JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وأظهرت هذه التقنية الكهربية من تسجيل داخل الخلايا وتستخدم لتحديد الحساسيات الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء واحدة في العين مجمع فراشة.

Abstract

تسجيل داخل الخلايا هي تقنية قوية تستخدم لتحديد كيف يمكن لخلية واحدة قد يستجيب لحافز معين. في بحث الرؤية، وقد تم تسجيل داخل الخلايا تاريخيا تقنية شائعة تستخدم لدراسة الحساسيات من خلايا مستقبلة للضوء الفردية للمؤثرات الضوء المختلفة التي لا تزال تستخدم اليوم. ومع ذلك، لا تزال هناك ندرة في منهجية مفصلة في الأدب للباحثين الذين يرغبون في تكرار التجارب تسجيل داخل الخلايا في العين. هنا نقدم الحشرة كنموذج لدراسة علم وظائف الأعضاء العين بشكل عام. وتقع خلايا مستقبلة للضوء الحشرات بالقرب من سطح العين، وبالتالي من السهل الوصول إليها، والعديد من الآليات التي تشارك في الرؤية وحفظها عبر شعب الحيوانات. نحن تصف الإجراء الأساسي في الجسم الحي تسجيل داخل الخلايا من خلايا مستقبلة للضوء في العين من فراشة، وذلك بهدف جعل هذه التقنية في متناول الباحثين لديهم خبرة سابقة قليلا في البريدlectrophysiology. ونحن نقدم المعدات الأساسية اللازمة، وكيفية إعداد فراشة حية للتسجيل، وكيفية إدراج مسرى مكروي الزجاج في خلية واحدة، وأخيرا إجراءات تسجيل نفسها. نحن أيضا شرح التحليل الأساسي للبيانات استجابة أولية لتحديد حساسية الطيفية من أنواع الخلايا الفردية. على الرغم من أن بروتوكول لدينا يركز على تحديد حساسية الطيفية، منبهات أخرى (على سبيل المثال، الضوء المستقطب) والاختلافات في طريقة قابلة للتطبيق لهذا الإعداد.

Introduction

ويلاحظ الخصائص الكهربائية للخلايا مثل الخلايا العصبية عن طريق قياس تدفق الأيونات عبر أغشية الخلايا على أنها تغير في الجهد أو التيار. وقد وضعت مجموعة متنوعة من التقنيات الكهربية لقياس الأحداث الكهربيولوجي في الخلايا. الخلايا العصبية الموجودة في عيون الحيوانات يمكن الوصول إليها والدوائر التي غالبا ما تكون أقل تعقيدا مما كانت عليه في الدماغ، مما يجعل هذه الخلايا مرشحين جيدين للدراسة الكهربية. وتشمل التطبيقات المشتركة للالكهربية في العين تخطيط كهربية الشبكية (أرج) 1،2 ومسرى مكروي تسجيل داخل الخلايا. أرج ينطوي على وضع القطب أو على العين من حيوان، وتطبيق حافز الضوء، وقياس التغير في التيار الكهربائي في شكل مبلغ من ردود جميع الخلايا المجاورة 3-6. إذا كان أحد يهتم تحديدا في وصف الحساسيات الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء الفردية، وغالبا ما أنواع الخلايا متعددة تستجيب في وقت واحد في مختلف جوانب القوة لحافز معين؛ وبالتالي فإنهقد يكون من الصعب تحديد الحساسيات من أنواع معينة من الخلايا من البيانات أرج خاصة إذا كان هناك عدة أنواع مختلفة من خلايا مستقبلة للضوء طيفيا-مماثلة في العين. حل واحد محتمل هو خلق المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة مع مبصرة (أوبسين) الجينات في المصالح التي أعرب عنها في الخلايا غالبية R1-6 في العين ثم أداء ERGs 7. وتشمل العيوب المحتملة لهذه الطريقة لا للانخفاض في التعبير عن البروتين مستقبلة للضوء 8، والإطار الزمني الطويل لتوليد وفحص الحيوانات المعدلة وراثيا. للعيون مع أنواع أقل من المستقبلات الضوئية متميزة طيفيا، يمكن أن تكيف العين مع المرشحات الملونة تساعد في خفض مساهمة بعض أنواع الخلايا إلى أرج، مما يسمح تقدير حساسية الطيفية ماكسيما 9.

تسجيل داخل الخلايا هو أسلوب آخر حيث يخوزق القطب غرامة خلية ويتم تطبيق التحفيز. سجلات القطب فقط أن لحاقاستجابة الخلية idual بحيث تسجيل من وتحليل الخلايا الفردية متعددة يمكن أن تسفر عن حساسيات معينة من أنواع مختلفة من الخلايا من الناحية الفسيولوجية 10-14. على الرغم من أن بروتوكول لدينا يركز على تحليل الحساسية الطيفية، والمبادئ الأساسية من بين الخلايا تسجيل مع أقطاب الحادة للتعديل لتطبيقات أخرى. باستخدام إعداد مختلفة من العينة، على سبيل المثال، وباستخدام أقطاب الكوارتز حادة، يمكن للمرء أن يسجل من أعمق في الفص البصري أو مناطق أخرى في الدماغ، وهذا يتوقف على السؤال المطروح. على سبيل المثال، وأوقات استجابة خلايا مستقبلة للضوء الفردية 15، نشاط الخلايا في البصرية فصوص 16 (الصفيحة، النخاع أو lobula 17)، الدماغ 18 أو غيرها من العقد 19 ويمكن أيضا أن تسجل مع تقنيات مشابهة، أو يمكن الاستعاضة مؤثرات اللون مع الاستقطاب 20 -22 أو الاقتراح محفزات 23،24.

Phototransduction، العملية التي من خلالها الضوءيمتص الطاقة وتحويلها إلى إشارة الكهروكيميائية، هو سمة قديمة المشتركة إلى يوم تقريبا جميع الحاضرين شعب الحيوانات 25. الصباغ البصرية الموجودة في خلايا مستقبلة للضوء، ومسؤولا عن بدء phototransduction البصرية رودوبسين. مصنوعة رودوبسين في جميع الحيوانات تتكون من بروتين أوبسين، وهو عضو في 7 الغشاء G عائلة مستقبلات البروتين يقترن، وحامل اللون يرتبط وهي مشتقة من شبكية العين أو جزيء مشابه 26،27. أوبسين تسلسل الأحماض الأمينية وهيكل حامل اللون يؤثر على امتصاص رودوبسين لأطوال موجية مختلفة من الضوء. عندما يتم امتصاص الفوتون من قبل حامل اللون رودوبسين يصبح تفعيلها، وبدء سلسلة G-البروتين في الخلية الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى فتح قنوات أيون بغشاء 28. وخلافا لمعظم الخلايا العصبية، وخلايا مستقبلة للضوء تخضع التغييرات المحتملة متدرجة التي يمكن قياسها على أنها تغير نسبي في السعة استجابة مع تغيير التحفيز خفيفة. وعادة ما تعطىنوع مبصرة يعبر فقط الجين أوبسين واحد (على الرغم من وجود استثناءات 8،10،29-31). متطورة رؤية الألوان، من النوع الذي يوجد في كثير من الفقاريات والمفصليات، ويتحقق مع العين معقدة من مئات أو آلاف من خلايا مستقبلة للضوء كل تعبير عن واحد أو أكثر من أنواع أحيانا رودوبسين. يتم التقاط المعلومات البصرية من خلال مقارنة الردود على فسيفساء مبصرة عبر معقدة الإشارات العصبية المصب في العين والدماغ، مما يؤدي إلى تصور صورة كاملة مع اللون والحركة.

بعد قياس ردود الخام من خلية مستقبلة للضوء لأطوال موجية مختلفة من الضوء عبر تسجيل داخل الخلايا، فمن الممكن لحساب حساسيتها الطيفية. ويستند هذا الحساب على مبدأ Univariance، التي تنص على أن استجابة الخلايا المستقبلة للضوء هي تعتمد على عدد من الفوتونات أنها تمتص، ولكن ليس على خصائص معينة من الفوتونات أنها تمتص 32. أي الفوتون الذي absorbed بواسطة رودوبسين من شأنها أن تحفز نفس النوع من الاستجابة. في الممارسة العملية، وهذا يعني أن السعة استجابة الخام الخلية سيزيد إما بسبب زيادة في شدة الضوء (الفوتونات أكثر لاستيعاب)، أو إلى التحول في الطول الموجي نحو حساسية ذروته (احتمال أكبر من رودوبسين استيعاب أن الطول الموجي). علينا الاستفادة من هذا المبدأ في ربط الاستجابات الخلوية في كثافة معروفة ونفس الطول الموجي للردود على أطوال موجية مختلفة وبنفس الشدة ولكن الحساسية النسبية غير معروفة. وغالبا ما يتم تحديد أنواع الخلايا التي الطول الموجي الذي قمم حساسيتها.

هنا نعرض طريقة واحدة لتسجيل داخل الخلايا وتحليل الحساسية الطيفية للخلايا مستقبلة للضوء في العين فراشة، مع التركيز على جعل هذه الطريقة أكثر سهولة للمجتمع العلمي على نطاق أوسع. وعلى الرغم من تسجيل داخل الخلايا لا تزال شائعة في الأدب، ولا سيما فيما يتعلق رؤية الألوان في الحشرات، وقد وجدنا ثار أوصاف المواد والأساليب وعادة ما تكون قصيرة جدا للسماح لاستنساخ هذه التقنية. نقدم هذه الطريقة في شكل شريط فيديو بهدف السماح أسهل النسخ المتماثل. وصفنا هذه التقنية أيضا استخدام المعدات التي يمكن الحصول عليها بسهولة وبأسعار معقولة. نعالج المحاذير الشائعة التي غالبا ما لا يتم الإبلاغ، التي تبطئ البحوث عند تحسين تقنية جديدة ومعقدة.

Protocol

تم علاج جميع الحيوانات كما إنسانية ممكن. شحنت الحشرات والشرانق من كوستاريكا علم الحشرات توريد وكوستاريكا.

1. Heliconius العناية شرانق

  1. تعليق كل الشرانق متباعدة 2-3 سم بعيدا في غرفة ترطيب باستخدام دبابيس الحشرات.
  2. بعد eclosion، تسمح الأجنحة لتجف ثم الحفاظ على الفراشات على قيد الحياة لا يقل عن 1 يوم في غرفة ترطيب وتغذية محلول مخفف العسل يوميا قبل التسجيل.
    1. تمييع العسل مع الماء لنحو حل العسل 20٪ من حيث الحجم، وتصب في طبق بيتري الضحلة.
    2. جلب الفراشات الفردية إلى طبق بيتري، واحدا تلو الآخر. عند لمس الحل مع الجفن الأمامي، والفراشات تمتد تلقائيا proboscides وتشرب من طبق بيتري. إذا لم خرطوم بهم تمتد تلقائيا، واستخدام الملقط لسحب خرطوم من وندخله الى الحل العسل.

2. بصري المسار والمعايرة، وقياس آثافةement التجريبية ظروف الإضاءة

  1. وضع W زينون مصباح 150 قوس مع الإسكان وإمدادات الطاقة العالمية وتعلق المكثف الجمعية عدسة واحدة على نهاية جدول متر واحد على الأقل طويلا لتحقيق الضوء الأبيض الساطع.
    تنبيه: زينون مصابيح القوس تنتج ضوء ساطع للغاية مع شدة الأشعة فوق البنفسجية القوية. نظارات واقية يجب أن ترتديه في جميع الأوقات، ويجب استخدام مصباح وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة لمنع تراكم طبقة الأوزون الناجم عن تفاعل ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع الأكسجين في الغلاف الجوي.
  2. انشاء الضوئية متر مسار واحد في طول لضوء الخروج من الجمعية السكنية لتمرير من خلال (الشكل 1).
    1. مكان بالترتيب التالي على المسار البصري مع المسافات التقريبية عدا: 1) السيليكا محدب أو عدسة الكوارتز 40 سم من التجمع المكثف، 2) محايدة عجلة تصفية الكثافة (مع عدم وجود مرشحات حاليا في مسار الضوء) 22 سم كذلك على طول المسار، 3) مصراع مع وحدة محرك 14 سم من فلتر NDالصورة، 4) السيليكا أو الكوارتز مقعرة عدسة المجاور مباشرة بعد مصراع، و 5) على الموازاة شعاع مسبار 6 سم كذلك على طول نهاية بكثير من المسار.
    2. يلصق 600 ميكرون قطر كابل الألياف البصرية إلى تحقيق الموازاة شعاع.
      ملاحظة: اعتمادا على شدة الضوء، كابل الألياف البصرية قطرها 5-10 ملم قد تكون هناك حاجة لتوفير ما يكفي من الضوء لمحضرات أخرى ويمكن أن تكون بديلا لذلك.
    3. ضبط المسافة والارتفاع وزاوية كل عنصر بصري بحيث شعاع ضوء الخروج من التجمع هو على أعلى كثافة ممكنة.
    4. كما قد تختلف العناصر مسار بصري قليلا مع التطبيقات المختلفة، وضمان أن جميع عناصر تنقل الضوء في الأشعة فوق البنفسجية والمدى المرئي (315-700 نانومتر).
  3. مرة واحدة يتم تجميعها في مسار بصري، وقياس الضوء الذي يمر من خلال الإعداد باستخدام مطياف. معايرة مطياف لأول مرة باستخدام مصباح معايرة مع الطيف المعروفة وبرنامج الشركة المصنعة.
    ملاحظة: وصفنا ما يلي إعدادها باستخدام المنتجات المحيط البصريات وضوح ولكن غيرها من الشركات المصنعة (على سبيل المثال، Avantes) بيع المنتجات المماثلة.
    1. تشغيل مصباح معايرة التنغستن 45 دقيقة على الأقل قبل أخذ القياسات.
    2. لمعايرة، ونعلق مطياف عبر USB إلى جهاز كمبيوتر مع برنامج المرتبطة المثبتة. ثم قم بتوصيل مطياف إلى مصباح معايرة التنغستن عن طريق الإرسال جيب التمام مصحح للأشعة فوق البنفسجية مرئية.
    3. حدد "جديد المطلق الإشعاع القياس" من علامة التبويب "ملف"، وحدد مطياف باسم "المصدر".
    4. اتبع المطالبات لإنشاء معايرة ملف "كال" الجديد. عند المطالبة، تحميل ملف البيانات المنصوص عليها ألوان الطيف المعروفة للمصباح معايرة التنغستن في نطاق الضوء المرئي (300-800 نانومتر) في البرنامج، الذي يحسب تلقائيا الطيف تصحيح من إخراج مطياف.
    5. حفظ ملف المعايرة. تحميل هذا الملف عند initializing البرنامج لجميع القياسات المستقبلية من الطيف الضوئي باستخدام مطياف.
  4. مرة واحدة يتم معايرة مطياف، استخدم هذا لتسجيل الطيف الضوئي من الإعداد التجريبية. الآخرة عند فتح البرنامج، حدد "جديد المطلق الإشعاع القياس" وتحميل ملف معايرة المحفوظة مسبقا. بجانب اتخاذ طائفة الظلام من خلال منع كل ضوء لطيف.
    1. مع مطياف قياس حاليا ظروف الإضاءة التجريبية المطلوبة، وضبط الوقت التكامل (4 مللي ثانية)، والمسح الضوئي للمتوسط ​​(5)، وعرض عربة النقل (5)، لذلك يتم تحجيم بشكل صحيح الطيف وممهدة. الحفاظ على الإعدادات نفسها لجميع القياسات الطيفية، بحيث يمكن مقارنة ذلك شدة الضوء من قياسات مختلفة.
  5. قياس أطياف الضوء الأبيض ملوثا، لجميع مرشحات الكثافة محايدة لاستخدامها خلال التجارب، ولكل مرشح تدخل ممر الموجة (الشكل 2).
    1. مeasure ضوء الطيف الأبيض دون أي مرشحات في مسار الضوء من قبل الالصاق نهاية خالية من كابل الألياف البصرية من الخطوة 2.2.2 لطيف. مع ملف معايرة تحميل من الخطوة 2.3، حفظ طيف الضوء الأبيض باستخدام برنامج مطياف كملف نصي.
      ملاحظة: حفظ الأطياف ك قائمة ملفات نصية الطول الموجي (خ الإحداثيات) في عمود واحد وشدة الضوء (ص الإحداثيات) في العمود الثاني، بحيث يمكن تحميل البيانات إلى جدول للخطوة 2.6.
    2. باستخدام نفس الإعداد كخطوة 2.5.1، تسجيل الطيف من كل الكثافة الضوئية (OD) (0-3،5 OD) المستخدمة أثناء التجارب عن طريق تدوير الكثافة المحايدة (ND) مرشح عجلة في المسار البصري، وحفظ ملف نصي ل كل OD.
    3. باستخدام نفس الإعداد كخطوة 2.5.1، وضع 10 نانومتر نصف التدخل عرض النطاق الترددي مرشحات واحدا تلو الآخر في مسار الضوء وتسجيل الطيف الذي نراه لكل مرشح. كرر هذا الإجراء لكل من 41 مرشح التداخل مختلفة ثمتباعدة transmittances إيث ذروة كل 10 نانومتر 300-700 نانومتر. مرشحات متباعدة تباعدا (20 نانومتر) مقبولة بالنسبة لمعظم التطبيقات (لطيف، انظر الشكل 2).
  6. صحيح الاختلافات في شدة الضوء عندما توضع المرشحات تدخل في مسار الضوء. كل مرشح تدخل يسمح عدد مختلف من الفوتونات لتمرير، ونقل منخفضة من بعض المرشحات يجعل من الصعب على زيادة تخفيف كثافة حتى يتسنى لجميع المرشحات لتمكين أعداد متساوية من الفوتونات.
    1. لحساب الكثافة النسبية (I) لكل 10 نانومتر مرشح تدخل عرض النطاق الترددي، حل لأني في التعبير، وأنا = T / ثانية، حيث T هي المنطقة تحت المنحنى الطيفي لكل مرشح تدخل 10 نانومتر (من 2.5.3) والصورة هي الإشعاع المطلق القصوى (قيمة ص من ملف نصي حفظ من 2.5.1) من الضوء الأبيض في ذروة الموجة من كل مرشح (انظر الشكل 2 للحصول على مثال في 520 نانومتر).
    2. تقسيم كل كثافه تحسبالمنشأ من قيمة كثافة ماكس المحسوبة في 2.6.1 لتطبيع واحد، واتخاذ متبادلة من القيم تطبيع النسبية لاستخدامها كعامل تصحيح تطبيقها على حساسية الخام في كل طول موجي (انظر الخطوة 6.4).
  7. تنفيذ الخطوات 2.1 خلال 2.6 مرة واحدة فقط قبل مجموعة من التجارب. على مدار تجربة تسجيل دوري الإشعاع المطلق للمصباح قوس زينون تحت الضوء الساطع ومرشحات الكثافة محايدة، للتأكد من عدم تغيير شدة الحافز الضوء.
  8. خلال التجربة، إن وجدت استجابة الخلايا للضوء تنتقل عن طريق مرشح التداخل نهج الحد الأقصى لسعة الاستجابة استخدام المرشحات ND للتخفيف من إشارة. إذا تم استخدام المرشحات ND خلال التجربة، يعلل انخفاض مماثل في كثافة خلال حساب الحساسية الطيفية.
  9. إعداد مسار بصري، والمعايرة، والمرشحات أيام أو أسابيع قبل بدء التجارب. إبقاء المرشحاتمغطاة لمنع تراكم الغبار.

الإعداد 3. معدات تسجيل

  1. إطعام نفسه كابل الألياف البصرية المستخدمة في المعايرة من خلال قفص فاراداي وجبل على جهاز goniometric مثل محيط الذراع كاردان (انظر الشكل 3 لرسم بياني). سوف كابل أن يكون حوالي 10 سم بعيدا عن العين من العينة.
  2. ضع مرحلة المعدنية على طاولة منعزلة vibrationally مع حامل القطب شنت مباشرة فوق خشبة المسرح تحت السيطرة على micromanipulator (الشكل 4). وضع الذراع كاردان بحيث رئيس العينة هو في مركز المجال التي أنشأتها الحركة الدورانية للذراع.
  3. باستخدام نظام المضخم داخل الخلايا، والذي يتضمن مكبر للصوت (خارج قفص فاراداي) والمضخم (headstage، بالقرب من الإعدادية داخل قفص فاراداي) تركيب headstage فوق خشبة المسرح المعدنية حيث سيتم وضع العينة.
    1. توصيل الكابلات المحورية إلى headstage عبراتصال BNC. تقسيم مفتوحة سوى غيض على الطرف الآخر من كابل متحد المحور، وفصل غمد المعدن الخارجي للكابل من السلك الداخلي.
    2. لحام غمد الخارجي (حافظ على إمكانات الأرض) إلى نهاية واحدة من الأسلاك النحاسية المعزولة مع مقطع التمساح على الطرف الآخر. وهذا مقطع التمساح نعلق على القطب إشارة معدنية على منصة العينة (الخطوة 5.1.4).
    3. لحام السلك الداخلي من الكابلات المحورية لسلك فضة رقيقة، لتكون بمثابة القطب تسجيل. وينبغي أن يكون هذا السلك رقيقة بما يكفي لإدخالها في الزجاج الكهربائي مليئة حل في الخطوة 5.2.3.
  4. وضع مجهر تشريحي تعلق على ذراع يتأرجح وقاعدة على مقعد خشبي خارج قفص فاراداي، بحيث يمكن أن تتأرجح في خفض الكهربائي في العين، ووقفت إلى الوراء مرة أخرى الكهربائي في العين.
  5. تأكد من كل شيء المعدنية داخل يرتكز قفص فاراداي بشكل صحيح.
  6. خارج قفص فاراداي، إرفاق preamplifإيه للمدخلات من 50-60 هرتز الضوضاء المخفض (اختياري)، وربط مخرجات لقناة واحدة من الذبذبات باستخدام BNC T-محول.
  7. باستخدام الطرف الآخر من T-محول، قم بتوصيل الإشارات التي تمر عبر الذبذبات لقناة واحدة للأجهزة. إرفاق هذا الجهاز إلى جهاز الكمبيوتر عن طريق كابل USB، والتي سوف تسمح الردود المسجلة مع المضخم يمكن ان تقرأ من قبل البرامج على الكمبيوتر.
  8. إرفاق سائق مصراع من المسار البصري للقناة الثانية من الذبذبات باستخدام T-محول آخر، وربط هذا إلى مولد النبض التي من شأنها السيطرة على وتيرة ومدة ومضات ضوء تسليمها للعين (الخطوة 5.5).
    ملاحظة: الإعداد للتلاعب نفسها يجب تحتاج فقط إلى أن يتم ذلك مرة واحدة. كسر هنا حتى على استعداد لبدء التسجيلات.

4. الإعدادية يوم تسجيل

  1. تشغيل مصباح زينون لا يقل عن 45 دقيقة قبل التجربة وتشغيل الزجاج مسرى مكروي مجتذب لا يقل عن 30 دقيقة قبل بولأقطاب الزجاج لينغ.
  2. تشغيل جميع المعدات تسجيل (مصراع الكاميرا، مكبر للصوت، مزيل الضوضاء، مولد النبض، والذبذبات، والحصول على البيانات الأجهزة) وتأكد من إغلاق مصراع افتراضيا حتى لا يمر الضوء من خلال كابل الألياف البصرية.
  3. سحب البورسليكات غرامة (أو ألومينوسيليكات) الميكروية الزجاج (100-250 المقاومة MΩ مثالية) باستخدام مجتذب الزجاج مسرى مكروي. استخدام أقطاب الزجاج داخل سوى ساعة قليلة من يتم سحبها.
  4. الردم الأقطاب مع 3 M البوتاسيوم كلوريد (بوكل). لاحظ أن هذا الحل يمكن تعديلها وفقا لاحتياجات الباحث، مثل صبغ الحقن.

5. عينة الإعدادية وإجراءات تسجيل

  1. إعداد العينات
    1. يلصق على فراشة الفردية داخل أنبوب صغير من البلاستيك مع الشمع الساخن حتى الرأس غير متحرك وجاحظ واحدة من نهاية الأنبوب. الشمع أسفل خرطوم، وهوائيات، وأجنحة (الشكل 5).
    2. اضغط باستمرار رانه البطن بقطعة جافة من الشمع والحفاظ على أنبوب مرطب قبل وضع منديل مبللة داخل الأنبوب وراء البطن. تأكد من أن العينة هي قادرة على الحركة تماما.
    3. تركيب أنبوب باستخدام قطعة صغيرة من الشمع على منصة صغيرة مع كرة مشتركة والمقبس التي يتم تركيبها على قاعدة مغناطيسية.
    4. تشريح تحت المجهر، اضافة الى وجود أسلاك الفضة قطرها 0.125 ملم في الرأس عن طريق فمها لاستخدامها القطب المرجعية. قبل التجربة، إصلاح دائم السلك إلى منصة في مثل هذه الطريقة التي الأسلاك النحاسية في الخطوة 3.3.2 قد مقطع على لمرة واحدة يتم وضع منصة على المسرح للتسجيل.
    5. مرة واحدة في القطب المرجعي هو في وضع مناسب قد يكون الاحتفاظ بها في مكان ذوبان بسرعة ثم التبريد الشمع حول السلك.
    6. باستخدام كسر الكربون الصلب شفرة حلاقة، وقبضة جزء من شفرة مع حامل شفرة وقطع قطعة صغيرة لاستخدامها لقطع القرنية.
    7. قطع ثقب صغير (~ 10 ommatidiوفي القطر) في القرنية اليسار باستخدام razorblade واغلاق فتحة مع الفازلين لمنع جفاف.
  2. مرة واحدة يتم قطع القرنية، إدراج القطب تسجيل في العين بأسرع وقت ممكن لأن الدملمف في العين سوف تتصلب بسرعة ويجعل من المستحيل لإدراج الكهربائي. إذا كان ذلك ممكنا إجراء تشريح في تلاعب فيها تسجيل ستجرى.
    ملاحظة: يجب أن لا يكون لطخت الفازلين على بقية العين لأن ذلك سوف يزيل التباؤر البصريات.
    1. إن لم يكن بالفعل على المسرح، ضع العينة التي شنت ومنصة على خشبة المسرح في تلاعب تسجيل. قم بتوصيل سلك الأرض headstage من الخطوة 3.3.2 إلى القطب إشارة على منصة العينة باستخدام مقاطع التمساح.
      ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا استخدام عامل تصفية الأحمر لإلقاء الضوء على الحيوان.
    2. استخدام مصدر الضوء مع المرفقات معقوفة للضوء لفترة وجيزة العينة تحت المجسام في حين خفض القطب تسجيل في العين.
    3. فيسرت سلك الفضة متصلا headstage من الخطوة 3.3.3 في حل بوكل في الجزء الخلفي من مسرى مكروي الزجاج. تركيب الزجاج الكهربائي على حامل الكهربائي.
    4. ضبط حامل الكهربائي حتى مسرى مكروي مباشرة فوق الحفرة خفض سابقا في القرنية، عن المليمتر فوق القرنية. خفض مسرى مكروي في العين باستخدام micromanipulator حتى اكتمال الدائرة، كما يتضح من تغيير كبير في المحتملة (السيارات) على الذبذبات.
  3. مرة واحدة في العين، والتأرجح المجسام خارج قفص فاراداي، وإيقاف مصدر الضوء إلقاء الضوء على العينة. يجب أن تبقى في غرفة مظلمة حتى تصبح العين الظلام تكييفها.
  4. تحقق المقاومة من القطب عن طريق تطبيق 1 غ الحالية من مكبر للصوت ويلاحظ التغير في التيار الكهربائي. يجب أن تكون المقاومة عادة في نطاق بين 100-250 MΩ. المقاومة أعلى تدل على انسداد أو الانحناء من القطب، ومقاومة منخفضة من إلكترونياتالكسر قصيدة.
  5. تفعيل مولد النبض حتى يفتح مصراع السماح ومضة من الضوء مع 50 ميللي ثانية مدة كل 0.5 ثانية، والسماح لها بمواصلة امض لمدة التجربة.
    1. ضبط مولد النبض لذلك يسمح مضات تصل إلى 50 ميللي ثانية مدتها. هذه المدة وقفة 0.5 ثانية بين ومضات تحافظ على عينة أقرب إلى الظلام تكييفها ممكن خلال التجربة. خمسين ميللي ثانية على مقربة من مدة فلاش أقصر من شأنها أن تثير نفس السعة في استجابة كما مدد فلاش أطول.
    2. ردود إعادة التدبير في بداية ونهاية التجربة (الخطوة 5.16). على مدار نحو تجربة عشرين دقيقة، وهذه إعدادات الفلاش لا تتحلل وردا على مر الزمن. قد تتطلب محضرات مختلفة تعديلات على إعدادات الفلاش هذه.
  6. وضع الذراع كاردان بحيث يتم توجيه كابل الألياف الضوئية باتجاه العين.
  7. تحقق الذبذبات لتغيير الجهد مع كل ومضة ضوء.تغيير سلبي في الجهد يدل على أن القطب لم يدخل بعد خلية.
  8. نقل ذراع كاردان حول العينة حتى يتم وضعه في زاوية العين التي هناك استجابة الجهد القصوى.
  9. تدوير micromanipulator ذهابا وإيابا، مما تسبب في حركات صغيرة جدا العمودي من القطب في كلا الاتجاهين، بينما التنصت بخفة قاعدة حامل الكهربائي أو باستخدام وظيفة الطنين على المضخم. مواصلة إجراء تعديلات صغيرة حتى تظهر استجابة ضوء depolarizing على الذبذبات (الشكل 6).
  10. ضبط ذراع كاردان مرة أخرى للعثور على زاوية السقوط حيث ومضة من الضوء تنتج أكبر إشارة depolarizing. إجراء تعديلات صغيرة مع micromanipulator واستخدام وظيفة الطنين على مكبر للصوت حسب الحاجة للتأكد من أن القطب هو تسجيل ثابت الخلية، وأنه سوف يبقى في الخلية للتجربة كلها (راجع الخطوة 5.11).
  11. وبمجرد أن الإعداد هو مستقر، تبدأ ريكوrding. وينبغي أن يكون تسجيل مستقر قليلا إلى أي تغيير في وضع الراحة، وانخفاض الضوضاء الخلفية، واستجابة depolarizing كبيرة باستمرار (على الأقل 10: إشارة 1 إلى نسبة الضوضاء).
    1. تشغيل البرنامج على جهاز الكمبيوتر، والبدء في "تجربة جديدة"، والتي ستفتح لك نافذة منبثقة مع أربع قنوات.
    2. ضبط مقياس الجهد في الزاوية اليمنى العليا من نافذة البرنامج إلى 500 فولت. فإن القناة الأولى عرض الردود المسجلة من القطب في الوقت الحقيقي، في حين أن القناة الثانية سوف يسجل موجة مربع التي تنتجها المولدات وظيفة، إذا تم تغذية إشارة إلى الأجهزة الحصول على البيانات عن طريق الذبذبات، والتي تبين عندما مصراع مفتوح . القناتين الأخرى غير الضرورية.
    3. انقر على "ابدأ" في أسفل الزاوية اليمنى لبدء التسجيل، والسماح لبرنامج لتشغيل لمدة التجربة. ضبط التكبير من س (الوقت) و y (الجهد) محاور بحيث ردود واضحة.
  12. أولا، مع الضوء الأبيض، وتسجيل ما يصل إلى 10 الاستجابات الفردية مع عجلة تصفية ND بنسبة 3.5 OD (حوالي 5-10 ثانية).
  13. السجل التالي في نفس العدد من الردود على 3.3 OD، ثم 3.1، 3.0، 2.5، 2.3، 2.1، الخ في كل مجموعة حتى 0.0 OD. وهذه سعة ردا على سلسلة فلتر ND توفر منحنى شدة استجابة تسجيل في القسم 6. في حالة حدوث التبييض، واستخدام ومضات أقل من المحفزات مشرق أثناء التجربة.
  14. تسجيل استجابة الخلية لجميع الأطوال الموجية، وذلك باستخدام مرشح التداخل.
    1. العثور على أول ذروة الموجة. بدون فلاتر ND في مسار الضوء (0.0 OD)، وضع فلتر الأشعة فوق البنفسجية الإرسال في مسار الضوء لفترة وجيزة مراقبة السعة استجابة. كرر مع فلتر الأزرق الإرسال، وهو مرشح يحيل الأخضر، ومرشح يحيل الأحمر، والتي يجب أن تعطي فكرة عن المكان الاستجابة الذروة سيكون.
    2. استخدام الفلاتر في حوالي 350، 450، 550، 650 نانومتر للعثور على المنطقة العامة للذروة الحساسية فيخطوة 5.14.1. الطول الموجي المحدد لا يهم في هذه المرحلة البحث الأولية أنه سيتم تسجيل جميع الأطوال الموجية في الخطوة التالية. في حالة وجود تقديرات الحساسيات الذروة، أو أنها قد سجلت سابقا، استخدام معروف الأطوال الموجية للتعرف بسرعة الاستجابة الذروة.
    3. وبمجرد أن استجابة الذروة أو يتم التعرف على مقربة منه، وسجل في هذا الطول الموجي لمدة 10 الردود (حوالي 5 ثانية).
    4. بعد أن سجلت في الطول الموجي للالذروة ردا على ذلك، سجل مع مرشح التداخل أخرى، 300-700 نانومتر في 10 خطوات نانومتر. نبدأ من القمة والخروج تجاه كل من الأطوال الموجية أقصر وأطول عن طريق مبادلة المرشحات الخروج من مسار الضوء واحدا تلو الآخر (على سبيل المثال إذا كان الرد هو ذروة عند 520 نانومتر، والاستجابات سجل في هذه الموجة الأولى، ثم 510 نانومتر، تليها 530 نانومتر و 500 نانومتر، 540 نانومتر و 490 نانومتر و 550 نانومتر، وهلم جرا حتى لا يكون هناك أي رد).
    5. السماح لمدة تصل إلى 10 الردود في فلتر (5 ثانية لكل منهما). عندما مبادلة مرشح التداخل، والسماح للخلية لالتنأندو إلى 1-2 ومضات من الضوء الأبيض بدون أي مرشح في مسار الضوء، وهو أمر مفيد لمراقبة ما إذا كان الرد الذروة يسبب تدهورا مع مرور الوقت. تقليل عدد الردود أو زيادة OD في حالة حدوث التبييض.
  15. وإذا كانت الاستجابة تحت أي مرشح تدخل هي قريبة جدا من الحد الأقصى للاستجابة تحت الضوء الأبيض في 0 OD، ثم تخفف مع مرشحات ND. المرشحات تدخل وحجم كابل الألياف البصرية المستخدمة في هذه التجربة تخفف كثيرا من شدة الضوء وذلك عادة لا تحتاج المرشحات الثانية.
  16. إذا بقي تسجيل مستقرة، إعادة تسجيل موجات في جميع أنحاء استجابة الذروة، والتي هي بمثابة pseudoreplicate لتأكيد سعة استجابة السابقة، ويساعد على ضمان الاستجابة لم تتدهور مع مرور الوقت. مرة واحدة يتم تسجيل جميع الأطوال الموجية، وإعادة السجلات الاستجابات تحت سلسلة ND، كما في الخطوة 5.12.
  17. مرة واحدة تسجيل هو نقرة والكامل "وقف" على البرنامج، وحفظ تسجيل لتحليلها.
  18. بعد تجربة، تضحية الفرد من خلال تجميد أو تبريد لعدة دقائق تليها قطع بسرعة الرأس وسحق الصدر.
  19. إيقاف تشغيل كافة المعدات. كسر هنا إذا لزم الأمر قبل القيام التحليل.

6. الطيفي تحليل الحساسية

  1. مع البرمجيات المستخدمة لتسجيل استجابات الخام، حساب السعة استجابة متوسط ​​من 10 الردود الفردية لكل مرشح في سلسلة ND ولكل مرشح تدخل.
  2. إنشاء كثافة وظيفة استجابة تسجيل (VlogI) من سلسلة فلتر ND المسجلة في خطوات 5،12-5،13 (الشكل 7). القيام بذلك عن طريق التآمر وحدات سجل من شدة (OD) على المحور العاشر، واستجابة لكل شدة على المحور الصادي.
    1. لاستخلاص حساسية الطيفية للخلية عند أطوال موجية مختلفة، تناسب عادة المعادلة ناكا-راشتون إلى البيانات من الخطوة 6.2، واستخدام هذه المعادلة لربط الردود الطيفية التي تم الحصول عليها تجريبيا من موجات مختلفة رس الفوتونات النسبية المطلوبة للحصول هذا الرد في إطار الطول الموجي ثابت (في هذه الحالة الضوء الأبيض).
      ملاحظة: المعادلة ناكا-راشتون هي: V / V الحد الأقصى = أنا ن / (أنا ن + K ن)، حيث I هي شدة التحفيز، والخامس هو السعة ردا على ذلك، V الحد الأقصى هو الحد الأقصى لسعة ردا على ذلك، K هو التحفيز كثافة إعطاء نصف الخامس كحد أقصى، و n هو المنحدر الأسي. طرق مختلفة يمكن استخدامها لتتناسب مع هذه المعادلة إلى البيانات VlogI، بما في ذلك منحنى البرنامج المناسب، أو الحزم الإحصائية القائمة على التعليمات البرمجية.
    2. لتناسب المعادلة ناكا-راشتون باستخدام العمليات الحسابية البسيطة وبرنامج جداول البيانات، وتحويل البيانات استجابة VlogI لكل كثافة التحفيز: تسجيل [(V ماكس / V) - 1]. ثم نفذ الانحدار الخطي على البيانات المحولة للحصول على معادلة خط أفضل مناسبا.
      يجب أن يكون V ماكس أكبر من أي ردود قياسها. ملاحظة: للحفاظ على هذا متناسقة، ويقدر هذا الأسلوب الخامس كحد أقصى من 1٪ GREالعاطر من أعلى استجابة مدروسة.
    3. من معادلة خط الانحدار، وتقدير الأس (ن) عن طريق أخذ الانحدار السلبي، وسجل (K) = التقاطع y / ن.
  3. مرة واحدة المعلمات ل V ماكس، ن، وK تم تقدير، وتحديد العدد النسبي للفوتونات المطلوبة للحصول على الاستجابة الطيفية للخلية في كل طول موجي عن طريق توصيل في الاستجابة الطيفية يقاس عند طول موجي معين كما (V) وحل لI.
  4. مضاعفة كثافة التحفيز حساب (I) من الخطوة 6.3 من معامل التصحيح لكل مرشح تدخل (من الخطوة 2.4.3) في كل الطول الموجي.
  5. للحصول على حساسية، كل شدة يجب أن تكون متصلة V منحنى سجل-I بحيث يمكن مقارنة. القيام بذلك عن طريق المتعلقة بكل شدة الموجة الى نصف الخامس كحد أقصى أو K، المحسوبة في الخطوة 6.2.3.
    1. طرح كل شدة الطول الموجي تصحيح (الخطوة 6.4) من ك.
    2. ثم لكل شدة الطول الموجي، إضافة هذا "المسافة من قيمة K "لK، وضرب من قبل (-1).
    3. بجانب جمع كل نقاط البيانات الإيجابية عن طريق إضافة قيمة مطلقة من أدنى نقطة بيانات في سلسلة لكل طول موجي.
  6. البحث عن حساسية في كل الطول الموجي من خلال اتخاذ متبادلة من كل شدة حساب حديثا من الخطوة 6.5.1. تحويل البيانات بحيث يقع الطيف حساسية بين 0 و 1.
  7. بعد تسجيل من أكثر من خلية واحدة من نفس النوع المتوسط ​​الردود النهائية ومؤامرة مع أشرطة الخطأ القياسية أو فترات الثقة 95٪ (الشكل 8).

النتائج

بالنسبة لكثير من عناصر الإعداد التسجيل، وصفا مكتوبا لا توفر ما يكفي من التفاصيل. الشكل رقم 1 هو التخطيطي من المكونات الداخلة في الإعداد التسجيل الكامل. في الشكل 2، يتم رسم أطياف الضوء الأبيض وكل مرشح التدخل لإعطاء معنى لماذا هناك حاجة إلى معامل ...

Discussion

تسجيل داخل الخلايا يمكن أن تكون تقنية صعبة لإتقان بسبب العديد من الخطوات التقنية المعنية. للتجارب ناجحة يجب أخذها بعين الاعتبار عدة نقاط هامة. أولا، من المهم أن يكون لديك جدول صحيح vibrationally معزولة التي يتم تنفيذ التجربة. استخدام العديد من الباحثين الجداول الهواء التي ...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر الراحل رودي ليمبورغ لافتعال محيط الذراع كاردان، كيمبرلي جاميسون، ماثيو ماك هنري، وراجو Metherate لإقراض لنا المعدات، والمط كيلبر وكينتارو أريكاوا، للتشجيع. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) العليا زمالة أبحاث لKJM ومنحة جبهة الخلاص الوطني IOS-1257627 لبنك التنمية الآسيوي

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Butterfly pupaeSeveral local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinderAny chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite HoneyTrader Joe'sAny honey or sucrose solution will work
Xenon Arc LampOriel Instruments66003Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x)Oriel Instruments11647Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
Six Position Filter Wheel, x2Newport CorporationFW1X6
Filter Wheel Mount HubNewport CorporationFWM
Concave silica lens, 25.4 mmNewport CorporationSPC034
Collimator holderNewport Corporation77612
Collimating beam probeNewport Corporation77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard FerruleNewport Corporation77670This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cableOriel Instruments78367Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unitUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm Edmund Optics67749
Interference bandpass filter, 310 nm Edmund Optics67752
Interference bandpass filter, 320 nm Edmund Optics67754
Interference bandpass filter, 330 nm Edmund Optics67756
Interference bandpass filter, 340 nm Edmund Optics65614
Interference bandpass filter, 350 nm Edmund Optics67757
Interference bandpass filter, 360 nm Edmund Optics67760
Interference bandpass filter, 370 nm Edmund Optics67761
Interference bandpass filter, 380 nm Edmund Optics67762
Interference bandpass filter, 390 nm Edmund Optics67763
Interference bandpass filter, 400 nm Edmund Optics65732
Interference bandpass filter, 410 nm Edmund Optics65619
Interference bandpass filter, 420 nm Edmund Optics65621
Interference bandpass filter, 430 nm Edmund Optics65622
Interference bandpass filter, 440 nm Edmund Optics67764
Interference bandpass filter, 450 nm Edmund Optics65625
Interference bandpass filter, 460 nm Edmund Optics67765
Interference bandpass filter, 470 nm Edmund Optics65629
Interference bandpass filter, 480 nm Edmund Optics65630
Interference bandpass filter, 492 nm Edmund Optics65633
Interference bandpass filter, 500 nm Edmund Optics65634
Interference bandpass filter, 510 nm Edmund Optics65637
Interference bandpass filter, 520 nm Edmund Optics65639
Interference bandpass filter, 532 nm Edmund Optics65640
Interference bandpass filter, 540 nm Edmund Optics65642
Interference bandpass filter, 550 nm Edmund Optics65644
Interference bandpass filter, 560 nm Edmund Optics67766
Interference bandpass filter, 570 nm Edmund Optics67767
Interference bandpass filter, 580 nm Edmund Optics65646
Interference bandpass filter, 589 nm Edmund Optics65647
Interference bandpass filter, 600 nm Edmund Optics65648
Interference bandpass filter, 610 nm Edmund Optics65649
Interference bandpass filter, 620 nm Edmund Optics65650
Interference bandpass filter, 632 nm Edmund Optics65651
Interference bandpass filter, 640 nm Edmund Optics65653
Interference bandpass filter, 650 nm Edmund Optics65655
Interference bandpass filter, 660 nm Edmund Optics67769
Interference bandpass filter, 671 nm Edmund Optics65657
Interference bandpass filter, 680 nm Edmund Optics67770
Interference bandpass filter, 690 nm Edmund Optics65659
Interference bandpass filter, 700 nm Edmund Optics67771
Faraday cageAny metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnificationWild HeerbruggWild M5Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy baseMcBain InstrumentsAny heavy base with arm will do
Cardan armCustom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminatorDolan-JennerMI-150For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guideDolan-JennerEEG 2823Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden tableHole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sandcustom built, any box with sand
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameterWorld Precision InstrumentsAGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstageDagan CorporationIX2-700
Humbug Noise reducerQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probeEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Labchart softwareADI instrumentsChart 5
10 MHz Pulse GeneratorBK Precision4030
Glass pipette pullerSutter InstrumentsP-87
Borosillicate glass capillaries with filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering IronWeller
Platform with ball-and-socket magnetic baseHama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor bladeElectron Microscopy Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft

References

  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
  3. Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
  4. Knox, B. E., et al. Heterologous expression of Limulus rhodopsin. J. Biol. Chem. 278, 40493-40502 (2003).
  5. Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
  6. Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
  7. Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
  8. Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
  9. Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
  10. Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
  11. Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
  12. Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
  13. Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
  14. Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
  15. Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
  16. Yang, E. -. C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
  17. Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
  18. Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
  19. Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
  20. Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
  21. Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
  22. Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
  23. Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
  24. Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
  25. Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
  26. Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
  27. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
  28. Hardie, R. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413, 186-193 (2001).
  29. Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
  30. Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
  31. Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
  32. Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
  33. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
  34. Lipetz, L. E., Loewenstein, W. R. . Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. 1, 191-225 (1971).
  35. Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
  36. Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
  37. Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
  38. Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
  39. Bernard, G. D. Red-absorbing visual pigment of butterflies. Science. 203, 1125-1127 (1979).
  40. Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
  41. Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
  42. Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
  43. Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
  44. Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
  45. Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
  46. Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
  47. Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
  48. Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved