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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen.

Zusammenfassung

Intrazellulärer Aufnahme ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um zu bestimmen, wie eine einzelne Zelle auf einen gegebenen Reiz reagieren. In einer Vision Forschung, hat die intrazelluläre Aufnahme war in der Vergangenheit eine übliche Technik zu studieren Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen auf verschiedene Lichtreize verwendet, die noch heute verwendet wird. Es bleibt jedoch ein Mangel an detaillierten Methodik in der Literatur für die Forscher die intrazelluläre Aufnahme Experimente im Auge zu replizieren wollen. Hier präsentieren wir das Insekt als Modell für die Untersuchung Augenphysiologie allgemeiner. Insekten Sehzellen sind in der Nähe der Oberfläche des Auges angeordnet und sind daher leicht zu erreichen, und viele der Mechanismen in der Vision beteiligt sind, über Tierphyla konserviert. Wir beschreiben das grundlegende Verfahren für in vivo intrazelluläre Aufnahme von Sehzellen im Auge eines Schmetterlings, mit dem Ziel, diese Technik für Forscher mit wenig Erfahrung in electrophysiology. Wir stellen die Grundausstattung benötigt, wie ein Live-Schmetterling zur Vorbereitung der Aufnahme, wie ein Glas-Mikroelektrode in eine einzelne Zelle einfügen, und schließlich die Aufnahmeverfahren selbst. Wir erklären auch die grundlegende Analyse der rohen Reaktionsdaten für die spektrale Empfindlichkeit der einzelnen Zelltypen zu bestimmen. Obwohl unser Protokoll über die Bestimmung spektraler Empfindlichkeit konzentriert, andere Reize (zB polarisiertes Licht) und Variationen des Verfahrens sind zu diesem Setup anwendbar.

Einleitung

Die elektrischen Eigenschaften von Zellen, wie Neuronen werden durch Messen Ionenfluss durch die Zellmembranen als Änderung der Spannung oder des Stroms beobachtet. Eine Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken entwickelt worden bioelektrischen Ereignisse in Zellen zu messen. Neurone in den Augen von Tieren zugänglich sind und ihre Schaltungsanordnung ist oft weniger komplex als im Gehirn, diese Zellen gute Kandidaten für eine elektrophysiologische Untersuchung zu machen. Gängige Anwendungen von Elektro im Auge umfassen Elektroretinogramm (ERG) 1,2 und Mikroelektroden intrazelluläre Aufnahme. ERG beinhaltet in oder auf dem Auge eines Tieres eine Elektrode platziert, ein Lichtreiz Anwendung und Messung der Änderung der Spannung als Summe der Antworten aller Zellen in der Nähe 3-6. Wenn man bei der Charakterisierung von spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen speziell interessiert ist, oft mehrere Zelltypen gleichzeitig an verschiedenen Stärken auf einen bestimmten Reiz reagieren; somitschwierig sein kann, die Empfindlichkeiten von spezifischen Zelltypen aus ERG-Daten zu bestimmen, insbesondere dann, wenn verschiedene Arten von spektral ähnlichen Sehzellen im Auge sind. Eine mögliche Lösung ist transgene Drosophila mit dem Photorezeptor (Opsin) Gen von Interesse in den meisten R1-6 Zellen im Auge ausgedrückt zu schaffen und führen Sie dann ERG 7. Mögliche Nachteile dieser Methode sind nicht zu niedrig Expression des Proteins Photorezeptor 8, und die lange Zeitrahmen für die Erzeugung und das Screening von transgenen Tieren. Für Augen mit weniger Arten von spektral unterschiedlichen Photorezeptoren, die Anpassung des Auges mit farbigen Filter können mit Absenken der Beitrag einiger Zelltypen zu dem ERG, wodurch Schätzung der spektralen Empfindlichkeitsmaxima 9 helfen.

Die intrazelluläre Aufnahme ist eine weitere Technik, wo eine feine Elektrode, die eine Zelle und ein Stimulus spießt angewendet wird. Die Elektrodenaufzeichnungen nur, dass indivIdual Zelle Antwort , so dass von der Aufnahme und mehreren einzelnen Zellen 10-14 spezifischen Empfindlichkeiten von physiologisch unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren ergeben. Obwohl unser Protokoll auf der Analyse der spektralen Empfindlichkeit konzentriert, sind die grundlegenden Prinzipien der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden für andere Anwendungen modifizierbar. Mit einer anderen Vorbereitung einer Probe, zum Beispiel, und mit scharfen Quarzelektroden kann man aus tiefer in den optischen Loben oder anderen Regionen im Gehirn, die sich an der Frage abhängig gefragt. Zum Beispiel Antwortzeiten einzelner Sehzellen 15, Zell - Aktivität in den optischen Loben 16 (Lamina, Medulla oder Lobula 17), Gehirn 18 oder andere Ganglien 19 kann auch mit ähnlichen Techniken aufgezeichnet werden, oder Farbreize mit Polarisation ersetzt werden könnte 20 -22 oder Bewegungsreize 23,24.

Phototransduktion, das Verfahren, mit dem LichtEnergie absorbiert und in ein elektrochemisches Signal, ist ein altes Merkmal gemeinsam fast alle heutigen Tierstämme 25. Die visuelle Pigment gefunden in Sehzellen und verantwortlich für Phototransduktion Einleitung ist Rhodopsin. Rhodopsine in allen Tieren sind aus einem Opsin - Protein, einem Mitglied der 7 transmembranen G - Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie und ein zugehöriges Chromophor hergestellt , das aus der Netzhaut oder ein ähnliches Molekül 26,27 ableitet. Opsin Aminosäuresequenz und chromophore Struktur beeinflussen die Absorption von auf verschiedene Wellenlängen von Licht Rhodopsin. Wenn ein Photon durch den Chromophor absorbiert wird das Rhodopsin aktiviert wird, einen G-Protein - Kaskade in der Zelle initiiert, die an der Öffnung der membrangebundenen Ionenkanäle 28 schließlich führt. Anders als die meisten Neuronen unterziehen Sehzellen abgestufter Potentialänderungen, die Lichtreizes als relative Änderung der Reaktionsamplitude mit wechselnden gemessen werden kann. Typischerweise eine gegebenePhotorezeptortyp drückt nur ein Opsin - Gen (obwohl Ausnahmen existieren 8,10,29-31). Anspruchsvolle Farbsehen, wie sie in vielen Wirbeltieren und Gliederfüßern gefunden wird, wird mit einem komplexen Auge von Hunderten oder Tausenden von Sehzellen erreicht jeweils ein oder gelegentlich mehr Rhodopsin Arten ausdrücken. Visuelle Information wird durch den Vergleich Antworten, die über dem Fotoaufnehmer Mosaik über komplexe nachgeschalteten neuronalen Signalisierung im Auge und Gehirn erfasst, was in der Wahrnehmung eines Bildes komplett mit Farbe und Bewegung.

die rohen Antworten eines Sehzellen auf unterschiedliche Wellenlängen des Lichts über die intrazelluläre Aufnahme Nach der Messung ist es möglich, seine spektrale Empfindlichkeit zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf dem Prinzip der Univariance, die besagt , dass eine Reaktion der Photorezeptorzelle auf der Zahl der Photonen abhängig ist, aber nicht auf die besonderen Eigenschaften der Photonen absorbiert es 32 absorbiert. Jedes Photon, das abso istrbed von Rhodopsin wird die gleiche Art von Reaktion induzieren. In der Praxis bedeutet dies , dass eine rohe Reaktionsamplitude der Zelle entweder aufgrund einer Erhöhung der Lichtintensität (mehr Photonen zu absorbieren) zu erhöhen, oder zu einer Verschiebung der Wellenlänge in Richtung auf seine maximale Empfindlichkeit (höhere Wahrscheinlichkeit von Rhodopsin , dass die Wellenlänge absorbieren). Wir nutzen dieses Prinzip in Bezug zellulären Reaktionen bei bekannter Intensität und der gleichen Wellenlänge zu Reaktionen bei unterschiedlichen Wellenlängen und der gleichen Intensität, aber unbekannten relative Empfindlichkeit. Zelltypen werden oft von der Wellenlänge, bei der ihre Empfindlichkeit Peaks identifiziert.

Hier zeigen wir eine Methode für die intrazelluläre Aufnahme und Analyse der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Auge eines Schmetterlings, mit einem Fokus auf machen diese Methode besser zugänglich zu der weiteren Forschung. Obwohl die intrazelluläre Aufnahme in der Literatur häufig bleibt, vor allem in Bezug auf das Farbsehen bei Insekten, haben wir gefunden, that Beschreibungen der Materialien und Verfahren sind in der Regel zu kurz für die Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Wir präsentieren diese Methode im Video-Format mit dem Ziel, die leichter Replikation ermöglicht. Wir beschreiben auch die Technik leicht erhältlich und preisgünstige Ausrüstung. Wir wenden uns an gemeinsamen Vorbehalte, die oft nicht gemeldet werden, die Forschung verlangsamen, wenn eine neue und komplexe Technik zu optimieren.

Protokoll

Alle Tiere wurden so human wie möglich behandelt. Die Insekten wurden als Puppen aus Costa Rica Entomologischen Versorgung, Costa Rica verschifft.

1. Heliconius Pupae Pflege

  1. Hang alle pupae beabstandet 2-3 cm voneinander entfernt in einer befeuchteten Kammer unter Verwendung von Insektenstifte.
  2. Nach dem Schlüpfen, erlauben Flügel Schmetterlinge in einer befeuchteten Kammer mindestens 1 Tag am Leben zu trocknen dann halten für und füttern täglich eine verdünnte Lösung Honig vor der Aufnahme.
    1. Verdünnen Honig mit Wasser auf etwa 20% Honiglösung nach Volumen, und gießen Sie in eine flache Petrischale.
    2. Bringen Sie einzelne Schmetterlinge auf der Petrischale, eins nach dem anderen. Bei der Lösung mit ihren vorderen tarsi zu berühren, werden die Schmetterlinge automatisch ihre Rüssel verlängern und trinken aus der Petrischale. Wenn ihr Rüssel nicht automatisch verlängert wird, sollte Zange die Rüssel herauszuziehen und es in die Honiglösung einzuführen.

2. Optische Spur, Kalibrierung und Mes-ement of Experimental Lichtbedingungen

  1. Legen Sie eine 150 W Xenon-Bogenlampe mit Gehäuse und Universal-Netzteil und einem angeschlossenen Kondensator Linsenanordnung an einem Ende einer Tabelle mindestens einen Meter lang helles weißes Licht liefern.
    ACHTUNG: Xenonbogenlampen erzeugen extrem helles Licht mit einer starken UV-Intensitäten. Schutzbrillen sollten zu jeder Zeit getragen werden und sollte die Lampe vom Hersteller als gerichtet verwendet werden Ansammlung von Ozon durch die Wechselwirkung von UV-Licht mit Luftsauerstoff zu verhindern.
  2. Stellen Sie eine optische Spur einen Meter in der Länge für das austretende Licht der Gehäuseanordnung zu passieren durch (Abbildung 1).
    1. In der folgenden Reihenfolge auf der optischen Spur mit ungefähren Abständen: 1) ein konvexer Siliciumdioxid oder Quarzlinse 40 cm von dem Kondensor Baugruppe, 2) ein neutrales Dichtefilter Rad (ohne Filter derzeit im Lichtweg) 22 cm weiter entlang die Spur, 3) eine Blende mit Antriebseinheit 14 cm von der ND-Filters, 4) eine konkave Siliciumdioxid oder Quarzlinse unmittelbar benachbart nach dem Verschluss und 5) eine kollimierende Strahlsonde 6 cm weiter entlang dem entfernten Ende der Spur.
    2. Affix eine 600 & mgr; m Durchmesser Glasfaserkabel an die kollimierenden Strahlsonde.
      Hinweis: Je nach Lichtintensität, eine 5-10 mm Durchmesser Glasfaserkabel erforderlich sein kann, genug Licht, um andere Preps zu liefern und kann für diese ersetzt werden.
    3. Stellen Sie den Abstand, Höhe und Winkel jedes optischen Elements, so dass der Lichtstrahl austritt, die Montage an der höchsten Intensität möglich ist.
    4. Als optische Spurelemente mit verschiedenen Anwendungen unterscheiden sich geringfügig können, stellen Sie sicher, dass alle Elemente Licht im UV-A- und sichtbaren Bereich (315-700 nm) übertragen.
  3. Sobald die optische Spur zusammengesetzt ist, messen das Licht, das das Setup durchläuft unter Verwendung eines Spektrometers. Kalibrieren Sie das Spektrometer zunächst eine Kalibrierung Lampe mit einem bekannten Spektrum mit und der Software des Herstellers.
    Hinweis: Wir beschreiben die Produkte von Ocean Optics für Klarheit mit eingerichtet , jedoch unter anderer Hersteller (zB Avantes) verkaufen vergleichbare Produkte.
    1. Schalten Sie die Wolfram Kalibrierlampe mindestens 45 Minuten vor der Messung.
    2. So kalibrieren, schließen Sie das Spektrometer über USB an einen Computer mit der dazugehörigen Software installiert ist. Dann schließen Sie das Spektrometer an der Wolfram Kalibrierlampe über einen UV-sichtbaren Sende Kosinuskorrektor.
    3. Wählen Sie "Neu Absolute Einstrahlungsmessung" von der Registerkarte "Datei", und wählen Sie das Spektrometer als "Quelle".
    4. Folgen Sie den Anweisungen, um eine neue Kalibrierung "cal" Datei zu erstellen. Wenn Sie gefragt werden, legen Sie die zur Verfügung gestellten Daten-Datei für das bekannte Spektrum der Lampe Wolfram Kalibrierung im Bereich des sichtbaren Lichts (300-800 nm) in die Software, die automatisch das korrigierte Spektrum des Spektrometers Ausgabe berechnet.
    5. Speichern Sie die Kalibrierungsdatei. Laden Sie diese Datei, wenn initializing die Software für alle zukünftigen Messungen von Lichtspektren das Spektrometer.
  4. Sobald das Spektrometer kalibriert ist, verwenden diese die Lichtspektren aus dem Versuchsaufbau aufzunehmen. Jenseits, wenn die Software geöffnet wird, wählen Sie "Neu Absolute Einstrahlungsmessung" und laden Sie die zuvor gespeicherte Kalibrierungsdatei. Nehmen Sie als nächstes ein Dunkelspektrum durch das gesamte Licht zum Spektrometer zu blockieren.
    1. Mit dem Spektrometer zur Zeit die gewünschten experimentellen Lichtbedingungen zu messen, stellen Sie die Integrationszeit (4 ms), Scans zu mitteln (5) und Boxcar Breite (5), so wird das Spektrum richtig skaliert und geglättet. Halten Sie die Einstellungen die gleichen für alle spektralen Messungen, so dass die Lichtintensitäten von verschiedenen Messungen verglichen werden können.
  5. Messung der Spektren für ungedämpft weißes Licht, für alle neutralen Dichtefilter während der Experimente verwendet werden, und für jede Bandpaß - Interferenzfilter (Abbildung 2).
    1. Measure des Weißlichtspektrums ohne Filter in dem Lichtweg durch das freie Ende des Glasfaserkabels von dem Schritt 2.2.2 zum Spektrometer zu befestigen. Mit der Kalibrierungsdatei aus Schritt geladen 2.3, speichern Sie die weiße Lichtspektrum mit der Software des Spektrometers als Textdatei.
      Hinweis: Spectra gespeichert als Textdateien, die Wellenlängenliste (x-Koordinaten) in einer Spalte und der Intensität des Lichts (y-Koordinaten) in der zweiten Spalte, so daß die Daten in eine Tabelle für Schritt 2.6 geladen werden kann.
    2. Mit dem gleichen Setup wie in Schritt 2.5.1, notieren Sie das Spektrum von jeder optischen Dichte (OD) (0-3,5 OD) während der Experimente, die von der Neutraldichte Drehfilter (ND) Rad in der optischen Spur, und speichern Sie die Textdatei für jeder OD.
    3. Mit dem gleichen Setup wie in Schritt 2.5.1, legen Sie die 10-nm-Interferenz halbe Bandbreite eins nach dem anderen in den Lichtweg filtert und das Spektrum für jeden Filter beobachtet aufzeichnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede der 41 verschiedenen Interferenzfiltern with peak Lässigkeiten beabstandet alle 10 nm von 300 bis 700 nm. Filter weiter voneinander entfernt (20 nm) sind akzeptabel für die meisten Anwendungen (für Spektren, siehe Abbildung 2).
  6. Korrekte für Unterschiede in der Intensität von Licht, wenn Interferenzfilter im Lichtweg platziert. Jedes Interferenzfilter ermöglicht eine unterschiedliche Anzahl an Photonen zu passieren, und die geringe Übertragung einiger Filter macht es schwierig Intensität weiter zu dämpfen, so daß alle Filter die gleiche Anzahl von Photonen ermöglichen.
    1. Um die relative Intensität (I) für jede 10 nm Bandbreite Interferenzfilter zu berechnen, lösen für I in dem Ausdruck I = T / sec, wobei T die Fläche unter der Spektralkurve jede 10 nm Interferenzfilter (von 2.5.3) und s ist die maximale absolute Bestrahlungsstärke (y - Wert der gespeicherten Textdatei von 2.5.1) von weißem Licht bei der Spitzenwellenlänge jedes Filters (Abbildung 2 für ein Beispiel bei 520 nm) Vgl.
    2. Teilen Sie alle berechneten Intensities vom max Intensitätswert in 2.6.1 berechnet ein und nehmen die Reziproke der relativen normierten Werte für die Verwendung als Korrekturfaktor auf die Roh-Empfindlichkeit bei jeder Wellenlänge (siehe Schritt 6.4) angewendet zu normieren.
  7. Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.6 nur einmal vor einer Reihe von Experimenten. Im Laufe eines Experiments in regelmäßigen Abständen die absolute Bestrahlungsstärke der Xenon-Bogenlampe unter hellem Licht und Neutraldichtefilter, notieren Sie die Intensität des Lichtreiz, um sicherzustellen, ändert sich nicht.
  8. Im Verlauf eines Experiments, wenn eine zelluläre Antwort auf Licht, das durch den Interferenzfilter übertragen die maximale Antwortamplitude nähert, verwenden, um die ND-Filter, das Signal zu dämpfen. Wenn ND-Filter bei einem Experiment verwendet werden, entfällt die entsprechende Abnahme der Intensität bei der Berechnung der spektralen Empfindlichkeit.
  9. Richten Sie optische Spur, Kalibrierung und Filter Tage oder Wochen vor Experimenten beginnen. Halten Sie Filterabgedeckt Staubansammlung zu verhindern.

3. Aufnahmegerät einrichten

  1. Führen Sie das gleiche Glasfaserkabel für die Kalibrierung durch einen Faraday - Käfig verwendet und Montage auf einem goniometrisches Gerät wie ein Kardan Armumfang (siehe Abbildung 3 für Diagramm). Das Kabel wird etwa 10 cm vom Auge weg von der Probe sein.
  2. Legen Sie eine Metallstufe auf einem schwingungs isoliert Tabelle mit einem Elektrodenhalter montiert direkt über der Bühne unter der Kontrolle eines Mikromanipulator (Abbildung 4). Legen Sie den Arm Kardan so dass der Kopf des Probe in der Mitte der Kugel ist durch den Arm des Drehbewegung erzeugt.
  3. Verwendung eines intrazellulären Vorverstärker-System, das einen Verstärker wird (außerhalb des Faraday-Käfig) und Vorverstärker (heads, in der Nähe der prep innerhalb des Faraday-Käfig) montieren heads über der Metall Stadium, in dem die Probe platziert umfasst.
    1. Schließen Sie ein Koaxialkabel an die heads über einBNC-Anschluss. Split offen nur die Spitze am anderen Ende des Koaxial-Kabels und trennen den äußeren Metallmantel des Kabels aus dem inneren Draht.
    2. Löten Sie die äußere Hülle (auf Massepotential gehalten) mit einem Ende eines isolierten Kupferdraht mit einer Krokodilklemme am anderen Ende. Dieser Krokodilklemme wird an der Metallreferenzelektrode auf der Probenplattform (Schritt 5.1.4) befestigen.
    3. Löten Sie den inneren Draht des Koaxialkabels zu einem dünnen Silberdraht, wie der Aufzeichnungselektrode zu dienen. Dieser Draht sollte dünn genug sein, um in die Lösung gefüllte Glaselektrode in Schritt 5.2.3 zugeführt werden.
  4. Legen Sie ein Stereomikroskop an einem Schwenkarm und Basis auf der Holzbank außerhalb des Faraday-Käfig, so dass er geschwenkt werden kann in der Elektrode in das Auge zu senken und schwang wieder heraus, sobald die Elektrode im Auge ist.
  5. Stellen Sie sicher, alles Metall im Inneren der Faraday-Käfig ordnungsgemäß geerdet ist.
  6. Außerhalb des Faradayschen Käfigs, befestigen Sie den preamplifer ist mit dem Eingang eines 50-60 Hz Rauschverminderers (optional), und verbinden Sie den Ausgang an einen Kanal eines Oszilloskops über einen BNC-T-Adapter verwenden.
  7. Mit dem anderen Ende des T-Adapter, schließen Sie das Signal durch das Oszilloskop an einen Kanal der Hardware übergeben. Befestigen diese Hardware an einen Computer durch ein USB-Kabel, das Antworten mit dem Vorverstärker aufgezeichnet erlauben wird, von der Software auf dem Computer gelesen werden.
  8. Bringen Sie den Verschluss-Treiber von der optischen Spur auf den zweiten Kanal des Oszilloskops ein anderes T-Adapter und schließen Sie diese an einen Impulsgenerator, der die Frequenz und die Dauer der Lichtblitze kontrollieren wird für das Auge geliefert (Schritt 5.5).
    Hinweis: Setup des Rigs selbst sollte nur einmal durchgeführt werden müssen. Brechen Sie hier, bis sie bereit Aufnahmen zu beginnen.

4. Vorbereitung auf den Tag der Aufnahme

  1. Schalten Sie die Xenon-Lampe mindestens 45 Minuten vor dem Experiment und schalten Sie den Glasmikroelektroden-Abzieher mindestens 30 Minuten vor dem pulling Glaselektroden.
  2. Schalten Sie alle Aufzeichnungsgeräte (Shutter, Verstärker, Schalldämpfer, Impulsgenerator, Oszilloskop und Datenerfassungshardware) und stellen Sie sicher, dass der Verschluss standardmäßig geschlossen wird, so dass keine Licht durch das Glasfaserkabel.
  3. Ziehen feinen Borosilikat (oder Aluminiumsilikat) Glasmikroelektroden (100-250 MOhm Widerstand ist ideal) mit einer Glasmikroelektroden-Abzieher. Verwenden Glaselektroden innerhalb von nur wenigen Stunden von gezogen.
  4. Verfüllung der Elektroden mit 3 M Kaliumchlorid (KCl). Beachten Sie, dass diese Lösung entsprechend modifiziert werden , um die Bedürfnisse der Forscher, zum Beispiel Injektion färben.

5. Specimen Prep und Aufnahmeverfahren

  1. Bereiten Sie die Probe
    1. Affix eine individuelle Schmetterling in einem kleinen Plastikbehälter mit heißem Wachs so der Kopf von einem Ende des Rohres unbeweglich und vorstehende ist. Wax nach unten Rüssel, Antennen und Flügel (Abbildung 5).
    2. Halten Sie ter mit einem trockenen Stück Wachs Bauch und das Rohr, indem ein nasses Gewebe im Inneren des Rohres hinter dem Bauch befeuchtete halten. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig unbeweglich ist.
    3. Montieren Sie das Rohr ein kleines Stück Wachs auf eine kleine Plattform mit einem Kugelgelenk mit, die zu einer magnetischen Basis befestigt ist.
    4. Unter einem Binokular, legen Sie eine Silberdraht von 0,125 mm Durchmesser in den Kopf über die Mundwerkzeuge als Referenzelektrode verwendet werden. Vor dem Versuch, den Draht fixieren dauerhaft an der Plattform in der Weise, dass der Kupferdraht in Schritt 3.3.2 es aufstecken kann, sobald die Plattform, auf die Bühne zur Aufnahme platziert ist.
    5. Sobald die Referenzelektrode in einer geeigneten Position ist, kann es durch schnelles Schmelzen und anschließendes Abkühlen Wachs um den Draht an Ort und Stelle gehalten werden.
    6. eine zerbrechliche Kohlenstoffstahl Rasierklinge, Griffteil des Messers mit einem Messerhalter verwenden und ein kleines Stück abbrechen zum Schneiden der Hornhaut zu verwenden.
    7. Schneiden Sie ein kleines Loch (~ 10 ommatidiein im Durchmesser) in der linken Hornhaut mit der Rasierklinge und versiegeln Sie das Loch mit Vaseline Austrocknungs zu verhindern.
  2. Sobald die Hornhaut geschnitten wird, legen Sie die Aufzeichnungselektrode in das Auge so schnell wie möglich, weil Hämolymphe im Auge schnell aushärtet und machen es unmöglich, eine Elektrode einzufügen. Wenn möglich, die Zerlegung in die Anlage durchführen, wo die Aufnahme stattfinden wird.
    Hinweis: Vaseline sollte nicht auf den Rest des Auges verschmiert werden, da dies die Optik defokussieren.
    1. Wenn nicht bereits auf der Bühne, legen Sie die montierte Probe und die Plattform auf die Bühne in der Aufnahme rig. Schließen Sie den headsErdungsDraht aus Schritt 3.3.2 an die Referenzelektrode auf der Probenplattform mit Krokodilklemmen.
      Hinweis: Wenn möglich, einen roten Filter verwenden, um das Tier zu beleuchten.
    2. Verwenden Sie eine Lichtquelle mit Schwanenhals-Anhänge kurz auf die Probe unter einem Stereoskop Licht, während die Aufzeichnungselektrode in das Auge zu senken.
    3. Imsert das auf die heads aus Schritt 3.3.3 in die KCl-Lösung in der Rückseite eines Glasmikroelektrode verbunden Silberdraht. Montieren Sie die Glaselektrode auf dem Elektrodenhalter.
    4. Stellen Sie den Elektrodenhalter, so dass die Mikroelektroden direkt über dem Loch ist zuvor in der Hornhaut geschnitten, etwa einen Millimeter über der Hornhaut. Senken die Mikroelektrode in das Auge unter Verwendung des Mikromanipulators, bis eine Schaltung vervollständigt ist, wie durch eine große Änderung im Potential (mV) auf dem Oszilloskop dargestellt.
  3. Einmal im Auge, schwingen die Stereoskop außerhalb des Faraday'schen Käfigs, und schalten Sie die Lichtquelle Beleuchtung der Probe ab. Der Raum sollte dunkel gehalten werden, so dass das Auge dunkel angepasst wird.
  4. Den Widerstand der Elektrode durch einen 1 nA Strom, der von dem Verstärker Anwendung und der Feststellung der Spannungsänderung. Der Widerstand sollte im Bereich zwischen 100 bis 250 M & Omega; typischerweise. Höhere Widerstände sind kennzeichnend für Verstopfung oder Verbiegen der Elektrode und niedrige Widerstände von elektrOde Bruch.
  5. Aktivieren Sie den Pulsgenerator so öffnet sich der Verschluss einen Lichtblitz mit einer 50 ms Dauer so dass alle 0,5 Sekunden, und lassen Sie es zu blinken für die Dauer des Experiments fortzusetzen.
    1. Stellen Sie den Impulsgenerator, so dass es Blitze von bis zu 50 ms Dauer ermöglicht. Diese Dauer und 0,5 Sekunden Pause zwischen den Blitzen hält die Probe so nah dunkel wie möglich während des Experiments angepasst. Fünfzig ms liegt in der Nähe der kürzeste Blitzdauer, die die gleiche Amplitude in Reaktion als mehr Abbrennzeiten entlocken wird.
    2. Re-measure Antworten sowohl am Anfang und am Ende des Experiments (Schritt 5.16). Im Laufe von etwa 20 Minuten ein Experiment diese Blitzeinstellungen nicht verschlechtern die Reaktion über die Zeit. Verschiedene Preps können Anpassungen an diese Flash-Einstellungen erforderlich.
  6. Positionieren der Cardan Arm, so daß die Lichtwellenleiter in Richtung auf das Auge gerichtet.
  7. Überprüfen Sie das Oszilloskop für Spannungsänderung mit jedem Lichtblitz.Eine negative Änderung der Spannung bedeutet, dass die Elektrode eine Zelle noch nicht eingetreten ist.
  8. Bewegen Sie den Cardan Arm um die Probe, bis er in einem Winkel zu dem Auge positioniert ist, an dem es eine maximale Spannungsantwort ist.
  9. Drehen Sie den Mikromanipulator hin und her, so dass sehr kleine vertikale Bewegungen der Elektrode in beide Richtungen, während leicht die Basis des Elektrodenhalter tippen oder die Buzz-Funktion auf dem Vorverstärker verwenden. Weiter machen kleine Anpassungen , bis eine depolarisierende Lichtverhalten auf dem Oszilloskop angezeigt (Abbildung 6).
  10. Stellen Sie die Kardan-Arm wieder um den Einfallswinkel zu finden, wo ein Lichtblitz die größte depolarisierende Signal erzeugt. Bilden kleine Anpassungen mit dem Mikromanipulator und verwenden, um die Summen-Funktion auf den Verstärker wie erforderlich um sicherzustellen, dass die Elektrode stabil in die Zelle aufnimmt und daß es in der Zelle für das gesamte Experiment bleiben wird (siehe Schritt 5.11).
  11. Sobald das Setup stabil ist, beginnen Recording. Eine stabile Aufzeichnung sollte geringem Hintergrundrauschen und einen gleichbleibend großen depolarisierenden Reaktion wenig in Ruhe zu keiner Veränderung Potential (mindestens 10: 1-Signal-Rausch-Verhältnis).
    1. Führen Sie die Software auf dem Computer, und beginnen ein "neues Experiment", das ein Pop-up-Fenster mit vier Kanälen geöffnet.
    2. Stellen Sie die Spannungsskala in der oberen rechten Ecke des Software-Fensters auf 500 mV. Der erste Kanal wird die Antworten von der Elektrode in Echtzeit aufgezeichnet anzuzeigen, während der zweite Kanal, der die Rechteckwelle von dem Funktionsgenerator erzeugten aufzeichnen wird, wenn das Signal auf die Datenerfassungshardware über dem Oszilloskop zugeführt wird zeigt, wenn der Verschluss geöffnet ist . Die beiden anderen Kanäle sind nicht benötigte.
    3. Klicken Sie auf "Start" in der unteren rechten Ecke der Aufnahme zu beginnen, und lassen Sie die Software für die Dauer des Experiments zu laufen. Stellen Sie den Zoom der x (Zeit) und y (Spannung) Achsen so, dass die Antworten klar sind.
  12. Zuerst mit weißem Licht, notieren bei 3,5 OD (etwa 5-10 sec) bis 10 Einzelantworten mit dem ND-Filter Rad nach oben.
  13. Nächster Datensatz die gleiche Anzahl von Antworten bei 3,3 OD, dann 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, usw. in jeder Kombination bis 0.0 OD. Diese Antwortamplituden auf die ND-Filter-Serie liefert die Antwort-log Intensitätskurve in Abschnitt 6. Wenn Bleichen auftritt, weniger Blitze helle Reize im Verlauf des Experiments verwenden.
  14. Aufzeichnen der Antwort der Zelle auf alle Wellenlängen, die Interferenzfilter verwenden.
    1. Zuerst finden die Spitzenwellenlänge. Ohne ND-Filter im Lichtweg (0,0 OD), legen Sie einen Filter UV-Sende im Lichtweg und kurz auf die Antwortamplitude beobachten. Wiederholen Sie mit einem blauen Sendefilter, einem grünen Sendefilter und einem roten Sendefilter, die eine Vorstellung davon geben, sollte, wo die Spitzenantwort sein wird.
    2. Verwenden Sie Filter bei etwa 350, 450, 550, 650 nm den allgemeinen Bereich der Spitzenempfindlichkeit zu finden inSchritt 5.14.1. Die genaue Wellenlänge keine Rolle spielt in dieser ersten Suchphase, da alle Wellenlängen wird im nächsten Schritt aufgenommen werden. Wenn Schätzungen der Spitzen Empfindlichkeiten bestehen, oder sie wurden bereits aufgenommen, die Verwendung bekannter Wellenlängen, um schnell die Spitzenantwort zu identifizieren.
    3. Sobald die Spitzenantwort oder nahe daran erkannt wird, Rekord bei dieser Wellenlänge für 10 Antworten (ca. 5 sec).
    4. Nachdem bei der Wellenlänge der Spitzenempfindlichkeit der Aufzeichnung Aufzeichnung mit den anderen Interferenzfilter, 300 bis 700 nm bei 10 nm-Schritten. Starten Sie von der Spitze und Schritt aus in Richtung einer längeren oder kürzeren Wellenlängen durch die Filter aus dem Lichtweg Swapping eins nach dem anderen (zB wenn die Spitzenreaktion bei 520 nm, Rekord Antworten bei dieser Wellenlänge zuerst, dann 510 nm, gefolgt von 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, und so weiter, bis keine keine Antwort).
    5. Lassen Sie für bis zu 10 Antworten pro Filter (5 sec pro Stück). Wenn Interferenzfilter austauschen, damit die Zelle bzw.ond auf 1-2 Blitze Weißlicht ohne Filter im Lichtweg, die hilfreich ist, zu überwachen, ob die Peak-Antwort über die Zeit verschlechtert. Reduzieren Sie die Anzahl der Antworten oder der OD erhöhen, wenn Bleichen auftritt.
  15. Wenn die Antwort im Rahmen einer Interferenzfilter zu nahe bei 0 OD auf die maximale Reaktion unter weißem Licht ist, dann mit ND-Filter dämpfen. Die Interferenzfilter und die Größe des Glasfaserkabels in diesem Experiment verwendet dämpfen stark die Intensität des Lichts, und so ND-Filter werden in der Regel nicht benötigt.
  16. Wenn die Aufnahme stabil bleibt, erneut aufzeichnen Wellenlängen um die Spitzenantwort, die zur Bestätigung der vorherigen Antwort Amplituden als pseudoreplicate dient und hilft, die Reaktion zu gewährleisten, hat sich nicht im Laufe der Zeit abgebaut werden. Sobald alle Wellenlängen aufgenommen, erneut aufzeichnen die Antworten unter der ND-Serie, wie in Schritt 5.12.
  17. Sobald die Aufnahme beendet ist, klicken "Stop" auf der Software, und die Aufzeichnung für die Analyse zu speichern.
  18. Nach einem Experiment, opfern, um die einzelnen durch Einfrieren oder mehrere Minuten Kühlung durch schnell folgte dem Kopf und Zerkleinern des Thorax Trennen.
  19. Fahren Sie alle Geräte nach unten. Brechen Sie hier notwendig, wenn vor der Analyse zu tun.

6. Spektrale Empfindlichkeit Analyse

  1. Mit der Software verwendet, um rohe Antworten aufzuzeichnen, die Berechnung der mittleren Antwort Amplitude von 10 einzelnen Antworten für jeden Filter der ND-Serie und für jeden Interferenzfilter.
  2. Erstellen Sie eine Antwort-log - Intensität (VlogI) Funktion aus dem ND - Filter Serie aufgezeichnet in den Schritten 5,12-5,13 (Abbildung 7). Dies geschieht durch Auftragung der logarithmischen Intensitätseinheiten (OD) auf der X-Achse, und die Reaktion auf jede Intensität auf der y-Achse.
    1. Der spektralen Empfindlichkeit der Zelle bei unterschiedlichen Wellenlängen abgeleitet werden, passen typischerweise die Naka-Rushton-Gleichung an die Daten aus Schritt 6.2 und diese Gleichung verwenden, um experimentell erhaltenen spektralen Reaktionen verschiedener Wellenlängen t betreffeno relativen Photonen erforderlich, dass die Reaktion bei einer konstanten Wellenlänge zu entlocken (in diesem Fall weißes Licht).
      Hinweis: Die Naka-Rushton - Gleichung ist: V / V max = I n / (I n + K n), wobei I die Reizstärke ist, V ist die Antwortamplitude, V max die maximale Antwortamplitude, ist K der Stimulus Intensität geben ½ V max und n die exponentiellen Steigung. Verschiedene Verfahren können diese Gleichung verwendet werden, um den VlogI Daten anzupassen, einschließlich der Kurvenanpassungssoftware oder Codebasierte statistische Pakete.
    2. Um die Naka-Rushton Gleichung mit einfachen Berechnungen und ein Tabellenkalkulationsprogramm passen, transformieren die VlogI Antwortdaten für jeden Reizintensität: log [(V max / V) - 1]. Führen Sie anschließend die lineare Regression auf den transformierten Daten die Gleichung der Linie der besten Passform zu erhalten.
      Hinweis: V max muss größer sein als alle gemessenen Antworten; dies konsistent zu halten, schätzt diese Methode V max als 1% greater als der höchste gemessene Antwort.
    3. Aus der Gleichung der Regressionsgeraden, schätzen den Exponenten (n) durch die negative Steigung nehmen, und log (K) = y-Schnitt / n.
  3. Sobald die Parameter für V max, n, und K wurden geschätzt, bestimmen die relative Anzahl von Photonen bei jeder Wellenlänge der spektralen Antwort der Zelle hervorzurufen , erforderlich von der gemessenen spektralen Empfindlichkeit bei einer gegebenen Wellenlänge als (V) einstecken und Lösung für I.
  4. Multiplizieren die berechnete Reizintensität (I) aus Schritt 6.3 mit dem Korrekturfaktor für jeden Interferenzfilter (aus Schritt 2.4.3) bei jeder Wellenlänge.
  5. Um die Empfindlichkeit müssen alle Intensitäten der Kurve V log-I in Beziehung gesetzt werden, damit sie verglichen werden können. Tun Sie dies , indem jede Wellenlänge Intensität bezüglich V max oder K, berechnet in Schritt 6.2.3 bis ½.
    1. Subtrahieren jede korrigierte Wellenlänge Intensität (Schritt 6.4) von K.
    2. Dann gilt für jede Wellenlänge Intensität, fügen Sie diese "Abstand von K "Wert K und multiplizieren mit (-1).
    3. bringen Weiter alle Datenpunkte positive durch den Absolutwert der niedrigsten Datenpunkt das Hinzufügen in der Reihe jeder Wellenlänge.
  6. Finden Empfindlichkeit bei jeder Wellenlänge, die durch den Kehrwert aller neu berechneten Intensitäten von Schritt 6.5.1 nimmt. Transformieren der Daten so, dass die Empfindlichkeitsspektrum zwischen 0 und 1 fällt.
  7. Nachdem er von mehr als einer Zelle des gleichen Typs Durchschnitt Aufzeichnung der endgültigen Antworten und Grundstück mit Standardfehlerbalken oder 95% Konfidenzintervall (Abbildung 8).

Ergebnisse

Für viele Elemente der Aufnahme - Setup, eine schriftliche Beschreibung liefert nicht genügend Detail. 1 ist eine schematische Darstellung der Komponenten in der gesamten Aufnahme - Setup beteiligt. In Figur 2 Spektren werden für weißes Licht und jeden Interferenzfilter ein Gefühl dafür , warum ein Korrekturfaktor benötigt wird, aufgetragen , und was benötigt wird , um diese Korrektur zu berechnen. 3 zeigt Bilder und ein Diagramm des Cardan Arm , die f?...

Diskussion

Die intrazelluläre Aufnahme kann eine schwierige Technik, aufgrund der vielen technischen Schritte zu meistern beteiligt. Für eine erfolgreiche Experimente müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, eine richtig schwingungsisolierten Tisch zu haben, an dem das Experiment durchgeführt wird. Viele Forscher verwenden Luft-Tabellen, die vollständig die Tischplatte von der Basis trennen, überlegene Schwingungsisolierung zu geben. Unser Setup beinhaltet einen dicken Marmortisch mit ein...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken dem späten Rudy Limburg für die Kardan Armumfang Herstellung, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, und Raju Metherate uns Ausrüstung für die Kreditvergabe, und Almut Kelber und Kentaro Arikawa, für Ermutigung. Diese Arbeit wurde von einem National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship an KJM und NSF Zuschuss IOS-1257627 ADB unterstützt

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Butterfly pupaeSeveral local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinderAny chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite HoneyTrader Joe'sAny honey or sucrose solution will work
Xenon Arc LampOriel Instruments66003Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x)Oriel Instruments11647Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
Six Position Filter Wheel, x2Newport CorporationFW1X6
Filter Wheel Mount HubNewport CorporationFWM
Concave silica lens, 25.4 mmNewport CorporationSPC034
Collimator holderNewport Corporation77612
Collimating beam probeNewport Corporation77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard FerruleNewport Corporation77670This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cableOriel Instruments78367Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unitUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm Edmund Optics67749
Interference bandpass filter, 310 nm Edmund Optics67752
Interference bandpass filter, 320 nm Edmund Optics67754
Interference bandpass filter, 330 nm Edmund Optics67756
Interference bandpass filter, 340 nm Edmund Optics65614
Interference bandpass filter, 350 nm Edmund Optics67757
Interference bandpass filter, 360 nm Edmund Optics67760
Interference bandpass filter, 370 nm Edmund Optics67761
Interference bandpass filter, 380 nm Edmund Optics67762
Interference bandpass filter, 390 nm Edmund Optics67763
Interference bandpass filter, 400 nm Edmund Optics65732
Interference bandpass filter, 410 nm Edmund Optics65619
Interference bandpass filter, 420 nm Edmund Optics65621
Interference bandpass filter, 430 nm Edmund Optics65622
Interference bandpass filter, 440 nm Edmund Optics67764
Interference bandpass filter, 450 nm Edmund Optics65625
Interference bandpass filter, 460 nm Edmund Optics67765
Interference bandpass filter, 470 nm Edmund Optics65629
Interference bandpass filter, 480 nm Edmund Optics65630
Interference bandpass filter, 492 nm Edmund Optics65633
Interference bandpass filter, 500 nm Edmund Optics65634
Interference bandpass filter, 510 nm Edmund Optics65637
Interference bandpass filter, 520 nm Edmund Optics65639
Interference bandpass filter, 532 nm Edmund Optics65640
Interference bandpass filter, 540 nm Edmund Optics65642
Interference bandpass filter, 550 nm Edmund Optics65644
Interference bandpass filter, 560 nm Edmund Optics67766
Interference bandpass filter, 570 nm Edmund Optics67767
Interference bandpass filter, 580 nm Edmund Optics65646
Interference bandpass filter, 589 nm Edmund Optics65647
Interference bandpass filter, 600 nm Edmund Optics65648
Interference bandpass filter, 610 nm Edmund Optics65649
Interference bandpass filter, 620 nm Edmund Optics65650
Interference bandpass filter, 632 nm Edmund Optics65651
Interference bandpass filter, 640 nm Edmund Optics65653
Interference bandpass filter, 650 nm Edmund Optics65655
Interference bandpass filter, 660 nm Edmund Optics67769
Interference bandpass filter, 671 nm Edmund Optics65657
Interference bandpass filter, 680 nm Edmund Optics67770
Interference bandpass filter, 690 nm Edmund Optics65659
Interference bandpass filter, 700 nm Edmund Optics67771
Faraday cageAny metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnificationWild HeerbruggWild M5Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy baseMcBain InstrumentsAny heavy base with arm will do
Cardan armCustom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminatorDolan-JennerMI-150For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guideDolan-JennerEEG 2823Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden tableHole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sandcustom built, any box with sand
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameterWorld Precision InstrumentsAGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstageDagan CorporationIX2-700
Humbug Noise reducerQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probeEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Labchart softwareADI instrumentsChart 5
10 MHz Pulse GeneratorBK Precision4030
Glass pipette pullerSutter InstrumentsP-87
Borosillicate glass capillaries with filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering IronWeller
Platform with ball-and-socket magnetic baseHama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor bladeElectron Microscopy Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft

Referenzen

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