (ABCG2) à titre d'exemple, dans le silico protocoles sont présentés pour détecter l' usage alternatif du promoteur des gènes exprimés dans des tissus de souris, et pour évaluer la fonctionnalité des promoteurs alternatifs identifiés en utilisant des dosages de rapporteur.

Résumé

L'expression des gènes dans différents tissus est souvent contrôlée par des promoteurs alternatifs qui aboutissent à la synthèse d'ARNm avec uniques - - généralement non traduites premiers exons. BCRP1 (ABCG2), l'orthologue murin de l'ABC Breast transporteur Résistance cancer Protein (BCRP, ABCG2), a au moins quatre autres promoteurs qui sont désignés par les quatre premiers exons correspondants alternatifs produits: E1U, E1A, E1B et E1C. Ici, in-silico protocoles sont présentés pour prédire l' utilisation de promoteur alternative pour BCRP1. En outre, les méthodes de dosage de rapporteur sont décrits pour produire des constructions rapporteurs de promoteurs alternatifs et pour déterminer la fonction de promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.

Introduction

Plus de la moitié des gènes humains sont réglementés par des promoteurs alternatifs ^1. Chaque promoteur alternative peut contenir des éléments régulateurs qui peuvent être différentes de celles des autres promoteurs alternatifs. Le promoteur (s) utilisé dans un tissu peut être différent de ceux utilisés dans un autre tissu. Par exemple, il est possible que l'activation d'une voie de signalisation donnée peut déclencher le promoteur d'un gène de remplacement utilisé dans un tissu, mais n'a aucun effet sur ou réprimer un promoteur alternatif distinct pour le même gène qui est utilisé dans un autre tissu.

L'expression du gène BCRP1 est régie par des promoteurs alternatifs. BCRP1 est l'orthologue murin du gène humain du sein Cancer Resistance Protein (BCRP). BCRP est une cassette de liaison à l' ATP (ABC) transporteur, officiellement désigné ABCG2 ^{2, 3.} En tant que plasma protéine de la membrane apicale, BCRP Fonctions / BCRP1 à efflux une grande variété de substrats naturels et xénobiotiques ^{3, 4. Chez les humains et les souris, BCRP / BCRP1 est fortement exprimé dans les organes pharmacologiquement appropriés tels que le foie (canalicules biliaires), l' intestin et du rein, ainsi que les organes des barrières hémato-tissus , tels que le placenta, le cerveau et les testicules 2, 5-12. L' expression de BCRP / BCRP1 dans hématopoïétiques et d' autres cellules souches, y compris les cellules souches du cancer, peut conférer une résistance de ces cellules à des xénobiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques cancer 3.}

Dans le travail tôt pour comprendre la régulation de l' expression de BCRP dans les cellules normales et néoplasiques, 5 'amplification rapide des extrémités d'ADNc (5'-RACE) analyse de BCRP ARNm a été réalisée afin de déterminer son site de départ de la transcription exacte ^13. Non seulement plusieurs sites de début de transcription trouvés; rencontre également, trois variantes du premier exon, qui est non traduite BCRP. Ces alternatives premiers exons - désignés E1a, E1B E1c - ont été exprimés différemment dans une variété de tissus humains. Deux variantes supplémentaires premier exon ont été découverts dans une recherche BLAST de la base de données EST humaine en utilisant le second exon de BCRP ^13. Quatre résultats ont révélé un premier exon> 70 kb en amont de l'exon 2 qui ont été désignés E1U; quatre autres matches ont révélé BCRP ARNm qui manquait un premier exon entièrement, qui ont été désignés E1- ^13. La présence d'exons alternatifs leader est considéré comme une manifestation de l' utilisation du promoteur alternatif ^14.

Chez la souris, quatre autres premiers exons de BCRP1 sont décrits qui peuvent correspondre à des promoteurs alternatifs qui régissent Bcrp 1 transcription dans les tissus de souris différentes; Ces promoteurs / exons sont désignés E1U E1A, E1B et E1C et sont situés à environ 70, 58, 15 et 5 kb en amont de l' exon 2 BCRP1 ^{5, 15.} L'isoforme E1A de l'ARNm a été jugée prédominante dans Murine des cellules souches hématopoïétiques, le cœur, le poumon, la rate et le cerveau, tandis que l'isoforme E1B a été exprimé dans l' intestin de souris, des cellules hépatiques foetales et des cellules précurseurs érythroïdes dans la moelle osseuse ^{5, 15.} Le promoteur en amont de E1B a été démontré que le promoteur majeur alternatif régissant BCRP1 la transcription dans l'intestin de la souris, régulée au moins en partie, par phospho-AMP cyclique protéine élément de réponse de liaison (p-CREB) et un élément de réponse à CREB unique à cette variante BCRP1 promoteur ^16. L'isoforme E1C ARNm est exprimé de manière prédominante dans le foie et le rein de souris adulte ^5. L'isoforme E1U est indétectable dans la plupart des tissus testés à l' exception des testicules de souris, où il est l'isoforme dominante exprimée ^5. BCRP1 exprimé dans les testicules de rat se trouve dans les deux (jonctions endothéliales serrées, les cellules myoïdes péritubulaires, et les cellules de Sertoli) somatiques et les cellules germinales (dans l'endothélium séminifère, où il peut protéger spermatides stade avancé ^4). Le regd' ions en amont de E1U contient un élément de réponse fonctionnelle pour stéroïdogénique factor-1 (SF-1) ^5. BCRP1 ARNm et la protéine sont nettement réduits dans les testicules de SF-1 souris knockout spécifiques des cellules de Sertoli, suggérant que l' expression BCRP1 dans les cellules de Sertoli murines est contrôlé par SF-1 ^5.

Les protocoles présentés détail les méthodes pour détecter d' autres premiers exons de BCRP1 in silico, et d'établir des dosages de rapporteur à base de luciférase pour les promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.

Protocole

1. In Silico Prediction of Alternative premiers exons de BCRP1 Utilisation de l' analyse BLAST de la base de données de souris EST

Remarque: Ce protocole décrit comment rechercher l'étiquette de séquence exprimée de la souris (HNE) base de données pour écotechnologies avec similarité de séquence exon 2 de BCRP1 (qui contient le site d'initiation de traduction), puis comment aligner les correspondants séquences EST à des séquences génomiques pour vérifier leur BCRP1 emplacement dans le gène de la souris par rapport à l'extrémité 5 'de l'exon 2 BCRP1.

1. Obtenir la séquence pour BCRP1 de la souris exon 2 en entrant la séquence de référence ID ARNm (NM_011920.3) dans la fenêtre de recherche du navigateur Ensembl Genome ^17, cliquez sur "GO". Dans l'écran suivant, sélectionnez une séquence pleine longueur (contient 16 exons):
   1. Dans l'écran suivant ( "Affichage à base Transcription-"), sélectionnez "16 exons." Cela permet d'afficher un écran contenant la séquence de tous les exons de BCRP1. Exon 2 de BCRP1 va lire "59; ... -AAAGGC TATCAA-3 ' "Les résultats obtenus seront similaires à celles montrées dans la référence ^18..
   2. Cliquez sur l'option "Téléchargement de séquence". Dans l'écran suivant, sélectionnez le format FASTA, puis cliquez sur "Aperçu". Dans l'écran suivant, copier la séquence Aperçu de l'exon 2 dans le presse-papiers.
2. Accédez à la page d' accueil de BLAST ¹⁹ sur le National Center for Biotechnology Information (NCBI) site web ^20.
   1. Sélectionnez génome "Souris". Coller la séquence du presse-papiers dans la boîte de requête exon 2.
   2. Sélectionnez "écotechnologies" dans le menu déroulant de base de données, optimiser pour "séquences très similaires", puis choisissez "BLAST". Durée prendra quelques minutes. Lorsque la course BLAST est terminée, la page "Résultats" apparaît.
   3. Sous la rubrique "Description" de la page "Résultats", sélectionnez "ALL", puis "Télécharger", puis "FASTA (completséquence) "dans le menu déroulant, puis choisissez" Continuer "Un fichier .txt apparaît;. ouverte et copiez l'intégralité du fichier dans le presse-papiers Le fichier .txt contient les séquences de tous les écotechnologies avec similarité de séquence élevée avec le exon2 de BCRP1 de la souris. mais pas leur position par rapport à l'exon 2 du gène BCRP1.
      Note: Une analyse effectuée le 15 Avril, ici 2015 et 14 écotechnologies murines qui aligné avec BCRP1 exon 2. Ceux - ci sont énumérés dans le tableau 1.
3. Identifier l'emplacement de la séquence EST qui est en 5 'de l'exon 2 du gène BCRP1. Le gène de souris BCRP1 est situé dans le contig NC_000072.6 chromosome 6 (GI: 372099104).
   1. Sur la page d'accueil de BLAST sous le "souffle spécialisés" sous-position, sélectionnez "Aligner deux (ou plus) des séquences en utilisant BLAST (bl2seq)."
   2. Collez le fichier texte à partir du presse-papiers dans la boîte de requête et entrez 372099104 dans la boîte de séquence sujet. Optimiser pour "séquences hautement similaires" sous programmesélection, et BLAST exécuter.
   3. Une fois la fenêtre de résultats apparaît, voir les alignements graphiquement en cliquant sur "Graphics" dans la fenêtre "Alignements". Utilisez les flèches droite et gauche et de zoom pour se concentrer sur BCRP1 / ABCG2 et les alignements de séquences.
   4. Enregistrer les alignements de séquences: sélectionnez "ALL" dans la boîte "Descriptions", puis sous la rubrique "téléchargement" déroulant, sélectionnez "Hit table (CSV)," puis cliquez sur "continuer". Ce fichier contient l'alignement des séquences de l'exon 2 BCRP1 et l'alignement de toutes les séquences d'EST avec une similarité de séquence BCRP1 exon2 par rapport à la numérotation des nucléotides dans le chromosome de la souris 6 contig. Chaque séquence complète EST peut générer de multiples alignements des régions 5 'et 3' étendant à l'exon 2, incluant les séquences qui se chevauchent avec BCRP1 exon 2.
   5. Que la position de l'extrémité 5 'de l'exon 2 correspond au nucleotide 58655638 dans le chromosome contig 6, désigner ce que+1, Puis calculer la position des séquences partielles de chaque EST 5 'à 58.655.638. Les résultats pour les 14 ESTs sont donnés dans le tableau 1.
      Remarque: Veillez à analyser les séquences EST qui sont 5 'à +1 (ie, une valeur de nucléotides négatifs) potentiels premiers exons. Par exemple, dans deux des ESTs qui alignées avec BCRP1 exon 2 montré dans le tableau 1 (AI647825 et AI664571) la séquence restante était de 3 'à l' exon 2.

2. Évaluation de BCRP1 Alternative Promoteur Fonction

1. Conception de produits de construction rapporteurs pour BCRP1 E1U, E1A, E1B et promoteurs de E1C
   1. En utilisant la séquence de E1U obtenue à partir de la recherche de la base de données EST, désigner le premier 5 'nucléotides de E1U comme +1.
   2. Obtenir un chromosome bactérien artificiel (BAC), le clone du chromosome 6 de la souris qui contient la séquence du gène BCRP1 / ABCG2 et la séquence d'au moins 100 kb en amont duBCRP1 / gène ABCG2 (voir la liste des matériaux et équipements).
      1. Identifier un vecteur rapporteur approprié tel que le plasmide rapporteur luciférase pGL3-Basic.
      2. Déterminer les sites de clonage multiple dans le vecteur rapporteur. Kpnl, Sacl, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, BglII et HindlII sont les sites d'endonucléase de restriction dans le site de clonage multiple du vecteur pGL3-Basic, dans le sens 5 'à 3'.
         Remarque: La séquence des sites de digestion est disponible à partir de catalogues de produits des entreprises qui produisent les enzymes de restriction.
      3. Identifier tous les sites de digestion dans l'exon E1U et la région 2 kb 5 'de E1U utilisant des logiciels tels que DNA5. Identifier au moins deux sites de digestion dans le site de clonage multiple pGL3-Basic qui ne se trouvent pas dans E1U ou 2 kb région en amont.
         Remarque: Assurez-vous de choisir un site de clonage site de restriction multiple pour l'amorce sens qui est en amont de celle choisie pour l'amorce inverse pour assurer que le wil d'insertionl être dans le bon sens.
   3. Préparer avant et arrière amorces pour la PCR qui contiennent des séquences pour les sites multiples de restriction du site de clonage endonucléase pGL3-base sélectionnés à l'aide des services commerciaux de synthèse génique / amorce ou logiciel de sélection primaire (voir la liste des matériaux et équipements). Sélectionner une amorce sens située ~ 2 kb en amont de la séquence E1U et une amorce antisens dans la séquence E1U. Les amorces utilisées dans les auteurs de travaux antérieurs incorporé un site Sacl dans l'amorce sens et un site Nhel dans l'amorce inverse et amplifié la région génomique d'environ -1906 à 64 de la première 5 nucleotide de E1U spécifiée + 1 (voir étape 2.1.1 ci - dessus), et sont fournis en référence ^16.
      1. Amplifier par PCR la région génomique E1U en utilisant ces amorces, 0,01 à 1 pg du BAC et PCR master mix contenant polymérases Taq haute fidélité (voir la liste des matériaux et équipements) avec dénaturant à95 ° C pendant 30 secondes, puis 35 à 40 cycles de PCR avec extension à 72 ° C (2 min) et de recuit et des températures de fusion en fonction des caractéristiques de fusion des amorces utilisées.
         Note: L'utilisation de haute fidélité polymérases Taq est essentiel pour les régions du promoteur de séquençage qui ont une teneur élevée en GC. Lors de l'utilisation de grands fragments d'ADN génomique, tels que le taux d'alcoolémie en tant que matrice, la structure secondaire de l'ADN génomique peut être difficile pour des amorces de PCR pour lier. Si ce problème se pose, les résultats de la PCR meilleurs peuvent être obtenus si la longue matrice d'ADN génomique est cisaillé par sonication doucement avant la réaction PCR.
      2. Vérifier la longueur du produit amplifié par PCR en le comparant à une échelle d'ADN de 1 kb en utilisant 0,8% de TAE électrophorèse sur gel d'agarose.
   4. Digérer le produit de PCR obtenu et le vecteur pGL3-Basic, en utilisant les endonucléases de restriction spécifiques pour les sites de digestion de restriction introduits dans les amorces sens et antisens selon instructions fournies avec les enzymes de restriction de digestion.
      1. Purifier les réactions de digestion à l' aide de gel de SV commercial et kit PCR Clean-Up Systems (voir la liste des matériaux et équipements), suivant le protocole du kit ^21.
         1. Vérifier la digestion et la linéarisation du vecteur en le comparant contre le vecteur uncut par électrophorèse sur gel d'agarose, puis couper et purifier la bande d'ADN de vecteur digéré. Mesurer la concentration du produit de PCR purifié et le vecteur purifié par spectrométrie UV (voir la liste des matériaux et équipements).
   5. Préparer la construction rapporteur E1U en ligaturant le purifiée, l'enzyme de restriction digéré produit de PCR et luciole vecteur rapporteur luciférase pGL3-Basic (contenu dans le kit de dosage de rapporteur; voir la liste des matériaux et de l'équipement) à insérer: ratios de vecteur de 11, 21 et 31, en utilisant l ' «ADN ligase kit de ligature rapide de T4" selon les instructions du kit ^22, produisant ainsi le E1U reporter construction, nommé pGL3-E1U.
      1. Utilisez le plasmide pGL3-E1U pour transformer des bactéries pour développer clonale pGL3-E1U instructions suivantes dans le kit de clonage TA (voir la liste des matériaux et équipements).
      2. Confirmer l'orientation et la fidélité de l'insert par analyse de séquence.
   6. Préparer journaliste construit pour E1A, E1B et E1C en utilisant une méthodologie similaire pour E1U. Confirmer la fidélité des inserts par séquençage de l'article 2.1.5.2.
      Nota: Les inserts de promoteurs pour E1A, E1B et E1C doit être d'environ -1875 / + 10 -1847 / + 60 et -1904 / + 83 par rapport à la première 5 nucleotide (désigné par 1) de E1A, E1B ou E1C, respectivement.
2. Méthodes de dosage de rapporteur
   Remarque: La stratégie générale des dosages de rapporteur: le promoteur putatif (5 'en amont de la région) d'un gène est inséré dans le site de clonage multiple d'un "reporter" vecteur vide qui contient un "reportegène r "(par exemple la luciférase de luciole) en aval du site de clonage multiple. Le vecteur est ensuite transfecté dans des cellules eucaryotes qui expriment le gène d'intérêt. Les facteurs agissant en trans qui favorisent l' expression du gène d'intérêt dans ces cellules doivent activer le promoteur dans le vecteur rapporteur transfectées, ce qui provoque l'expression de la luciférase de luciole, qui peut être aisément quantifié par un dosage par luminescence.
   1. Sélectionnez la ligne cellulaire appropriée à utiliser pour le dosage de rapporteur.
      Remarque: Pour évaluer l'activité du promoteur alternatif E1U construction rapporteur, il est nécessaire de transfecter cette construction dans des cellules qui expriment BCRP1 sous le contrôle du promoteur E1U. La lignée cellulaire de Sertoli murin TM4 (voir la liste des matériaux et de l' équipement) exprime la protéine BCRP1 et BCRP1 ARNm contenant E1U, ainsi que E1A, E1B et E1C ^5. Comme témoin négatif, pensez à utiliser une lignée cellulaire qui n'exprime pas la protéine BCRP1 ou de l'ARNm.
   2. Culture du CE TM4IIs dans des plaques à 24 puits à une densité initiale de 200.000 cellules / puits dans un mélange 1: 1 de milieu F12 de Ham et de Eagle modifié du milieu de Dulbecco avec 1,2 g / L de bicarbonate de sodium, 15 mM de HEPES complété avec du sérum de cheval à 5%, 2,5% sérum fœtal bovin, de la pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 pg / ml) à 37 ° C, 5% de CO _2, comme décrit précédemment ^5.
   3. Six heures après avoir placé les cellules en culture, la transfection des cellules avec 0,2 pg du vecteur pGL3-basic vide ou avec 0,2 pg du vecteur pGL3 contenant les -1906 / + 64 E1U ou -1875 / + 10 E1A ou -1847 / + 60 E1B ou -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 délétion construire avec 4 ng de la pRL-TK (un vecteur de luciférase exprimant Renilla) en tant que contrôle interne, en utilisant un kit ADN de transfection commerciale et le protocole du fabricant ²³ (voir la liste des matériaux et équipements) .
   4. 30 h de transfection, retirez le support de croissance de la cultured cellules transfectées. Laver les cellules une fois avec 200 pi de PBS, puis retirer la solution de lavage.
      1. Mesurer la luciole et l' activité luciférase de Renilla en utilisant un kit commercial selon les ²⁴ protocoles du fabricant.
   5. Exprimer l'activité pour chaque tube comme le rapport de l'activité de la luciférase de luciole , divisé par le (luciférase de Renilla) de contrôle interne; les résultats globaux sont habituellement exprimés sous forme de l'activité de chaque construction de rapporteur par rapport à celle des cellules transfectées avec le vecteur pGL3 de base vide, qui est donné une valeur de 1.

Résultats

Identification de Bcrp 1 variante promoteur utilisation dans les testicules de souris par l' analyse des exons leader

Lorsque la base de données EST au NCBI a été sondé (Avril 2015) en utilisant les étapes décrites dans le protocole 1, les écotechnologies trouvé qui étaient contiguës à l' extrémité 5 'de l' exon 2 ...

Discussion

La majorité des méthodes et des résultats représentatifs présentés sont décrits dans les travaux antérieurs intitulé "B CRP1 transcription dans les testicules de souris est contrôlée par un promoteur en amont d'un premier roman exon (E1U) régulé par stéroïdogénique factor-1," qui a été publié en 2013 ⁵ . En plus des résultats représentatifs décrits ici, le document précédent a fourni des estimations de remplacement première utilisation de l'exon en utilisant...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kit	Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies	AM1700	5'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kit	Life Technologies	K450001	This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kit	New England Biolabs	M2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase	Sigma-Aldrich/Roche	3553400001/RMB-4738284001	Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagent	Roche	6366236001
Dual-luciferase reporter assay kit	Promega	E1910	Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprep	Qiagen	27104	For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vector	part of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vector	Promega	E1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vector	Promega	E2241
Bacterial artificial chromosome	BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA	RP23-285A12 and RP24-314E24	http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol	Life Technologies	15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281	Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALS	Denville Scientific	V9012
SOFTWARE:
Ensembl software	Ensembl project	http://Ensembl.org	The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast software	NCBI	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software	Simgene	http://simgene.com/Primer3	Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database	NCBI	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cells	ATCC, Manassas, Virginia	CRL-1715™
INSTRUMENTS:
Luminometer	Turner Biosystems	TD-20/20	This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometers	Thermo Scientific, Inc.	NanoDrop 2000	Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software	BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA	DU 800