JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הטכניקה של אלקטרו הקלטה תאית מודגמת והשתמשה לקבוע רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור יחידים העין המורכבת של פרפר.

Abstract

הקלטה תאית היא טכניקה רבה עצמה להשתמש כדי לקבוע כיצד תא בודד יכול להגיב לגירוי נתון. במחקר חזון, הקלטה תאית כבר היסטורי טכניקה נפוצה בשימוש ללמוד רגישויות של תאי קולטי אור פרט לגירויים באור שונים כי הוא עדיין בשימוש כיום. עם זאת, יש עדיין מחסור של המתודולוגיה מפורט בספרות לחוקרים המעוניינים לשכפל ניסויי הקלטה תאיים בעיניים. כאן אנו מציגים את מקק מודל לבחינת פיזיולוגית עין באופן כללי יותר. תאי קולטי אור חרקים נמצאים קרוב לפני השטח של העין ולכן קלים להגיע, ורבי המנגנונים המעורבים חזון שמורים פני טווח מערכת חיה. אנו מתארים את ההליך הבסיסי הקלטת in vivo התאית של תאי קולטי אור בעיניים של פרפר, עם המטרה של עשיית טכניקה זו לנגישה יותר חוקר עם ניסיון קודם קצת בדוארlectrophysiology. אנחנו מציגים את הציוד הבסיסי הדרוש, איך להכין פרפר חי להקלטה, כיצד להוסיף microelectrode זכוכית לתוך תא בודד, ולבסוף הליך ההקלטה עצם. אנו גם להסביר את הניתוח הבסיסי של נתונים בתגובת גלם לקביעת רגישות ספקטרלית של סוגי תאים בודדים. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד בקביעת רגישות ספקטרלית, גירויים אחרים (למשל, אור מקוטב) וריאציות של השיטה הם החלימו על התקנה זו.

Introduction

התכונות החשמליות של תאים כגון נוירונים הם נצפו על ידי מדידת זרימת יונים על פני קרום התא כשינוי מתח או זרם. מגוון של טכניקות אלקטרו פותח כדי למדוד אירועים ביואלקטריים בתאים. נוירונים נמצאים בעיני חיות נגישים המעגלים שלהם הם בדרך כלל פחות מורכבים ממה במוח, מה שהופכים תאים אלה מועמדים טובים במחקר אלקטרו. יישומים נפוצים של אלקטרופיזיולוגיה בעיניים כוללים electroretinography (ERG) 1,2 ו הקלטה תאית microelectrode. ERG כוללת הצבת אלקטרודה או על העין של חיה, החלת גירוי אור, ומדידת השינוי במתח כסכום של התגובות של כל התאים הסמוכים 3-6. אם מישהו מעוניין במיוחד באפיון רגישויות ספקטרלי של תאי קולטי אור בודדים, לעתים קרובות סוגי תאים מרובים להגיב בו זמנית בעוצמות שונות לגירוי נתון; וכך זהיכול להיות קשה לקבוע את הרגישויות של סוגי תאים ספציפיים מנתוני ERG במיוחד אם ישנם מספר סוגים שונים של תאי קולטי אור ספקטרלית-דומים לעין. פתרון אפשרי אחד הוא ליצור תסיסנית מהונדס עם קולטי האור (opsin) הגן של עניין הביע בתאים רוב R1-6 בעיניים ולאחר מכן לבצע 7 ארג. חסרונות פוטנציאליים של שיטה זו לא נכללו כל לביטוי הנמוך של קולטי אור החלבון 8, ואת מסגרת זמן הרבה עבור הדור והקרנת חיות טרנסגניות. לעיניים עם סוגים פחות של קולטני אור ברור ספקטרלית, הסתגלות של העין עם מסננים צבעוניים יכולה לעזור עם הפחתת התרומה של סוגי תאים מסוימים על ERG, ובכך לאפשר הערכה של מקסימום הרגיש ספקטרלית 9.

הקלטה תאית היא טכניקה אחרת שבה אלקטרודה בסדר impales תא לבין גירוי מוחל. indiv הרשומה אלקטרודה שרקתגובת תא idual כך הקלטה וניתוח תאים בודדים מרובים יכולה להניב רגישויות ספציפיות של תאים מסוגים שונים פיסיולוגי 10-14. למרות בפרוטוקול שלנו מתמקד ניתוח רגישות ספקטרלית, את העקרונות הבסיסיים של תאיים הקלטה עם אלקטרודות חדה הם לשינוי עבור יישומים אחרים. באמצעות הכנה שונה של טיפוס, למשל, באמצעות אלקטרודות קוורץ חדה, אפשר להקליט עמוק באונה האופטית או אזורים אחרים במוח, תלוי השאלה נשאלת. לדוגמא, זמני תגובה של תאי קולטי אור פרט 15, פעילות התא האופטי אונות 16 (lamina, לשד או lobula 17), מוח 18 או גרעינים אחרים 19 יכולים גם להיות מוקלטות עם בטכניקות דומות, או גירויי צבע יכולים להיות מוחלפים עם קיטוב 20 -22 או תנועה לגירויים 23,24.

Phototransduction, התהליך שבו אורהאנרגיה נספגת מומר אות אלקטרוכימיים, היא תכונה עתיקה ועד עממית, כמעט כל ימינו חית טווח מערכת 25. הפיגמנט החזותית שנמצאה בתאי קולטי אור ואת אחראית ליזום phototransduction החזותי הוא לרודופסין. Rhodopsins בכל חיים מורכבים של חלבון opsin, חבר של משפחת קולטן המצומד לחלבון G 7 הטרנסממברני, וכן כרומופור הקשורים הנגזר רשתית או מולקולה דומה 26,27. Opsin רצף החומצות האמיניות ומבנה כרומופור להשפיע על ספיגת של rhodopsin אורכי גל שונים של אור. כאשר פוטון נספג על ידי כרומופור rhodopsin הופך מופעל, ייזום מפל G- חלבון בתא שבסופו של דבר מביא לפתיחת תעלות יונים קרום הנכנס 28. בניגוד לרוב נוירונים, תאי קולטי אור לעבור שינויים פוטנציאל מדורגים שניתן למדוד כשינוי יחסי משרעת תגובה עם שינוי גירוי אור. בדרך כלל נתוןסוג קולטי האור מבטא רק גן opsin אחד (אם כי קיימים חריגים 8,10,29-31). ראיית צבעים מתוחכם, מן הסוג שמוצאים בהרבה חוליות ופרוקי רגליים, מושגת עם עיניים מורכבות של מאות או אלפי התאים קולטי האור בכל להביע אחת או מדי פעם יותר סוגים לרודופסין. מידע חזותי הוא נתפס על ידי השוואת תגובות על פני פסיפס קולטי האור באמצעות איתות עצבית במורד מורכבות העין והמוח, וכתוצאה מכך תפיסת דימוי להשלים עם צבע ותנועה.

אחרי מדידת תגובות גלם של תא קולט אור לאורכי גל שונה של אור באמצעות הקלטה תאית, אפשר לחשב רגישות ספקטרלית שלה. חישוב זה מתבסס על עיקרון Univariance, הקובע כי תגובתו של קולטי אור תא תלויה במספר הפוטונים הוא סופגים, אך לא על התכונות המיוחדות של הפוטונים הם סופג 32. כל פוטון כי הוא absorbed ידי rhodopsin יניעו אותו סוג של תגובה. בפועל, זה אומר כי משרעת תגובת הגלם של תא תגדל בשל הן גדלה בעוצמת אור (פוטונים יותר לספוג), או שינוי אורך גל לכיוון רגישות לשיאו (הסתברות גבוהה יותר של rhodopsin קליטה גל כי). אנו עושים שימוש בעיקרון זה בהתייחסות תגובות הסלולר בעצימות ידועות אותו הגל לתגובות באורכי גל שונה, ואותה קיצוניות אבל רגישות ביחס ידועה. סוגי תאים מזוהים בדרך כלל על ידי אורך הגל שבו פסגות רגישותם.

הנה אנחנו מראים שיטה אחת עבור הקלטה תאית וניתוח הרגישות ספקטרלית של קולטני אור בעיניים של פרפר, עם דגש על ביצוע שיטה זו נגישה יותר לקהילת המחקר הרחבה יותר. למרות הקלטה תאית נותרת נפוצה בספרות, במיוחד ביחס ראיית צבע חרקים, שמצאנו thaתיאורי t של חומרים ושיטות הם בדרך כלל קצרים מכדי לאפשר רבייה של הטכניקה. אנו מציגים שיטה זו בפורמט וידאו במטרה מתיר שהכפול הקל שלה. כמו כן, אנו מתארים את הטכניקה באמצעות ציוד השגה ובמחיר סביר בקלות. אנו מנסים לפתור אזהרות נפוצות, שלעתים קרובות אינם מדווחות, אשר להאט מחקר כאשר אופטימיזציה טכניקה חדשה ולא מוכרת.

Protocol

כל החיות טופלו באופן הומני ככל האפשר. חרקים נשלחו כמו גלמים מקוסטה ריקה אספקה ​​האנטומולוגי, קוסטה ריקה.

טיפול 1. Heliconius גלמים

  1. Hang כל גלמים במרווחים 2-3 ס"מ בתא humidified באמצעות סיכות חרקים.
  2. לאחר eclosion, לאפשר כנפיים לייבוש ולאחר מכן לשמור פרפרים בחיים 1 יום לפחות בתא humidified ולהאכיל פתרון דבש לדלל יומי לפני ההקלטה.
    1. לדלל דבש עם מים לכ פתרון דבש 20% לפי נפח, ויוצק לתוך צלחת פטרי רדודה.
    2. תביא פרפרים בודדים כדי בצלחת פטרי, אחד אחרי השני. עם נגיעת הפתרון עם טרסי הקדמי שלהם, את הפרפרים ירחיבו proboscides שלהם באופן אוטומטי ולשתות מצלחת פטרי. אם החוטם שלהם אינו כולל באופן אוטומטי, להשתמש במלקחיים כדי למשוך את החוטם החוצה להציג את זה הפתרון דבש.

2. מסלול אופטי, כיול measurement של תנאי אור ניסיוני

  1. מניח מנורת קשת 150 W קסנון עם דיור ואספקת חשמל אוניוורסלי הרכבת עדשת קבל מצורפת בצד אחד של שולחן לפחות מטר אחד ארוך כדי לספק אור לבן בוהק.
    זהירות: מנורות קשת קסנון לייצר מאוד אור בהיר עם עוצמות UV חזקות. משקפי מגן צריכים להיות משוחקים בכל העת ואת המנורה צריכה לשמש בבימויו של היצרן כדי למנוע הצטברות של אוזון נגרם על ידי אינטראקציה של אור UV עם חמצן אטמוספרי.
  2. הגדרת מטר אופטי מסלול אחד באורך של אור יציאת הרכבת הדיור לעבור (איור 1).
    1. מקום לפי הסדר הבא על המסלול האופטי עם מרחקים המשוער בנפרד: 1) סיליקה קמורה או עדשה קוורץ 40 סנטימטרים ממכלול הקבל, 2) גלגל מסנן צפיפות ניטראלי (ללא מסננים כיום נתיב האור) 22 סנטימטר בהמשך המסלול, 3) תריס עם יחידת כונן 14 ס"מ ממסנן NDים, 4) עדשה סיליקה או קוורץ קעורה מיד בסמוך לאחר תריס, ו -5) גלאי קרן collimating 6 ס"מ יותר לאורך הקצה המרוחק של המסלול.
    2. להטביע כבל סיב אופטי 600 מיקרומטר בקוטר חללית קורה collimating.
      הערה: בהתאם לעוצמת התאורה, כבל סיב אופטי בקוטר 5-10 מ"מ עשויה להידרש לספק אור מספיק כדי preps אחרים ועשוי להיות תחליף לכך.
    3. התאם את המרחק, גובה וזווית של כל רכיב אופטי כך קרן אור יציאת האסיפה היא בעצימות הגבוהות ביותר אפשרית.
    4. כמו אלמנטים מסלול אופטי עשויים להיות שונים במקצת עם יישומים שונים, להבטיח כי כל האלמנטים לשדר אור UVA ו- בטווח הנראה לעין (315-700 ננומטר).
  3. לאחר המסלול האופטי מורכב, למדוד את האור שעובר דרך ההתקנה באמצעות ספקטרומטר. כייל את ספקטרומטר ראשון באמצעות מנורת כיול עם ספקטרום ידוע ואת התוכנה של היצרן.
    הערה: אנו מתארים את שהוקמו לאחר שימוש במוצרי אופטיקה האוקיינוס ​​לבהירות אבל יצרנים אחרים (למשל, Avantes) למכור מוצרים דומים.
    1. להדליק את מנורת כיול טונגסטן לפחות 45 דקות לפני המדידה.
    2. כדי לכייל, לצרף את ספקטרומטר באמצעות USB למחשב עם התוכנה הנלווית המותקנת. ואז לחבר את ספקטרומטר מנורת כיול טונגסטן באמצעות מתקן קוסינוס שידור UV- גלוי.
    3. בחר "מדידת irradiance ניו המוחלטת" מתוך הכרטיסייה "קובץ", ובחר את ספקטרומטר כמו "המקור".
    4. פעל לפי ההנחיות כדי ליצור קובץ "קאל" כיול חדש. כשתתבקש, טען את קובץ הנתונים שנתקבלו לצורך ניתוח הספקטרום הידוע של המנורה כיול טונגסטן בטווח האור הנראה (300-800 ננומטר) לתוך התוכנה, המחשבת את הספקטרום תיקן באופן אוטומטי מהפלט ספקטרומטר.
    5. שמור את קובץ הכיול. לטעון קובץ זה כאשר initializing התוכנה עבור כל המדידות העתיד של ספקטרום האור באמצעות ספקטרומטר.
  4. לאחר ספקטרומטר הוא מכויל, להשתמש בזה כדי להקליט את ספקטרום האור מן ההתקנה הניסיונית. מכאן והלאה כאשר התוכנה נפתחת, בחר "ניו המוחלטת irradiance ומדידה" ו לטעון את קובץ הכיול שנשמר בעבר. הבא לקחת ספקטרום כהה ידי חסימת כל אור ספקטרומטר.
    1. עם ספקטרומטר כיום למדידה בתנאי תאורת הניסוי הרצוי, התאימו את זמן האינטגרציה (4 msec), סריקות הסכום ממוצעות (5), ורוחב קרון (5), כך הספקטרום ישתנה כראוי והחליק. שמור את ההגדרות זהות עבור כל מדידות ספקטרליות, כך עוצמות אור ממדידות שונות ניתן להשוות.
  5. מדוד ספקטרום האור unattenuated לבן, עבור כל מסנני צפיפות ניטרלי לשמש במהלך הניסויים, ובמשך כל מסנן הפרעות bandpass (איור 2).
    1. Measure ספקטרום האור לבן ללא כל בפילטרים נתיב האור על ידי הדבקת את הקצה החופשי של כבל סיב אופטי משלב 2.2.2 כדי ספקטרומטר. עם קובץ כיול טעון משלב 2.3, להציל את ספקטרום האור הלבן באמצעות התוכנה של ספקטרומטר כקובץ טקסט.
      הערה: ספקטרה הציל כקבצי טקסט לפרט את אורך הגל (x קואורדינטות) בעמודה אחת ואת עוצמת האור (y קואורדינטות) בעמודה השנייה, כך שהנתונים ניתן לטעון לתוך גיליון אלקטרוני עבור בשלב 2.6.
    2. שימוש באותו ההתקנה כמו צעד 2.5.1, להקליט הספקטרום מכל צפיפות אופטית (OD) (0-3.5 OD) השתמש במהלך ניסויים על ידי ההחלפה של הצפיפות הניטראלית (ND) גלגל לסנן במסלול האופטי, ולשמור את קובץ הטקסט עבור כל OD.
    3. השימוש באותו ההתקנה כמו צעד 2.5.1, המקום 10 את הפרעת רוחב פס חצי ננומטר מסננים אחד אחד לתוך נתיב האור ולהקליט את הספקטרום נצפה עבור כל מסנן. חזור על הליך זה עבור כל אחד 41 מסנני הפרעות שונים wtransmittances ה- i השיא במרווחים 10 ננומטר 300 כדי 700 ננומטר. מסננים במרווחים נוספים (20 ננומטר) כשרים עבור מרבית היישומים (עבור ספקטרום, ראה איור 2).
  6. נכון להבדלים עוצמים אור כאשר מסנן הפרעות ממוקמות נתיב האור. כל מסנן התערבות מאפשר מספר כולל שונה של פוטונים לעבור, ואת השידור הנמוך של כמה מסננים מקשה להחליש עוצמת נוספת כך שכל המסננים לאפשר מספרים של פוטונים שווים.
    1. כדי לחשב את העוצמה היחסית (אני) עבור כל מסנן הפרעות רוחב פס 10 ננומטר, לפתור כי אני בביטוי, אני = T / sec, כאשר t הוא השטח מתחת לעקומה הרפאים של כל מסנן התערבות 10 ננומטר (מ 2.5.3) , ו- s הוא (ערך y של קובץ טקסט הציל 2.5.1) המרבי irradiance מוחלט של אור לבן באורך גל שיא של כל מסנן (ראה איור 2 למשל ב 520 ננומטר).
    2. מחלקים כל intensit מחושבies ידי הערך העוצם המקסימום מחושב ב 2.6.1 לנרמל לאחד, ולקחת את הגומלין של הערכים המנורמלים ביחס לשימוש כגורם תיקון להחיל את הרגישות גלם בכל אורך גל (ראה שלב 6.4).
  7. בצע שלבים 2.1 דרך 2.6 רק פעם אחת לפני קבוצה של ניסויים. במהלך ניסוי להקליט את irradiance המוחלט תקופתי של מנורת קשת קסנון תחת אור בהיר ומסנן צפיפות ניטראלית, כדי לוודא את עוצמת גירוי האור אינה משתנית.
  8. במהלך ניסוי, אם תגובה תאית כלשהי קרן אור העוברות דרך מסנני ההפרעות מתקרבת משרעת התגובה המרבית, השתמש במסנני ND כדי להחליש את האות. אם מסנני ND משמשים במהלך ניסוי, להסביר את הקיטון המקביל בעוצמת במהלך החישוב רגישות ספקטרלית.
  9. הגדרת מסלול אופטי, כיול, ומסננים ימים או שבועות לפני ניסויים להתחיל. שמור מסנניםמכוסה כדי למנוע הצטברות אבק.

3. הגדרת ציוד הקלטה

  1. להאכיל את הכבל אותו הסיב האופטי המשמש לכיול באמצעות כלוב פאראדיי ו הר במכשיר goniometric כגון היקף זרוע קרדן (ראה איור 3 עבור תרשים). הכבל יהיה כ 10 סנטימטרים מן העין של הדגימה.
  2. מניח בשלב מתכת על שולחן מבודד מבחינת רטט עם בעל אלקטרודה מותקן ישירות מעל הבמה תחת שליטה של micromanipulator (איור 4). מניח את יד קרדן כך שהראש של הדגימה עומד במרכז של המעגל נוצר על ידי התנועה הסיבובית של הזרוע.
  3. באמצעות מערכת מגבר תאית, הכוללת מגבר (מחוץ לכלוב פאראדיי) ו מגבר (headstage, ליד הכנה בתוך כלוב פאראדיי) לעלות על headstage מעל במת המתכת שבו הדגימה תוצב.
    1. חבר כבל קואקסיאלי אל headstage באמצעותחיבור BNC. פיצול פתוח רק קצתי על הקצה השני של כבל קואקסיאלי, ולהפריד את נדן המתכת החיצוני של הכבל מהחוט הפנימי.
    2. הלחם את המעטפת החיצונית (שמור על פוטנציאל קרקע) בקצה אחד של חוט נחושת מבודד עם קליפ תנין בצד השני. קליפ תנין זה יצרף האלקטרודה מתכת הפניה על פלטפורמת הדגימה (שלב 5.1.4).
    3. הלחם את החוט הפנימי של הכבל הקואקסיאלי אל חוט כסף דק, לשמש האלקטרודה ההקלטה. חוט זה אמור להיות דק מספיק כדי להיות מוזן לתוך אלקטרודת הזכוכית מלאת הפתרון בשלב 5.2.3.
  4. מניחים סטראו מחוברת זרוע מתנדנד ובסיס על ספסל העץ מחוץ לכלוב פאראדיי, כך שהוא עשוי להיות הניף כדי להוריד את האלקטרודה לתוך העין, והניף בחזרה החוצה פעם האלקטרודה הוא בעיני.
  5. הפוך הכל מתכת בטוחה בתוך כלוב פאראדיי מוארק כראוי.
  6. מחוץ לכלוב פאראדיי, לצרף את preamplifאה לכניסה של כמפחית רעש 50-60 רץ (אופציונאלי), ולחבר את הפלט לערוץ אחד אוסצילוסקופ באמצעות מתאם T BNC.
  7. באמצעות הקצה השני של מתאם T, לחבר את האות עוברת דרך האוסילוסקופ לערוץ אחד של החומרה. צרף חומרה זה למחשב באמצעות כבל USB, אשר יאפשר תגובות שנרשמו עם המגבר קדם להיקרא על ידי תוכנות במחשב.
  8. צרף נהג תריס ממסלול האופטי לערוץ השני של האוסילוסקופ באמצעות אחר T-מתאם ולהתחבר זה לגנרטור דופק שישלוט התדירות ומשך הבזקי אור נמסרו העין (שלב 5.5).
    הערה: התקנה של המתקן עצמו צריכה רק צריך להיעשות פעם. לשבור כאן עד מוכן להתחיל הקלטות.

Prep 4. ביום הקלטה

  1. להדליק את מנורת קסנון לפחות 45 דקות לפני הניסוי ולהדליק את חולץ microelectrode זכוכית לפחות 30 דקות לפני pulאלקטרודות זכוכית לינג.
  2. הפעל את כל ציוד ההקלטה (התריס, המגבר, Eliminator רעש, גנרטור הדופק, אוסצילוסקופ, ורכישת נתוני חומרה) ולוודא את התריס סגור כברירת מחדל ולכן אין אור עובר דרך כבל הסיב האופטי.
  3. משוך בורוסיליקט קנס (או aluminosilicate) microelectrodes זכוכית (100-250 התנגדות MΩ אידיאלית) באמצעות חולץ microelectrode זכוכית. השתמש אלקטרודות זכוכית בתוך רק כמה שעות של שנגררת.
  4. למילוי האלקטרודות עם 3 כלוריד M אשלגן (KCl). הערה כי פתרון זה עשוי להיות שונה בהתאם לצרכים של החוקר, למשל לצבוע ההזרקה.

5. הכנת דגימה ונוהל הקלטה

  1. הכן את הדגימה
    1. להטביע פרפר פרט בתוך צינור פלסטיק קטן עם שעווה חמה כך הראש הוא נייח מבצבץ בקצה אחד של הצינור. שעווה למטה חוטם, אנטנות, וכנפיים (איור 5).
    2. חזק tהוא הבטן עם פיסת יבשה של שעווה לשמור על הצינור humidified ידי הצבת רקמות רטובות בתוך הצינור מאחורי הבטן. ודא הדגימה היא לחלוטין ללא תנועה.
    3. הר הצינור באמצעות חתיכה קטנה של שעווה על גבי פלטפורמה קטנה עם כדור משותף-ו-שקע מחובר בסיס מגנטי.
    4. תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס חוט כסף בקוטר 0.125 מ"מ לתוך הראש באמצעות איברי הפה לשמש אלקטרודה ההשוואתית. לפני הניסוי, לצמיתות לתקן את החוט אל הרציף בצורה כזאת כי חוטי הנחושת בשלב 3.3.2 יכולים לחתוך על זה פעם הפלטפורמה מושם על הבמה להקלטה.
    5. לאחר אלקטרודה ההשוואתית נמצאת בעמדה מתאימה זה יכול להיות כל זמן במקום על ידי המסה במהירות ואז קירור שעווה סביב החוט.
    6. באמצעות סכין גילוח פלדת פחמן שביר, אחיזת חלק הלהב עם בעל להב ולשבור חתיכה קטנה להשתמש לחיתוך הקרני.
    7. חותכים חור קטן (~ 10 ommatidiא 'קוטר) בתוך הקרנית עזבה באמצעות סכיני הגילוח ולאטום את החור עם וזלין כדי למנוע התייבשות.
  2. לאחר הקרנית הוא חתך, הכנס את האלקטרודה הקלטה לתוך העין כמה שיותר מהר כי hemolymph בעיניים יקשיח במהירות ולעשות את זה אי אפשר להכניס אלקטרודה. אם אפשר לבצע את הנתיחה ב האסדה שבו ההקלטה תתקיים.
    הערה: וזלין לא צריך להיות מרוח על שאר העין כמו זה יהיה defocus אופטיקה.
    1. אם לא כבר על הבמה, למקם את הדגימה ופלטפורמה רכובה על הבמה במתקן ההקלטה. חבר את חוט הקרקע headstage משלב 3.3.2 אל האלקטרודה התייחסות בפלטפורמת הדגימה באמצעות קליפים תנין.
      הערה: אם אפשר להשתמש במסנן אדום להאיר את החיה.
    2. השתמש מקור אור עם קבצים מצורפים מתכווננת בקצרה להדליק את הדגימה תחת stereoscope תוך הפחתת האלקטרודה ההקלטה לתוך העין.
    3. בבהלבשת חוט הכסף מחובר headstage משלב 3.3.3 לתוך תמיסת KCl בחלק האחורי של microelectrode זכוכית. הר אלקטרודת זכוכית על בעל אלקטרודה.
    4. התאם את בעל אלקטרודה כך microelectrode הוא ישירות מעל החור לחתוך בעבר בתוך הקרנית, כמילימטר מעל הקרנית. מנמיכים את microelectrode לתוך העין באמצעות micromanipulator עד השלמת מעגל, כפי שמוצג על ידי שינוי גדול בפוטנציאל (mV) על האוסילוסקופ.
  3. לאחר בעיניים, להניף את סטריאוסקופ מחוץ לכלוב פאראדיי, ומכבה את מקור האור המאיר את הדגימה. החדר צריך להיות כל הזמן חשוך כל כך לעין הופך לאפלולית.
  4. בדוק את ההתנגדות של האלקטרודה על ידי יישום זרם 1 נה מהמגבר וציין השינוי במתח. התנגדות בדרך כלל צריכה להיות בטווח שבין 100-250 MΩ. התנגדויות גבוהות מעידות על חסימה או כיפוף של האלקטרודה, התנגדויות נמוכות של אלקטרונשבירה תודה.
  5. הפעל את המחולל הדופק כך את התריס נפתח ומאפשר בזק האור עם משך 50 msec כל 0.5 שניות, ולאפשר לו להמשיך מהבהב למשך הניסוי.
    1. התאם את גנרטור הדופק אז זה מאפשר הבזקים של עד 50 משך msec. משך זה ו -0.5 שניות הפסקה בין הבזקים שומרים הדגימה כפי קרובים לאפלוליים ככל האפשר במהלך הניסוי. חמישים msec קרוב משך פלאש הקצר כי יהיה להפיק אותה משרעת בתגובה כמו המשכים פלאש כבר.
    2. Re-מידת תגובות היא ברמה של ההתחלה ואת הסוף של הניסוי (שלב 5.16). במהלך על ניסוי עשרים דקות, הגדרות פלאש האלה אינן מתפרקות התגובה לאורך זמן. preps השונה עשוי לדרוש התאמות להגדרות פלאש אלה.
  6. מקם את זרוע קרדן כך כבל הסיב האופטי מכוון העין.
  7. בדוק את הסקופ לשינוי מתח עם כל הבזק אור.שינוי שלילי מתח מסמן כי האלקטרודה לא נכנסה עדיין בתא.
  8. הזז את זרוע קרדן סביב הדגימה עד כי היא ממוצבת בזווית העין שבו יש תגובת מתח מקסימלי.
  9. סובב את micromanipulator הלוך ושוב, גורם לתנועות אנכיות קטנות מאוד של האלקטרודה בשני הכיוונים תוך הקשה על הבסיס של האלקטרודה מחזיק או באמצעות הפונקציה באז קלים על המגבר קדם. המשך ביצוע התאמות קטנות עד תגובה depolarizing אור מופיע על האוסילוסקופ (איור 6).
  10. התאם את זרוע קרדן שוב כדי למצוא את זוית הפגיעה שבו בזק האור יוצר את אות depolarizing הגדולה. בצע התאמות קטנות עם micromanipulator ולהשתמש בפונקציית באז על המגבר לפי הצורך כדי לוודא את האלקטרודה הקלטה התא ביציבות וכי הוא יישאר בתא עבור הניסוי כולו (ראה שלב 5.11).
  11. לאחר ההתקנה היא יציבה, להתחיל recording. הקלטה יציבה צריכה לא מעט על מנת שינוי נח פוטנציאל, רעש רקע נמוך, תגובת depolarizing גדולה באופן עקבי (לפחות 10: אות 1 יחס רעש).
    1. הפעל את התוכנה על המחשב, ולהתחיל "ניסוי חדש," אשר יפתח חלון pop up עם ארבעה ערוצים.
    2. להתאים את קנה המידה מתח בפינה הימנית העליונה של חלון התוכנה ל -500 mV. הערוץ הראשון מציג את התגובות רשמו האלקטרודה בזמן אמת, ואילו הערוץ השני יתעד את הגל המרובע המיוצר על ידי גנרטור הפונקציה, אם האות מוזן חומרת רכישת נתונים באמצעות האוסילוסקופ, מוצג כאשר התריס פתוח . ערוצי השניים האחרים הם לא נחוצים.
    3. לחץ על "התחל" בפינה הימנית התחתונה כדי להתחיל בהקלטה, ולאפשר את התוכנה להתמודד על תקופת הניסוי. התאם את הזום של x (הזמן) ו- y (מתח) גרזנים כך שהתגובות ברורות.
  12. ראשית, עם אור לבן, להקליט עד 10 תגובות בודדות עם גלגל מסנן ND 3.5 OD (כ 5-10 שניות).
  13. השיא בא אותו המספר של תגובות 3.3 OD, אז 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, וכו 'בכל שילוב עד 0.0 OD. אמפליטודות תגובה אלה לסדרת מסנן ND תספקנה את העקומה העוצמת-log בתגובה בסעיף 6. אם מתרחש לבן, להשתמש הבזקים פחות גירויים בהירים במהלך הניסוי.
  14. כתוב את התשובות של תא לכל אורכי הגל, באמצעות מסנני ההפרעה.
    1. ראשית למצוא את אורך גל השיא. בלי פילטרים ND בנתיב האור (0.0 OD), למקם מסנן משדר UV בנתיב האור בקצרה לבחון את משרעת התגובה. אני חוזר עם מסנן משדר כחול, מסנן שידור ירוק, ומסנן שידור אדום, שאמורה לתת לכם מושג מאיפת תגובת השיא תהיה.
    2. השתמש במסננים בסביבות 350, 450, 550, 650 ננומטר למצוא באזור הכללי של רגישות שיאצעד 5.14.1. אורך הגל המדויק לא משנה בשלב חיפוש הראשוני הזה בגלל כל אורכי הגל יירשמו לשלב הבא. אם הערכות קיימות של רגישויות שיא, או שהם כבר נרשמו בעבר, אורכי גל ידוע שימוש לזהות את תגובת השיא במהירות.
    3. לאחר תגובת השיא או קרוב לכך מזוהה, שיא באורך גל זה למשך 10 תגובות (כ -5 שניות).
    4. לאחר הקלטת באורך הגל של תגובת שיא, שיא עם מסנני התערבות האחרים, החל 300-700 ננומטר ב 10 צעדים ננומטר. התחל מהפסגה ולצעוד לעבר שני אורכי גל קצרים יותר על ידי החלפת מסננים מ- נתיב האור בזה אחר זה (למשל אם התגובה השיא הוא 520 ננומטר, תגובות שיא באורך גל זה הראשון, אז 510 ננומטר, ואחריו 530 ננומטר, 500 ננומטר, 540 ננומטר, 490 ננומטר, 550 ננומטר, וכן הלאה עד אין אין תגובה).
    5. אפשר עד 10 תגובות לכל מסנן (5 שניות כל אחד). כאשר החלפת מסננים הפרעה, המאפשר לתא שו"תond 1-2 הבזקים של אור הלבן ללא כל סינון בנתיב האור, שהוא מועיל לפקח האם תגובת השיא משפילה לאורך זמן. צמצם את מספר התגובות או להגדיל את OD אם הלבנה מתרחשת.
  15. אם התגובה בשום מסנן התערבות קרובה מדי התגובה המרבית תחת אור לבן ב 0 OD, ואז להחליש עם מסנני ND. מסנני ההפרעה והגודל של כבל הסיב האופטי השתמש בניסוי זה מאוד להחליש את עוצמת האור וכך מסנני ND בדרך כלל אין צורך.
  16. אם ההקלטה נשארה יציב, אורכי גל-שיא מחדש סביב תגובת השיא, אשר משמשת pseudoreplicate לצורך וידוא אמפליטודות תגובה קודמת ומסייעת להבטיח את התגובה לא מושפלת לאורך זמן. לאחר כל אורכי הגל נרשמים, להקליט מחדש את התגובות תחת סדרת ND, כמו בשלב 5.12.
  17. לאחר ההקלטה מלאה לחץ "עצורה" על התוכנה, ולשמור את ההקלטה לניתוח.
  18. לאחר ניסוי, להקריב את הפרט על ידי הקפאה, או קירור במשך כמה דקות אחריו במהירות על ידי ניתוק הראש ומוחץ בית החזה.
  19. כבה את כל הציוד. לשבור כאן במידת הצורך לפני ביצוע ניתוח.

6. ניתוח רגישות ספקטרלית

  1. עם התוכנה המשמשת להקליט תגובות גלם, לחשב את המשרעת התגובה הממוצעת של 10 תגובות בודדות עבור כל מסנן בסדרת ND ולכל מסנן הפרעות.
  2. צור פונקצית תגובה-log עוצם (VlogI) מהסדרה המסננת ND שנרשמה שלבי 5.12-5.13 (איור 7). עושים זאת על ידי התוויית יחידות יומן של אינטנסיביות (OD) על ציר ה- X, ותגובה לכל עוצמת על ציר y.
    1. כדי להפיק רגישות ספקטרלית של התא באורכי גל שונים, בדרך כלל להתאים את המשוואה Naka-ראשטון לנתונים משלב 6.2, ולהשתמש במשוואה הזאת להתייחס תחומי ספקטרום השיג באופן ניסיוני של t באורכי גל שוניםo פוטונים ביחס הנדרש כדי לעורר תגובה כי תחת גל קבוע (ב אור לבן במקרה זה).
      הערה: משוואת Naka-ראשטון היא: V / מקס V = אני n / (אני n + K n), שבו אני נמצא את עוצמת הגירוי, V הוא משרעת בתגובה, V max היא משרעת התגובה המרבית, K הוא הגירוי עוצמת נותנת ½ V max, ו- n הוא שיפוע המעריכים. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להתאים את המשוואה הזאת לנתוני VlogI, כולל תוכנה עקומה הולמת, או חבילות סטטיסטיות מבוסס קוד.
    2. כדי להתאים את המשוואה Naka-ראשטון באמצעות חישובים פשוטים בתוכנית גיליון אלקטרוני, להמיר את הנתונים בתגובה VlogI לכל עוצמת הגירוי: יומן [(מקסימום V / V) - 1]. ואז לבצע רגרסיה ליניארית על הנתונים טרנספורמציה כדי לקבל את המשוואה של הקו של בכושר הטוב ביותר.
      הערה: מקסימום V חייב להיות גדול יותר מכל תגובות שקולות; לשמור את זה עקבי, שיטה זו מעריכה מקסימום V כמו GRE 1%אטר מ התגובה המדודה הגבוהה ביותר.
    3. מן המשוואה של קו הרגרסיה, להעריך את המעריך (n) על ידי לקיחת שיפוע שלילי, והיכנס (K) = Y-ליירט / n.
  3. לאחר הפרמטרים עבור מקסימום V, n, ו- K היה מוערך, לקבוע את מספרם היחסי של פוטונים נדרש לעורר את התגובה הספקטרלית של התא בכל אורך גל ידי חיבור התגובה הספקטרלית נמדד באורך גל נתון (V) ופתרון עבור I.
  4. הכפל את עוצמת הגירוי חושב (I) משלב 6.3 במקדם התיקון עבור כל מסנן הפרעות (משלב 2.4.3) בכל אורך גל.
  5. כדי לקבל רגישות, כל העוצמות חייבות להיות קשורות עקומת V יומן-לי, כך שניתן יהיה להשוות ביניהם. עושים זאת על ידי הנוגעים בכל עוצמת הגל כדי ½ V max או K, המחושב בשלב 6.2.3.
    1. פחת כל עוצמת גל תיקן (שלב 6.4) מ ק
    2. אז עבור כל עוצמת גל, להוסיף את זה "המרחק מ K "ערך K, להכפיל (-1).
    3. הבא להביא את כל נקודות הנתונים החיוביות על ידי הוספת הערך המוחלט של נקודת הנתונים הנמוכה ביותר בסדרה לכל אורך גל.
  6. מצא רגישויות בכל אורך גל על ​​ידי לקיחת ההופכי של כל העוצמות המחושבות חדש משלב 6.5.1. להמיר את הנתונים כך הספקטרום הרגיש נופל בין 0 ל -1.
  7. לאחר הקלטת מן יותר מתא אחד הממוצע מאותו סוג התגובות והעלילה הסופיות במוטות סטיית התקן או רווח סמך 95% (איור 8).

תוצאות

עבור אלמנטים רבים של הגדרת ההקלטה, תיאור בכתב אינו מספק פירוט מספיק. איור 1 הוא סכימטי של הרכיבים מעורבים הגדרת ההקלטה המלאה. באיור 2, ספקטרה הם זממו עבור אור לבן כל מסנן התערבות כדי לתת תחושה של למה בגורם תיקון נחוץ ומה נדרש כדי לחשב את התיקון הז?...

Discussion

הקלטה תאית יכולה להיות טכניקה קשה לשלוט בשל הצעדים טכניים הרבים המעורבים. עבור ניסויים מוצלחים כמה נקודות חשובות יש לקחת בחשבון. ראשית, חשוב שיהיה שולחן מבחינת רטט-מבודד כראוי שבו הניסוי מבוצע. חוקרים רבים משתמשים בלוחות אוויר, אשר לחלוטין להפריד את השולחן מהבסיס, מת...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים המנוח רודי לימבורג בודת היקף זרוע קרדן, קימברלי ג'יימיסון, מתיו מקהנרי, ו ראג'ו Metherate עבור השאלה לנו ציוד, Almut קלבר ו קנטר Arikawa, על עידוד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מחקר לתארים מתקדמים הקרן הלאומית למדע (NSF) כדי KJM ומענק NSF IOS-1,257,627 ל ADB

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Butterfly pupaeSeveral local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinderAny chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite HoneyTrader Joe'sAny honey or sucrose solution will work
Xenon Arc LampOriel Instruments66003Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x)Oriel Instruments11647Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
Six Position Filter Wheel, x2Newport CorporationFW1X6
Filter Wheel Mount HubNewport CorporationFWM
Concave silica lens, 25.4 mmNewport CorporationSPC034
Collimator holderNewport Corporation77612
Collimating beam probeNewport Corporation77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard FerruleNewport Corporation77670This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cableOriel Instruments78367Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unitUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm Edmund Optics67749
Interference bandpass filter, 310 nm Edmund Optics67752
Interference bandpass filter, 320 nm Edmund Optics67754
Interference bandpass filter, 330 nm Edmund Optics67756
Interference bandpass filter, 340 nm Edmund Optics65614
Interference bandpass filter, 350 nm Edmund Optics67757
Interference bandpass filter, 360 nm Edmund Optics67760
Interference bandpass filter, 370 nm Edmund Optics67761
Interference bandpass filter, 380 nm Edmund Optics67762
Interference bandpass filter, 390 nm Edmund Optics67763
Interference bandpass filter, 400 nm Edmund Optics65732
Interference bandpass filter, 410 nm Edmund Optics65619
Interference bandpass filter, 420 nm Edmund Optics65621
Interference bandpass filter, 430 nm Edmund Optics65622
Interference bandpass filter, 440 nm Edmund Optics67764
Interference bandpass filter, 450 nm Edmund Optics65625
Interference bandpass filter, 460 nm Edmund Optics67765
Interference bandpass filter, 470 nm Edmund Optics65629
Interference bandpass filter, 480 nm Edmund Optics65630
Interference bandpass filter, 492 nm Edmund Optics65633
Interference bandpass filter, 500 nm Edmund Optics65634
Interference bandpass filter, 510 nm Edmund Optics65637
Interference bandpass filter, 520 nm Edmund Optics65639
Interference bandpass filter, 532 nm Edmund Optics65640
Interference bandpass filter, 540 nm Edmund Optics65642
Interference bandpass filter, 550 nm Edmund Optics65644
Interference bandpass filter, 560 nm Edmund Optics67766
Interference bandpass filter, 570 nm Edmund Optics67767
Interference bandpass filter, 580 nm Edmund Optics65646
Interference bandpass filter, 589 nm Edmund Optics65647
Interference bandpass filter, 600 nm Edmund Optics65648
Interference bandpass filter, 610 nm Edmund Optics65649
Interference bandpass filter, 620 nm Edmund Optics65650
Interference bandpass filter, 632 nm Edmund Optics65651
Interference bandpass filter, 640 nm Edmund Optics65653
Interference bandpass filter, 650 nm Edmund Optics65655
Interference bandpass filter, 660 nm Edmund Optics67769
Interference bandpass filter, 671 nm Edmund Optics65657
Interference bandpass filter, 680 nm Edmund Optics67770
Interference bandpass filter, 690 nm Edmund Optics65659
Interference bandpass filter, 700 nm Edmund Optics67771
Faraday cageAny metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnificationWild HeerbruggWild M5Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy baseMcBain InstrumentsAny heavy base with arm will do
Cardan armCustom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminatorDolan-JennerMI-150For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guideDolan-JennerEEG 2823Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden tableHole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sandcustom built, any box with sand
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameterWorld Precision InstrumentsAGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstageDagan CorporationIX2-700
Humbug Noise reducerQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probeEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Labchart softwareADI instrumentsChart 5
10 MHz Pulse GeneratorBK Precision4030
Glass pipette pullerSutter InstrumentsP-87
Borosillicate glass capillaries with filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering IronWeller
Platform with ball-and-socket magnetic baseHama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor bladeElectron Microscopy Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft

References

  1. Beckmann, H., et al. Spectral sensitivity in Onychophora (velvet worms) revealed by electroretinograms, phototactic behaviour and opsin gene expression. J. Exp. Biol. 218, 915-922 (2015).
  2. Leboulle, G., et al. Characterisation of the RNA interference response against the long-wavelength receptor of the honeybee. Insect Biochem. Mol. Biol. 43, 959-969 (2013).
  3. Martinez-Harms, J., et al. Evidence of red sensitive photoreceptors in Pygopleurus israelitus Coleoptera) and its implications for beetle pollination in the southeast Mediterranean. J. Comp. Physiol. A. 198, 451-463 (2012).
  4. Knox, B. E., et al. Heterologous expression of Limulus rhodopsin. J. Biol. Chem. 278, 40493-40502 (2003).
  5. Salcedo, E., Zheng, L., Phistry, M., Bagg, E. E., Britt, S. G. Molecular basis for ultraviolet vision in invertebrates. J. Neurosci. 23, 10873-10878 (2003).
  6. Salcedo, E., et al. Blue- and green-absorbing visual pigments of Drosophila: ectopic expression and physiological characterization of the R8 photoreceptor cell-specific Rh5 and Rh6 rhodopsins. J. Neurosci. 19, 10716-10726 (1999).
  7. Vilinsky, I., Johnson, K. G. Electroretinograms in Drosophila: robust and genetically accessible electrophysiological system for the undergraduate laboratory. J. Undergrad. Neurosci. Educ. 11, 149-157 (2012).
  8. Hu, X., Leming, M. T., Whaley, M. A., O'Tousa, J. E. Rhodopsin coexpression in UV photoreceptors of Aedes aegypti Anopheles gambiae mosquitoes. J. Exp. Biol. 217, 1003-1008 (2014).
  9. Telles, F. J., et al. Out of the blue: the spectral sensitivity of hummingbird hawkmoths. J. Comp. Physiol. A. 200, 537-546 (2014).
  10. Arikawa, K., Mizuno, S., Kinoshita, M., Stavenga, D. G. Coexpression of two visual pigments in a photoreceptor causes an abnormally broad spectral sensitivity in the eye of the butterfly Papilio xuthus. J. Neurosci. 23, 4527-4532 (2003).
  11. Arikawa, K., et al. An ultraviolet absorbing pigment causes a narrow-band violet receptor and a single-peaked green receptor in the eye of the butterfly Papilio. Vision Res. 39, 1-8 (1999).
  12. Cronin, T. W., Jarvilehto, M., Weckstrom, M., Lall, A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 186, 1-12 (2000).
  13. Skorupski, P., Doring, T. F., Chittka, L. Photoreceptor spectral sensitivity in island and mainland populations of the bumblebee, Bombus terrestris. J. Comp. Physiol. A. 193, 485-494 (2007).
  14. Stalleicken, J., Labhart, T., Mouritsen, H. Physiological characterization of the compound eye in monarch butterflies with focus on the dorsal rim area. J. Comp. Physiol. A. 192, 321-331 (2006).
  15. Skorupski, P., Chittka, L. Photoreceptor processing speed and input resistance changes during light adaptation correlate with spectral class in the bumblebee, Bombus impatiens. PLoS One. 6, 25989 (2011).
  16. Yang, E. -. C., Osorio, D. Spectral sensitivities of photoreceptors and lamina monopolar cells in the dragonfly, Hemicordulia tau. J. Comp. Physiol. A. 169, (1991).
  17. Yang, E. C., Lin, H. C., Hung, Y. S. Patterns of chromatic information processing in the lobula of the honeybee, Apis mellifera L. J. Insect Physiol. 50, 913-925 (2004).
  18. Rosner, R., Homberg, U. Widespread sensitivity to looming stimuli and small moving objects in the central complex of an insect brain. J. Neurosci. 33, 8122-8133 (2013).
  19. Trager, U., Homberg, U. Polarization-sensitive descending neurons in the locust: connecting the brain to thoracic ganglia. J. Neurosci. 31, 2238-2247 (2011).
  20. Heinze, S., Reppert, S. M. Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies. Neuron. 69, 345-358 (2011).
  21. Greiner, B., Cronin, T. W., Ribi, W. A., Wcislo, W. T., Warrant, E. J. Anatomical and physiological evidence for polarisation vision in the nocturnal bee Megalopta genalis. J. Comp. Physiol. A. 193, 591-600 (2007).
  22. Stowasser, A., Buschbeck, E. K. Electrophysiological evidence for polarization sensitivity in the camera-type eyes of the aquatic predacious insect larva Thermonectus marmoratus. J. Exp. Biol. 215, 3577-3586 (2012).
  23. Osorio, D. Directionally selective cells in the locust medulla. J. Comp. Physiol. A. 159, 841-847 (1986).
  24. Nordström, K., Barnett, P. D., Moyer de Miguel, I. M., Brinkworth, R. S., O'Carroll, D. C. Sexual dimorphism in the hoverfly motion vision pathway. Curr. Biol. 18, 661-667 (2008).
  25. Plachetzki, D. C., Fong, C. R., Oakley, T. H. The evolution of phototransduction from an ancestral cyclic nucleotide gated pathway. Proc. Biol. Sci. 277, 1963-1969 (2010).
  26. Feuda, R., Hamilton, S. C., McInerney, J. O., Pisani, D. Metazoan opsin evolution reveals a simple route to animal vision. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18868-18872 (2012).
  27. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, 739-745 (2000).
  28. Hardie, R. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413, 186-193 (2001).
  29. Katti, C., et al. Opsin co-expression in Limulus differential regulation by light and a circadian clock. J. Exp. Biol. 213, 2589-2601 (2010).
  30. Smith, W. C., Price, D. A., Greenberg, R. M., Battelle, B. A. Opsins from the lateral eyes and ocelli of the horseshoe crab, Limulus polyphemus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6150-6154 (1993).
  31. Sison-Mangus, M. P., Bernard, G. D., Lampel, J., Briscoe, A. D. Beauty in the eye of the beholder: the two blue opsins of lycaenid butterflies and the opsin gene-driven evolution of sexually dimorphic eyes. J. Exp. Biol. 209, 3079-3090 (2006).
  32. Rushton, W. Review Lecture. Pigments and signals in colour vision. J. Physiol. 220, 1-31 (1972).
  33. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J. Physiol. 185, 587-599 (1966).
  34. Lipetz, L. E., Loewenstein, W. R. . Handbook of Sensory Physiology. Vol. 1. Principles of Receptor Physiology. 1, 191-225 (1971).
  35. Matić, T., Laughlin, S. B. Changes in the intensity-response function of an insect's photoreceptors due to light adaptation. J. Comp. Physiol. A. 145, 169-177 (1981).
  36. Evans, L. S., Peachey, N. S., Marchese, A. L. Comparison of three methods of estimating the parameters of the Naka-Rushton equation. Documenta Ophthalmologica. 84, 19-30 (1993).
  37. Aylward, G. W. A simple method of fitting the Naka-Rushton equation. Clinical Vision Sciences. 4, 275-277 (1989).
  38. Stavenga, D. G., Smits, R. P., Hoenders, B. J. Simple exponential functions describing the absorbance bands of visual pigment spectra. Vision Res. 33, 1011-1017 (1993).
  39. Bernard, G. D. Red-absorbing visual pigment of butterflies. Science. 203, 1125-1127 (1979).
  40. Ogawa, Y., et al. Coexpression of three middle wavelength-absorbing visual pigments in sexually dimorphic photoreceptors of the butterfly Colias erate. J. Comp. Physiol. A. 198, 857-867 (2012).
  41. Briscoe, A. D., Chittka, L. The evolution of color vision in insects. Annu. Rev. Entomol. 46, 471-510 (2001).
  42. Kelber, A., Thunell, C., Arikawa, K. Polarisation-dependent colour vision in Papilio butterflies. J. Exp. Biol. 204, 2469-2480 (2001).
  43. Kelber, A., Balkenius, A., Warrant, E. J. Scotopic colour vision in nocturnal hawkmoths. Nature. 419, 922-925 (2002).
  44. Koshitaka, H., Kinoshita, M., Vorobyev, M., Arikawa, K. Tetrachromacy in a butterfly that has eight varieties of spectral receptors. Proc. Biol. Sci. 275, 947-954 (2008).
  45. Blackiston, D., Briscoe, A. D., Weiss, M. R. Color vision and learning in the monarch butterfly, Danaus plexippus (Nymphalidae). J. Exp. Biol. 214, 509-520 (2011).
  46. Sison-Mangus, M. P., Briscoe, A. D., Zaccardi, G., Knuttel, H., Kelber, A. The lycaenid butterfly Polyommatus icarus uses a duplicated blue opsin to see green. J. Exp. Biol. 211, 361-369 (2008).
  47. Schneuwly, S., et al. Drosophilia ninaA gene encodes an eye-specific cyclophilin (cyclosporine A binding protein). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (1989).
  48. Luan, Z., Reddig, K., Li, H. S. Loss of Na(+)/K(+)-ATPase in Drosophila leads to blindness and age-dependent neurodegeneration. Exp. Neurol. 261, 791-801 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience108opsinrhodopsin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved