عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

Summary

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Introduction

وتستند معظم الدراسات الحالية من الخلية والبيولوجيا الجزيئية على المعدلات السكانية. ومع ذلك، قد يكون حجب الأحداث البيولوجية الهامة من قبل هذه التحليلات التقليدية القائمة على السكان منذ السكان البسيط يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في العمليات البيولوجية ونتيجة المرض. فهم التعبير الجيني في السكان غير متجانسة على مستوى خلية واحدة يمكن (وديه) يؤدي إلى رؤى البيولوجية والسريرية ذات الصلة ^1،2. من تهم دراسات التطور الجنيني، في عدد أكبر من السكان من الخلايا، الخلايا الاولية غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا، مما يجعلها صعبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في التعبير الجيني التي تبدأ في نهاية المطاف القرارات مصير الخلية ^3. وبالمثل، قد يكون نوع خلية واحدة ملامح التعبير المختلفة ردا على المكروية ^4. على سبيل المثال، الخلايا البطانية المقيمين في نفس الجهاز أو في أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، الشريان الأورطي أو الكلى) يحمل تجانس كبير على الرغم من اشتراكهم morp المشتركميزات hological وظيفية ^5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا السرطانية ملء الورم نفسه أيضا متفاوتة التشكيلات الجزيئية أو الطفرات على مستوى خلية واحدة ^6.

في النظم نموذج، transcriptomics في الخلايا واحد وقد حددت بنجاح السكان الخلية الجديدة، تتميز الدول الوسيطة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا، وكشفت الاستجابات الخلوية التفاضلية للمنبهات ^7،8،9. قد تم ملثمين مثل هذه الأفكار في الدراسات السكانية التقليدية. الأجنة الزرد هي مصدر كبير غير المستغلة الجذعية، السلف، والتفريق خلايا لاستكشاف الأسئلة من عدم التجانس وحيد الخلية والتنظيم الجزيئي الهويات الخلوية خلال التنمية. على نمطية للغاية، خارج الحي التنمية وسهولة التلاعب الجيني جعلها نظام نموذجا ممتازا لهذا النهج ^10،11. على وجه التحديد، يشكل قيدا رئيسيا على تفسير خلية واحدة جنرالبيانات البريد التعبير هو أن تحديد موثوق للدول خلية متوسطة جديدة خلال التنمية يتطلب توقيت دقيق للغاية لجمع الأنسجة ^9. وهذا أمر ضروري لضمان عدم التجانس بين الخلايا والقبض يمثل عدم التجانس داخل الأنسجة عند نقطة زمنية واحدة بدلا من عدم التجانس في التعبير الجيني التي قدمها تعتمد على سن تمايز الخلايا. بالمقارنة مع الفئران، تطور الجنين الزرد قد تكون متزامنة بدقة عبر عدد كبير من الأجنة ^12. بالإضافة إلى ذلك، مع أحجام مخلب كبير والأجنة الزرد يمكن استخدامها كمصدر وفرة من الخلايا الجذعية والسلف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الخلايا من الأجنة الزرد والتقاط الخلايا واحدة باستخدام الدوائر المتكاملة على microfluidics (IFC) رقاقة وautoprep النظام المتوفرة تجاريا لQRT-PCR تحليل التعبير الجيني. هذا البروتوكول يمكن أن يكون للتحويل السريع إلى أي فحوصات عالية الإنتاجية المتنوعة بما في ذلك كلهالتسلسل Transcriptome على أن يسمح تحليل أكثر شمولا من عدم التجانس الخلوية ^13. كما أنها توفر العديد من المزايا لفحوصات الجينات التقليدية. بروتوكول العزلة خلية واحدة تعطي قابلية عالية بعد FACS، مما يقلل من نسبة الخلايا الشبهة التي تم تضمينها في التطبيقات المصب. باستخدام مؤسسة التمويل الدولية، الخلايا والقبض ويمكن ملاحظة مباشرة لتقييم معدلات القبض وتقييم صحة الخلية شكليا. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع في الأوساط البحثية الزرد، لا تتطلب سوى خط الأسماك المعدلة وراثيا وصفت والحصول على التكنولوجيات القبض على خلية ميكروفلويديك.

وكدليل على المبدأ، تم عزل الخلايا واحد مستمد من الأسلاف القلب واستولت على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية، ومن ثم تم قياس الوفرة النسبية للعلامات التمايز في القلب من قبل QRT-PCR. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية واحد يدل على أن الأسلاف القلب تتعايش مع اح بهمذرية ntiating. البصيرة المكتسبة من التنميط وحيدة الخلية من الأسلاف القلب قد تسلط الضوء على الاختلاف في أنماط التعبير الجيني بين الخلايا الاصلية القلب خلال تطوير الفقاريات، التي ربما تكون قد ملثمين في التحليلات التقليدية القائمة على السكان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتطلب هذا البروتوكول استخدام العيش، الزرد الكبار لإنتاج الأجنة. ويتم حصاد الأجنة لجمع الأنسجة. لا بد من الحصول على موافقة من مجالس المراجعة الأخلاقية المناسبة لإجراء هذه التجربة.

1. الحصول على أجنة نظموا

1. قبل يوم من التجربة، وإعداد صحي، الزرد الكبار للتربية. وضع رجل واحد وامرأة واحدة على طرفي نقيض من المفرق واضحا في أحواض التفريخ.
2. كرر 1.1 لأكبر عدد ممكن من الدبابات تربية كما اللازمة لإنتاج الجنين كافيا لتطبيق المصب. الحصول على أجنة من كل نوع الأسماك البرية والأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في نوع من الخلايا في المصالح.
   ملاحظة: عدد الأجنة اللازمة للتطبيقات المصب في خطوات 2-8 يعتمد على الوفرة النسبية للخلايا الفائدة عند نقطة زمنية من الفائدة. على الرغم من أن هذا قد تختلف من نوع من الخلايا، 200 الأجنة تنتج 2،000-5،000 خلايا فرزها عندما جملتعلمي اللغة اإلنكليزية من الفائدة تمثل <1.0٪ من مجموع الخلايا في 24 HPF (ساعة بعد الإخصاب).
3. في صباح اليوم التالي، وتغيير المياه في الخزان فتات الخبز عن طريق نقل الأسماك إلى خزان تربية جديدة وإزالة المفرق. إمالة دبابات على زاوية لتشجيع تربية.
4. جمع الأجنة مراحل.
   1. كل 15 دقيقة، وجمع الأجنة عن طريق نقل البالغين إلى خزان تربية الطازجة وتمرير البيض التي تركت وراءها من خلال مصفاة الشاي.
      ملاحظة: الأجنة الزرد تتطور بشكل متزامن عندما حافظت على كثافة ودرجات حرارة مماثلة.
   2. شطف البيض مع البيض المياه (0.21 جم / لتر أملاح المحيط الفوري في 1 لتر من الماء المقطر مزدوج) ونقل إلى طبق بتري. نقل طبق بتري إلى حاضنة الرطبة في 28.5 درجة مئوية مع دوران الهواء.
5. بعد ساعتين من جمع الماضي، المخصبة نوع والأجنة المتعددة الخلايا إلى 10 سم أطباق بتري وتقليل الكثافة إلى 50 الأجنة في الطبق. حدد الأجنة من واحد، 15نافذة زمنية دقيقة لجمع لتطبيق المصب. احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية.
   ملاحظة: على سبيل المثال، جمع الأجنة في الساعة 8:30، 8:45، 9:00، 9:15، 9:30، 9:45، 10:00 و 10:15. مقارنة عبر نقاط الوقت، إذا كان أكبر عدد من الأجنة المخصبة هم من براثن التي تم جمعها في الساعة 9:00، ثم استخدم فقط هذه الأجنة لتطبيقات المصب.

2. إعداد لتفكك خلية واحدة

1. ما يقرب من 30 دقيقة قبل نقطة زمنية من الفائدة (18 HPF) إزالة الأجنة من المشيمه الخاصة بهم يدويا مع ملقط غرامة.
2. جمع وتسمية التالية لكل حالة: اثنان 2 مل أنابيب microcentrifuge، واحدة من 40 ميكرومتر مصفاة الخلية، واحد 35 مم طبق ثقافة الخلية، واثنين من أنابيب FACS تصدرت مع مصفاة الخلية 35 ميكرون.
3. هدئ الكواشف التالية على الجليد: البيض المياه التي تحتوي على 0.21g / L أملاح المحيط الفوري في 1L الماء المقطر مزدوجة؛ دي yolking العازلة التي تحتوي على 55 ملي كلوريد الصوديوم، 1.8 ملي بوكل، و 1.25 ملم NaHCO ₃. وFACS العازلة التي تحتوي على يبوفيتش L-15 وسائل الإعلام تستكمل مع المعطل للحرارة 5٪ مصل بقري جنيني.
4. جلب 1 مل لكل عينة من خلية التفكك الكاشف 1 إلى RT. ذوبان الجليد 1 مل خلية التفكك الكاشف 2 لكل عينة على الجليد. جلب لRT مباشرة قبل الاستعمال.

3. التفكك وحيد الخلية

1. باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة، ونقل 100-300 الأجنة إلى أنبوب الطرد المركزي 2 مل الصغير في حجم الحد الأدنى من البيض المياه.
2. الموت ببطء الأجنة عن طريق استبدال الماء مع الماء البيض 1 مل الجليد الباردة وغمر أنبوب في الثلج لمدة 20 دقيقة.
   تنبيه! فمن الأهمية بمكان الحصول على موافقة من لجنة الرقابة رعاية الحيوانات المؤسسية المناسبة لهذا الأسلوب القتل الرحيم (تقشعر لها الأبدان على الجليد تليها التفكك خلية أنه قتل رحيم الثانوي). يتطلب القتل الرحيم القياسية عادة أن الأجنة <3 أيام بعد الإخصاب وابيض بعد تبريد الأسماك والتي ليس مناسبا للحصول على خلايا قابلة للحياة.
3. غسل الأجنة مرتين مع 1 مل الجليد الباردة البيض المياه. أن يغسل، واستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة لإزالة المياه البيض وP1000 لإضافة البيض المياه.
4. إزالة صفار البيض عن طريق استبدال الماء الجنين مع 1 مل Deyolking العازلة والطحن 8-12 مرات مع طرف P1000، أو حتى يذوب صفار البيض وفقط على جثث الأجنة مرئية.
5. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة. استخدام ماصة لإزالة بلطف طاف دون الإخلال بيليه الأنسجة. إعادة تعليق في 1 مل ماء البيض.
6. كرر الخطوة 3.5 ليصبح المجموع ثلاثة يغسل، ولكن على غسل النهائي، وإعادة تعليق في 1 مل RT خلية التفكك الكاشف 1.
7. احتضان في الخلية تفارق الكاشف 1 لمدة 10 دقيقة في RT مع أنابيب وضعت أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف مع ماصة P1000 لمنع تراكمها.
   ملاحظة: التعامل مع عينات بلطف خلال خطوات سحن. في وقت واحد، وأجمة كبيرة ستشكل في أنبوب من مجموعة متشابكة من الهيئات الجنين. هذه الإرادةتفريق مع الهضم إضافية بمساعدة سحن لطيف. لا الدوامة.
8. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف و resuspend في 1 مل خلية التفكك الكاشف 2.
9. احتضان لمدة 5-15 دقائق على RT. وضع أنابيب أفقيا. كل 2-3 دقيقة، يسحن بلطف لمنع تراكمها. كل 5 دقائق، تقييم التقدم المحرز الهضم.
   1. لتقييم التقدم المحرز الهضم، ويخفف 2 ميكرولتر طاف في 18 ميكرولتر FACS العازلة وماصة كما قطرات على طبق ثقافة الخلية.
   2. وضع ساترة على عينة ومراقبة تحت المجهر زراعة الأنسجة في 10X 20X وتكبير.
      ملاحظة: يجب أن تظهر إعداد بأنها مزيج من الخلايا وحيدة، مجموعات صغيرة، مجموعات كبيرة، وأحيانا الجسم الجنين معظمها سليمة.
   3. تقييم بصريا نسبة الاعداد التي هي خلايا مفردة ومجموعات صغيرة.
      ملاحظة: والإفراط في الهضم تقلل من جدوى. تحت الهضم وتقليل العائد خلية واحدة.
10. جمع وإعداد الخلية عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإعادة تعليق في 1 مل الباردة FACS العازلة.
11. بلل مصفاة الخلية 40 ميكرومتر مع FACS العازلة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على طبق خلية ثقافة 35 ملم. غسل الخلية مصفاة مرة واحدة مع 1 مل FACS فرز العازلة.
12. نقل التدفق من خلال لأنبوب microcentrifuge 2 مل. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق واعادة تعليق في 100 ميكرولتر FACS العازلة.
13. عدد العائد الخلية باستخدام عدادة الكريات. وعلاوة على ذلك تمييع عينات إلى 5X10 ⁶ خلايا لكل مل، أو تركيز الأمثل الموصى بها لآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية في الاختيار. اختياري، عندما عد العائد خلية على عدادة الكريات، مباين الخلايا الميتة مع الأزرق التريبان لتأكيد جدوى إعداد الخلية قبل FACS الفرز.
    ملاحظة: الاستعدادات التي يتم تمييع جدا وسوف تأخذ كمية كبيرة من الوقت لفرز. الاستعدادات التي هي أيضا جoncentrated تميل إلى تتجمع في multimers وهي الأمثل لفرز السكان نقية.
14. احتياطي 10-20٪ من كل عينة لاستخدام الضوابط كما غير ملوثين. للعينات المتبقية، وصمة عار الخلايا الميتة عن طريق إضافة / ميت (L / D) التمييز يعيش صبغة الفلورسنت في كل عينة. لا تغسل.
    ملاحظة: أي صبغة الفلورسنت التي تخترق الخلايا مع أغشية الخلايا للخطر والبقع ويمكن استخدام الأحماض النووية كما الصبغة L / D، شريطة أن أطياف مضان متوافق مع الجهاز FACS الاختيار ووضع العلامات fluorophore خلايا الفائدة.
    1. لا يغسل إعداد بعد إضافة الصبغة حيث أن بعض الخلايا سيموت في طريقها إلى تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية، وينبغي أن تستبعد من السكان فرزها.
15. بلل مصفاة 35 ميكرومتر الخلية توج FACS أنبوب مع العازلة FACS 20 ميكرولتر. إضافة الخلايا إلى مصفاة وجمع عن طريق الجاذبية. تخزين على الجليد.

4. نظام مراقبة الأصول الميدانية التخصيب

1. استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لإثراء لاحدوالخلايا الحية معربا عن علامة فلوري.
   1. تعيين بوابة لتمييز الخلايا من الحطام على مساحة مبعثر مبعثر إلى الأمام (FSC-A) السعة مقابل السعة الجانب مبعثر (SSC-A)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      الحذر! خلايا الزرد وعادة ما تكون أصغر من الماوس أو الخلايا البشرية. وينعكس هذا في فصل القاعدية أقل بين الخلايا والحطام.
   2. من البوابة المحددة في 4.1.1، تعيين بوابة لإثراء للخلايا واحدة واستبعاد multimers باستخدام مؤامرة مبعثر من ارتفاع الأمام مبعثر (FSC-H)، وانخفاض ارتفاع الجانب مبعثر (SSC-H)، وكلاهما مع التحجيم الخطي.
      ملاحظة: خلايا مع ارتفاع غير متناسب FSC-H وانخفاض SSC-H هي multimers المرجح ويتم استبعادها من الفرز.
   3. من مجموعة بوابة في 4.1.2، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضع بوابة لتشمل الخلايا الحية فقط باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف L / D وصمة عار مع التحجيم السجل. تشمل L / D خلايا السلبية.
   4. من عندتعيين البوابة في 4.1.3، وذلك باستخدام ضوابط لون واحد، وضعت بوابة لتشمل الخلايا الحية الوحيدة مع مضان الإيجابي باستخدام مؤامرة مبعثر من هيئة الرقابة المالية-A مع التحجيم الخطي وسعة القناة تستخدم لكشف الفلورسنت علامة الخلية البروتين مع توسيع نطاق سجل . تتضمن خلايا إيجابية.
   5. تعيين أي ضوابط التعويض، إذا لزم الأمر، لحساب تدخل بين L / وصمة عار D والفلورسنت أطياف البروتين.
2. مجموعة منطق نوع الخلايا التي تقع في جميع البوابات بتعيينه في الخطوة 4.1.
   1. استخدام الخلايا المسمى مزدوج، تحقق النابضة لفرز الخلايا.
      ملاحظة: خلايا لفرز سيكون الخلايا بدلا من الحطام، وخلايا واحدة بدلا من multimers، L / D خلايا إيجابية سلبية ومضان.
3. نوع 2،000-4،000 الخلايا من سكان الفائدة إلى 5 ميكرولتر من العازلة FACS الباردة في أنبوب microcentrifuge على الجليد. للحد من القص والضغط على الخلايا أثناء الفرز، واستخدام أقل الضغوط ممكن للخليةفارز.
   ملاحظة: قطرة 5 ميكرولتر من FACS العازلة بمثابة وسادة للخلايا الخروج من آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية. جمع 2،000-4،000 الخلايا مباشرة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي قبل تحميل على رقائق مؤسسة التمويل الدولية. وينصح باستخدام هذه الاستراتيجية بسبب الطرد المركزي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل multimers إذا تلتصق الخلايا لبعضها البعض في بيليه.
4. تقييم تحليل الجدوى بعد الفرز.
   1. نقل 1 ميكرولتر فرز الخلايا إلى أنبوب FACS جديدة مع 100 ميكرولتر FACS فرز عازلة و 1: 1000 تخفيف من L / D وصمة عار. تمر الخلايا من خلال فارز FACS مع استراتيجية المحاصرة في الخطوة 4.1. استخدام نسبة L / D سلبي إلى إيجابي لتقدير جدوى من الخلايا التي تم فرزها.

5. خلايا الحمل على رقاقة على microfluidics

1. باستخدام عدادة الكريات، وقياس كل من التركيز وحجم الخلايا فرزها.
   1. تمييع الخلايا التي تم فرزها لا يقل عن 10 ميكرولتر. تمييع قسامة من 5 μ؛ خلايا لتر مع 5 ميكرولتر التريبان الأزرق. تحميل على عدادة الكريات وتطبيق ساترة.
   2. جمع الصور الحقل مشرق لجميع الخلايا في 4 × 4 شبكات من عدادة الكريات. حساب عدد الخلايا الحية وحساب الحية خلية / مل. الخلايا الحية لا يستغرق التريبان الأزرق.
      ملاحظة: استخدام أي برنامج تحليل الصور القياسية لقياس قطرها من جميع الخلايا الحية. حساب الانحراف المتوسط ​​والمعياري للحجم الخلية، واختر لوحة مؤسسة التمويل الدولية مناسبة لمجموعة وحجم الخلية من الفائدة. إذا مدى حجم الخلية تمتد مؤسسة التمويل الدولية وحة مدى حجم الخلية، واستخدام لوحات متعددة لالتقاط مجموعة كاملة من خلايا الفائدة.
2. خلايا الحمل على لوحة مؤسسة التمويل الدولية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر المواد).
   1. تمييع الخلايا إلى الخلايا 1x10 ⁶ / مل وأداء الأمثل الطفو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: الطفو الأمثل يضمن أن الخلايا لا تنزل الى القاع ولا تطفو الى أعلى أهلا وسهلا تحميلل لتحميل الأمثل على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية. نسبة عازلة للخلايا قد تختلف من نوع من الخلايا، ولكن عادة ما يتراوح 6: 4-7: 3 من الخلايا: العازلة.
   2. إضافة إلى خلايا معدة ومؤسسة التمويل الدولية لوحة. لوحة الحمل إلى آلة FLUIDICS المتوافقة، وتشغيل برنامج نصي خلية تحميل لدفع الخلايا من خلال الدائرة على microfluidics وفي الممرات القبض عليه.
3. تأكد من أن الخلايا استقرت في المواقع القبض على لوحة مؤسسة التمويل الدولية.
   1. إزالة لوحة مؤسسة التمويل الدولية من آلة FLUIDICS. تركيب لوحة مؤسسة التمويل الدولية على المجهر مجهزة محول لوحة.
   2. جمع لقطات من مشرق الميدان ومضان لكل موقع القبض على التكبير 10x.
      قد تتراوح Brightfield مرات القبض 10-50 مللي ثانية، اعتمادا على شدة مصباح: ملاحظة. قد تتراوح مرات القبض مضان 250-750 مللي ثانية، اعتمادا على سطوع fluorophore. تجنب تعريض الخلايا لمنع photodamage.

6. كدنا] التجميعي

1. أداء تحلل الخلايا في الموقع وفقا للالأولتعليمات FC لوحة المصنعة.
   1. إضافة مخازن تحلل من الآبار على لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة وخلية المدى النصي تحلل حسب تعليمات الشركة الصانعة.
2. أداء النسخ العكسي وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
   1. إضافة الكواشف النسخ العكسي لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على الجهاز FLUIDICS متوافقة. تشغيل البرنامج النصي النسخ العكسي. عينة شروط ركوب الدراجات: 1 دورة في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 1 دورة في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم 1 دورة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. أداء ما قبل تضخيم مع تحقيقات الجينات المحددة وفقا لتعليمات مؤسسة التمويل الدولية وحة المصنعة.
   ملاحظة: نظرا لأكبر خصوصيتها مع أرقام منخفضة نسخة، استخدم تحقيقات الفلورة المسمى بدلا من تحقيقات الأمثل للاستخدام مع الأصباغ intercalator.
   1. الاشعال تجمع وتمييع لنهائي 180 نيوتن متر لكل منهما. إضافة الاشعال المجمعة لوحة مؤسسة التمويل الدولية. لوحة الحمل على fluidi متوافقآلة خدمات العملاء. تشغيل البرنامج النصي preamplification.
4. أداء ما قبل تضخيم مع الظروف دورة التالية: 1 دورة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 18 دورات مع تغيير طبيعة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. مخزن قبل تضخيم [كدنا في 4 درجات مئوية حتى الحصاد. حصاد كدنا] من لوحة ميكروفلويديك وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتخزينها في 20C-حتى الاستخدام.

7. حدد كدنا] من خلايا واحدة لشخص واحد الهدف QRT-PCR

1. تمييع [كدنا في 25 كاشف تخفيف ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: التقريبي العائد النهائي هو 28 ميكرولتر من [كدنا] تضخيم ما قبل لكل خلية. حجز قسامة من مخفف لاستخدامها كوسيلة لمراقبة عدم القالب في QRT-PCR.
   1. في اشارة الى حقل مشرق والصور فلوري سجلتها في الخطوة 5.3.2، يسجل كل موقع الالتقاط. يدويا عد وتسجيل عدد من الخلايا. تقييم وتسجيل ما إذا كان كل خلية هي انفلونزاorescent.
      ملاحظة: قد يحتوي كل موقع على حدة 0، 1، أو> 1 الخلية، حيث تتضمن> 1 خلية المواقع القبض التي تحتوي على خلايا متعددة و / أو الحطام هويته. إذا كانت الصور هي نوعية كافية، ويمكن أيضا أن يتم تعيين قيمة بكسل لقياس شدة إشارة مضان.
2. اختر عينات للتحليل QRT-PCR.
   1. اختيار عينات كدنا] من مواقع التقاط تحديدها في الخطوة 7.2 التي تحتوي على الدقيق 1 خلية مع مضان إيجابي. تجمع 1 مكل من كدنا] من كل عينة.
      ملاحظة: هذا هو "بركة" مراقبة إيجابية تستخدم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن جينات الفائدة في أي من الخلايا المحددة.
   2. اختر كدنا] من موقع التقاط واحد على الأقل يحتوي بالضبط 0 خلايا كعنصر تحكم السلبية. استخدام مخفف من الخطوة 7.1.2 كوسيلة لمراقبة أي قالب.
3. تشغيل QRT-فحص PCR.
   1. استخدام تحقيقات الوحيدة المستخدمة لمرحلة ما قبل التضخيم في الخطوة 6.4.1. تحميل جميع العينات في triplicatه. شروط ركوب الدراجات لرد فعل 10 ميكرولتر على 384 لوحة جيدا: 1 دورة 50 ° C 2 دقيقة (1)، دورة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 40 دورة مع تغيير طبيعة في 95 درجة مئوية 15 ثانية ثم الصلب والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

تحليل 8. البيانات

1. التحقق من صحة المنتجات QRT-PCR بواسطة الكهربائي للهلام القياسية. تأكيد المنتج هو فرقة واحدة في الوزن الجزيئي المتوقع (تختلف عن كل مسبار).
   ملاحظة: إذا كان التحقيق تنتج عصابات متعددة أو فرقة واحدة في حجم مناسب، ثم خصوصية أمر مشكوك فيه، وهذا لا يشمل هذا الجين من التحليل.
2. دراسة جميع منحنيات التضخيم وحساب لأي تشوهات ^14. حساب متوسط ​​قيمة CT لكل تركيبة نموذج / جين ^15.
   ملاحظة: القيم المقطعية لعناصر إيجابية تتراوح عادة 10-30. القيم المقطعية لضوابط السلبية عادة ما تتراوح 35-40 (أي التضخيم). القيم CT تعتبر 30-35 التعبير منخفض جداوينبغي أن تفسر بحذر ^14.
3. تقرير البيانات
   1. اذا انخفضت العينات في CT = 10-30، قد أبلغت بيانات أيضا تغيير أضعاف في نسخة الوفرة النسبية على عينة السيطرة.
      ملاحظة: طية تغير يساوي 2 ^ ^{(- ΔΔCT)} حيث ΔCT نسبة إلى الجينات التدبير المنزلي بطرح متوسط ​​المقطعية للعينة من الجينات التدبير المنزلي وΔΔCT هي الاختلافات في ΔCT بين العينة وتحكم إيجابية ^15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وكدليل على المبدأ، وجرى تقييم التعبير الجيني لاستكشاف ديناميكيات التمايز خلال تطوير القلب. في الزرد، تنشأ الأسلاف القلب من السكان أرومية متوسطة من الخلايا التي تهاجر إلى لوحة جانبية الأمامي الأديم المتوسط ​​حيث تلتحم لتشكل أنبوب القلب الخطي. قبل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يستخدم تعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة أحد المروجين محددة الخلية من نوع لإثراء مجموعة من الخلايا الاصلية في القلب من الأجنة الزرد لاستخدامها في نظام بمساعدة القبض على خلية واحدة ميكروفلويديك لتقييم تعبير عن مجموعة فرعية من الجينات القلب في واح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11254-20	For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml	GeneMate	C-3261-1
40 um cell strainer	Biobasic	SP104151
35 mm culture dish	Falcon	351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer	Falcon	352235
P1000 and tips	Rainin	17005089
P20 and tips	Rainin	17005091
IFC chip manufacturer's protocol	Fluidigm	100-6117	Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette	VWR	14673-010	For transferring embryos
Adult wild type zebrafish	N/A		We used AB line
Adult transgenic zebrafish	N/A		We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water	N/A
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
NaCl	FisherScientific	S271-3	make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl	Sigma Aldrich	P5405	make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014	make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15	Gibco	21083-027
FBS	FisherScientific	03-600-511	Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE	Life Technologies	12605-010	Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax	Genlantis	T200100	Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional)	Sigma	P5147
L/D Dye - Sytox Blue	Life Technologies	S34857	Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue	Gibco	15250-061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes			Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a	Life Technologies	Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4	Life Technologies	Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5	Life Technologies	Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7	Life Technologies	Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc	Life Technologies	Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1	Life Technologies	Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit	Fluidigm	100-5319	Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM	Life Technologies	4458237	Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water	Corning	46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um)	Fluidigm	100-5757	IFC plate for small cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine	Fluidigm	100-5477	For IFC plate use
Hemocytometer	Sigma Aldrich	Z359629	For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope			For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope			For assessing single cell digestion
FACS machine			For isolating cells of interest