Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1

Resumo

Com o transportador ABC de murino Bcrp1 (ABCG2) como um exemplo, in silico protocolos são apresentados para detectar alternativos de utilização do promotor nos genes expressos em tecidos de ratinho, e para avaliar a funcionalidade dos promotores alternativos identificados utilizando ensaios de repórter.

Resumo

a expressão do gene em diferentes tecidos é frequentemente controlada por promotores alternativos que resultam na síntese de ARNm com exclusivos - normalmente não traduzidas - primeiros exões. Bcrp1 (ABCG2), o ortólogo de murídeo da mama ABC transporter Resistência cancro Proteína (BCRP, ABCG2), tem pelo menos quatro promotores alternativos que são designadas pelos quatro primeiros exões alternativos correspondentes produzidos: E1U, E1A, E1B, E1C e. Nisto, in silico protocolos são apresentados para predizer o uso alternativo promotor para Bcrp1. Além disso, os métodos de ensaio de repórter são descritos para produzir construções repórter para promotores alternativos e para determinar a funcionalidade de promotores putativos a montante do primeiro exões alternativos que são identificados.

Introdução

Mais de metade dos genes humanos são regulados por promotores alternativos ^1. Cada promotor alternativa pode conter elementos reguladores que podem ser diferentes das de outros promotores alternativos. O promotor (es) utilizado num tecido podem ser diferentes daquelas usadas num outro tecido. Por exemplo, é possível que a activação de uma determinada via de sinalização pode desencadear o promotor alternativo para um gene utilizado em um tecido, mas não têm efeito sobre ou reprimir um promotor separado alternativa para o mesmo gene que é utilizado noutro tecido.

A expressão do gene é regulada pelo Bcrp1 promotores alternativos. Bcrp1 é o ortólogo de murídeo do gene humano da mama cancro da Resistência Proteína (BCRP). BCRP é um transportador de cassete de ligação a ATP (ABC), ABCG2 ^{2, 3} designado formalmente. Como uma proteína da membrana plasmática apical, funções / Bcrp1 BCRP efluxo de uma grande variedade de substratos naturais e xenobióticos ^{3, 4. Em humanos e ratos, BCRP / Bcrp1 é altamente expresso em órgãos farmacologicamente relevantes, tais como o fígado (canalículos biliares), intestino e rins, bem como órgãos com barreiras sangue-tecido, como placenta, cérebro e testículos 2, 5 - 12. Expressão da BCRP / Bcrp1 em hematopoiético e outras células estaminais, incluindo cancro de células estaminais, pode conferir resistência dessas células a xenobióticos e fármacos quimioterapêuticos de cancro 3.}

Em trabalho inicial de compreender a regulação da expressão BCRP em células normais e neoplásicas, 5 'amplificação rápida de extremidades de ADNc (5'-RACE) análise de ARNm BCRP foi realizado para determinar o seu local de início da transcrição exacta ^13. Não só foram vários locais de início da transcrição encontrados; Também foram encontradas três formas alternativas do primeiro exão, o qual é em BCRP não traduzida. Estes primeiros exons alternativos - designadas E1a, E1b, E1C - foram expressos de forma diferente em uma variedade de tecidos humanos. Duas primeiras variantes de exão adicionais foram descobertos em uma pesquisa BLAST da base de dados EST humana usando o segundo exão do BCRP ^13. Quatro partidas revelou um primeiro exão> 70 kb a montante do exão 2, que foram designados E1u; outras quatro partidas revelou mRNA BCRP que faltava um primeiro exão inteiramente, que foram designados E1 ^13. A presença de exões alternativos líder é considerado ser uma manifestação da utilização promotor alternativa ^14.

Em ratinhos, quatro primeiros exões alternativos de Bcrp1 são descritos que podem corresponder aos promotores alternativos que governam a transcrição Bcrp 1 em diferentes tecidos de ratinho; estes exons / promotores são designados E1U, E1A, E1B e E1C, e estão localizados cerca de 70, 58, 15 e 5 kb a montante de Bcrp1 exão 2 ^{5, 15.} A isoforma de ARNm de E1A foi encontrado para ser predominante em Murine células-tronco hematopoiéticas, coração, pulmão, baço e cérebro, ao passo que a isoforma E1B foi expressa no intestino do rato, células de fígado fetal, e as células precursoras eritróides na medula óssea de ^{5, 15.} O promotor a montante de E1B foi demonstrado que é o principal promotor alternativo que rege Bcrp1 transcrição no intestino do rato, regulada, pelo menos em parte, por fosfo-AMP-cíclico proteína elemento de resposta de ligação (p-CREB) e um elemento de resposta de CREB única para esse alternativa promotor Bcrp1 ^16. A isoforma ARNm E1C é predominantemente expresso no fígado de murino adulto e o rim ^5. A isoforma E1U não é detectável na maioria dos tecidos testados excepto para testículo de murino, em que é a isoforma predominante expressa ^5. Bcrp1 expressa em testículos de ratos é encontrado em ambos os somáticas (junções endoteliais apertadas, células mióides peritubulares e células de Sertoli) e células germinativas (no endotélio seminífero, onde ele pode proteger em estágio final spermatids ^4). a rega montante do ião E1U contém um elemento de resposta funcional para esteroidogênica factor-1 (SF-1) ^5. Bcrp1 ARNm e proteína são marcadamente reduzida nos testículos dos ratinhos knockout de Sertoli específicos de células SF-1, sugerindo que a expressão em células de Sertoli Bcrp1 murino é controlado por SF-1 ^5.

Os protocolos apresentados métodos para detectar detalhe primeiros exões alternativos de Bcrp1 in silico, e para estabelecer ensaios de repórter de luciferase baseados em promotores putativos para a montante dos primeiros exões alternativos identificados.

Protocolo

1. predição in silico da alternativa de primeira exons do Bcrp1 Utilizando Análise BLAST of Mouse EST Banco de Dados

Nota: Este protocolo descreve como procurar a tag rato sequência expressa (EST) do banco de dados de ESTs com similaridade de sequência com o exão 2 de Bcrp1 (que contém o local de início da tradução) e, em seguida, como alinhar as sequências EST correspondentes a sequências genômicas para determinar a sua Localização no gene relativa Bcrp1 rato com a extremidade 5 'do exão 2 Bcrp1.

1. Obter a sequência de rato Bcrp1 exão 2 introduzindo o mRNA ID sequência de referência (NM_011920.3) na janela de busca do navegador Ensembl Genome ^17, clique em "Go". Na próxima tela, selecione uma sequência de comprimento completo (contém 16 exons):
   1. Na próxima tela ( "Display à base de transcrição"), selecione "16 exons." Isto irá exibir uma tela que contém a sequência de todos os exons de Bcrp1. Exon 2 de Bcrp1 vai ler "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "Os resultados obtidos serão semelhantes aos mostrados na referência ^18..
   2. Clique na opção "sequência Baixar". Na tela seguinte, escolha o formato FASTA, em seguida, clique em "Preview". Na próxima tela, copie a sequência do exão 2 Pré-Visualização na área de transferência.
2. Navegue até a página inicial BLAST ¹⁹ no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) website ^20.
   1. Selecione genoma "Mouse". Cole a sequência de exão 2 da área de transferência na caixa de consulta.
   2. Selecione "ESTs" no menu suspenso banco de dados, otimizar para "sequências altamente semelhantes", e em seguida, escolha "BLAST". tempo de execução vai demorar alguns minutos. Quando o BLAST run for concluída, a página de "Resultados" irá aparecer.
   3. Sob o subtítulo "Descrições" da página "Resultados", selecione "ALL", então "Download", depois "FASTA (completosequência) "na lista suspensa, e depois escolher" Continuar "Um arquivo .txt irá aparecer;. aberta e copie o arquivo inteiro na área de transferência O ficheiro .txt contém as sequências de todos os ESTs com alta similaridade de sequência com o exon2 rato Bcrp1. mas não a sua posição em relação ao exão 2 no gene Bcrp1.
      Nota: Uma análise realizada em 15 de abril de 2015 identificou 14 ESTs murino que alinhado com Bcrp1 exão 2. Estes são listados na Tabela 1.
3. Identificar a localização da sequência de EST que é 5 'ao exão 2 no gene Bcrp1. O gene de rato está localizado Bcrp1 na NC_000072.6 contig cromossoma 6 (GI: 372099104).
   1. Na página inicial BLAST sob o subtítulo "Explosão Specialized", selecione "Alinhar dois (ou mais) sequências utilizando BLAST (bl2seq)."
   2. Cole o arquivo de texto da área de transferência na caixa de consulta e digite 372099104 na caixa de sequência assunto. Otimizar para "sequências altamente semelhantes" no âmbito do programaseleção e BLAST executado.
   3. Uma vez que a janela de resultados aparece, ver os alinhamentos graficamente clicando em "Graphics" na janela "alinhamentos". Use as setas direita e esquerda e zoom para focar Bcrp1 / ABCG2 e os alinhamentos de sequência.
   4. Salvar os alinhamentos de sequências: selecione "ALL" na caixa "Descrição", então sob o menu suspenso "download", selecione "Hit mesa (CSV)" e, em seguida, clique em "continuar". Este ficheiro contém o alinhamento da sequência de Bcrp1 exão 2 e o alinhamento de todas as sequências de EST com similaridade de sequência com Bcrp1 exon2 relativos à numeração dos nucleótidos na sequência contígua rato cromossoma 6. Cada sequência EST completa pode gerar múltiplos alinhamentos de regiões 5 'e 3' que abrangem ao exão 2, que inclui as sequências que se sobrepõem com Bcrp1 exão 2.
   5. À medida que a posição da extremidade 5 'do exão 2 corresponderá ao nucleótido 58655638 no contig cromossoma 6, designar este como1, e, em seguida, calcular a posição das sequências parciais de cada EST 5 'a 58.655.638. Os resultados para os 14 ESTs são dadas na Tabela 1.
      Nota: Tenha cuidado para analisar sequências de EST que são 5 'para +1 (ou seja, ter um valor de nucleotídeos negativo) como potenciais primeiros exons. Por exemplo, em duas das ESTs alinhadas com que Bcrp1 exão 2 mostrados na Tabela 1 (AI647825 e AI664571) a sequência restante era 3 'ao exão 2.

Função 2. Avaliação da Bcrp1 Alternativa Promoter

1. Projeto de repórter constrói para Bcrp1 E1U, E1A, E1B e promotores E1C
   1. Usando a sequência de E1U obtido a partir de pesquisar a base EST, designar o primeiro nucleótido de 5 E1U como um.
   2. Obter um cromossomo artificial bacteriano (BAC) clone do cromossoma do rato 6 que contém a sequência do gene Bcrp1 / ABCG2 e a sequência de pelo menos 100 kb a montante doBcrp1 / gene ABCG2 (veja Lista de Materiais e Equipamentos).
      1. Identificar um vector repórter adequado, tal como a luciferase do plasmídeo repórter pGL3-Basic.
      2. Determinar os múltiplos locais de clonagem no vector repórter. Kpnl, Saci, Mlu1, NheI, Smal, Xhol, BglII e HindIII são os sítios de endonucleases de restrição no local de clonagem múltipla do vector pGL3-Basic, na direcção 5 'para 3'.
         Nota: A sequência dos locais de digestão está disponível a partir de catálogos de produtos de empresas que produzem as enzimas de restrição.
      3. Identificar todos os sítios de digestão do exão E1U e região 2 kb 5 'do E1U usando programas de software, tais como DNA5. Identificar, pelo menos, dois sítios de digestão no local de clonagem múltipla pGL3-Basic que não são encontrados em E1U ou 2 kb a montante da região.
         Nota: certifique-se de escolher um local de restrição local de clonagem múltiplo para o iniciador directo que está a montante do escolhido para o iniciador inverso para garantir que o inserto Will estar na orientação apropriada.
   3. Prepare para a frente e primers para PCR que contenham sequências para os sites múltiplos endonuclease local de clonagem de restrição pGL3-basic selecionados usando os serviços de síntese de gene / primer comerciais ou software de seleção de primer (veja Lista de Materiais e Equipamentos) reversa. Seleccionar um iniciador para a frente localizado ~ 2 kb a montante da sequência E1U e um iniciador inverso dentro da sequência E1U. Os iniciadores utilizados nas autores trabalho anterior incorporou um local de Saci no iniciador para a frente, e um local de Nhel no primer reverso, e amplificado da região genómica de aproximadamente -1.906-64 com o primeiro 5 'de nucleótidos de E1U como especificado + 1 (ver o passo 2.1.1, supra), e são fornecidos na referência ^16.
      1. PCR amplificar a região genómica E1U utilizando estes iniciadores, 0,01 a 1 pg do BAC, e PCR master mix contendo polimerases Taq de alta fidelidade (ver lista de materiais e equipamentos), com desnaturação a95 ° C durante 30 seg, depois 35 a 40 ciclos de PCR, com extensão a 72 ° C (2 min), e de recozimento e temperaturas de fusão, com base nas características de fusão dos iniciadores utilizados.
         Nota: A utilização de polimerases Taq de alta fidelidade é essencial para regiões promotoras sequenciamento que têm alto teor de GC. Ao utilizar grandes fragmentos de DNA genómico, como um BAC como molde, a estrutura secundária do ADN genómico pode tornar-se difícil para os iniciadores de PCR para se ligarem. Se este problema surge, os melhores resultados de PCR podem ser obtidos se o tempo molde de ADN genómico é cortado suavemente por ultra-sons antes da reacção de PCR.
      2. Verificar o comprimento do produto de PCR amplificado por comparação contra uma escada de DNA de 1 kb utilizando 0,8% de agarose TAE de electroforese em gel.
   4. Digerir o produto de PCR obtido e o vector pGL3-Basic, utilizando as endonucleases de restrição específicas para os locais de digestão de restrição introduzidos na iniciadores directos e inversos de acordo com instruções fornecidas com as enzimas da digestão de restrição.
      1. Purificar as reacções de digestão usando gel SV comercial e kit PCR Clean-Up Sistemas (veja Lista de Materiais e Equipamentos), seguindo o protocolo do kit ^21.
         1. Verifique a digestão e linearização do vector, comparando-a contra o vector não cortado utilizando electroforese em gel de agarose, depois cortado e purifica-se a banda de ADN do vector digerido. Medir a concentração do produto de PCR purificado e o vector purificado usando espectrometria de UV (ver Lista de Materiais e Equipamento).
   5. Preparar a construção repórter E1U ligando o purificada, enzima de restrição digerida produto de PCR e vaga-lume vector repórter luciferase pGL3-Basic (contido no kit de ensaio de repórter; veja Lista de Materiais e Equipamentos) a inserir: índices vetoriais de 11, 21 e 31, utilizando o "kit de ADN-ligase de T4 de ligação rápida" de acordo com as instruções do kit ^22, produzindo desse modo o r E1Uconstructo eporter, chamado pGL3-E1U.
      1. Use o plasmídeo pGL3-E1U para transformar bactérias para expandir clonalmente seguintes instruções pGL3-E1U no kit de clonagem TA (veja Lista de Materiais e Equipamentos).
      2. Confirmar a orientação e fidelidade da inserção por análise de sequência.
   6. Prepare repórter constrói para E1A, E1B e E1C utilizando uma metodologia semelhante como para E1U. Confirmar a fidelidade das inserções por sequenciação como na secção 2.1.5.2.
      Nota: As inserções de promotor para E1A, E1B e E1C deve ser aproximadamente -1875 / + 10, -1847 / + 60, e -1904 / + 83 relativamente ao primeiro nucleótido 5 (designado como um) de E1A, E1B, ou E1C, respectivamente.
2. Métodos de ensaio de repórter
   Nota: Estratégia geral de ensaios de repórter de: o promotor putativo (região 5 'a montante) de um gene é inserido no local de clonagem múltipla de um vector vazio "repórter" que contém um "reportegene R "(por exemplo, luciferase de pirilampo), a jusante do local de clonagem múltipla. O vector é então transfectado para as células eucarióticas que expressam o gene de interesse. Os factores que actuam em trans que promovem a expressão do gene de interesse nestas células devem activar o promotor no vector repórter transfectadas, fazendo com que a expressão de luciferase do pirilampo, o que pode ser facilmente quantificada com um ensaio de luminescência.
   1. Marque a linha celular apropriada a ser usada para o ensaio de repórter.
      Nota: Para avaliar a actividade da construção do repórter promotor alternativo E1U, é necessário transfectar que construir em células que expressam Bcrp1 sob o controlo do promotor E1U. A linha de células de Sertoli murino TM4 (veja Lista de Materiais e Equipamentos) expressa a proteína Bcrp1 e Bcrp1 mRNA contendo E1U, bem como E1A, E1B e E1C ^5. Como um controlo negativo, considerar o uso de uma linha celular que não expressa a proteína Bcrp1 ou ARNm.
   2. Cultura do ce TM4lls em placas de 24 poços a uma densidade inicial de 200000 células / cavidade em uma mistura 1: 1 de meio F12 de Ham e meio de Eagle modificado por Dulbecco com 1,2 g / L de bicarbonato de sódio, 15 mM de HEPES suplementado com soro de cavalo a 5%, 2,5% soro fetal bovino, penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml), a 37 ° C, 5% de CO _2, como descrito anteriormente ^5.
   3. Seis horas após a colocação das células em cultura, transfectar as células com 0,2 ug de vector vazio pGL3-basic ou com 0,2 ug de vector pGL3 contendo o E1U -1906 / + 64 ou -1875 / + 10 E1A ou -1847 / + 60 E1B ou -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 deleção construir junto com 4 ng da pRL-TK (a Renilla-expressando luciferase vector) como controle interno, utilizando um kit de DNA transfecção comercial e protocolo do fabricante ²³ (ver Lista de Materiais e Equipamentos) .
   4. 30 horas após a transfecção, remova o meio de crescimento da culturEd células transfectadas. Lave as células uma vez com 200 mL de PBS, em seguida, remover a solução de lavagem.
      1. Medir a actividade da luciferase do pirilampo e da Renilla usando um kit comercial de acordo com os protocolos do fabricante ^24.
   5. Expressar a actividade de cada tubo como a razão entre a actividade de luciferase de pirilampo dividido pelo (luciferase da Renilla) de controlo interno; resultados globais são geralmente expressas como a actividade de cada repórter construir em relação à das células transfectadas com o vector básico pGL3 vazio, o que é dado um valor de 1.

Resultados

Identificação de Bcrp utilização promotor 1 alternativo no testículo do rato através da análise de exons líder

Quando o banco de dados de EST no NCBI foi sondada (Abril de 2015) utilizando os passos descritos no Protocolo 1, os ESTs encontrados que foram contígua com a extremidade 5 'do exão 2 no Bcrp 1 ARNm estão apresentados ...

Discussão

A maioria dos métodos e os resultados representativos apresentados encontram-se descritos em trabalhos anteriores, intitulado "B transcrição crp1 no testículo do rato é controlada por um promotor a montante de um novo primeiro exão (E1U) regulado por factor 1 de esteroidogênica", que foi publicada em 2013 ⁵ . para além dos resultados representativos descritos aqui, o trabalho anterior proporcionou estimativas de utilização exão primeira alternativa utilizando 5'-RACE PCR e RT...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kit	Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies	AM1700	5'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kit	Life Technologies	K450001	This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kit	New England Biolabs	M2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase	Sigma-Aldrich/Roche	3553400001/RMB-4738284001	Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagent	Roche	6366236001
Dual-luciferase reporter assay kit	Promega	E1910	Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprep	Qiagen	27104	For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vector	part of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vector	Promega	E1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vector	Promega	E2241
Bacterial artificial chromosome	BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA	RP23-285A12 and RP24-314E24	http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol	Life Technologies	15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281	Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALS	Denville Scientific	V9012
SOFTWARE:
Ensembl software	Ensembl project	http://Ensembl.org	The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast software	NCBI	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software	Simgene	http://simgene.com/Primer3	Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database	NCBI	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cells	ATCC, Manassas, Virginia	CRL-1715™
INSTRUMENTS:
Luminometer	Turner Biosystems	TD-20/20	This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometers	Thermo Scientific, Inc.	NanoDrop 2000	Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software	BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA	DU 800