בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

Summary

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Abstract

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Introduction

רוב המחקרים הנוכחיים של ביולוגיה מולקולרית של תא מבוססים על ממוצעי אוכלוסייה. עם זאת, אירועים ביולוגיים חשובים עשויים להיות רעולי פנים על ידי ניתוחים מבוסס אוכלוסיה המסורתיים הללו, מאחר ואנשים קטין יכול לשחק תפקידים מרכזיים בתהליכים ביולוגיים ותוצאות המחלה. הבנת ביטוי גני אוכלוסיות הטרוגניות ברמת התא הבודדה יכולה (ויש לו) להוביל לתובנות ביולוגיים וקליניים רלוונטיים ^1,2. דאגה ללימודי התפתחות עובריות, בתוך אוכלוסייה גדולה יותר של תאים, ובתאים הם בדרך כלל מיוצגים כראוי, מה שהופכים אותו מאתגר כדי לזהות שינויים עדינים ביטוי גנים שבסופו של דבר ליזום החלטות גורל תא ^3. באופן דומה, סוג תא בודד יכול להיות ביטוי פרופילים שונים בתגובה במיקרו-סביבה של ^4. לדוגמה, תאי אנדותל תושב אותו איבר או באיברים שונים (למשל., אבי העורקים או כליות) להפגין ההטרוגניות רבה, למרות שיתוף morp משותףתכונות hological ופונקציונליות ^5. בנוסף, תאים סרטניים לאכלוס אותה הגידול יכולים להיות גם משתנים פרופילים או מוטציות מולקולריים ברמת התא הבודדה ^6.

במערכות מודל, transcriptomics יחידים תאים זיהה בהצלחת אוכלוסיות תאים חדשות, המאופיינת מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים, וגילה תגובות הסלולר הפרש לגירויי ^7,8,9. תובנות אלה היו רעולי פנים במחקרים מבוסס אוכלוסיה קונבנציונאלי. עוברי דג זברה הם מקור מתחת מנוצל מאוד של גזע, אב, ובידול תאים לחקר שאלות ההטרוגניות תא בודד ורגולציה מולקולרית של זהויות הסלולר במהלך פיתוח. פיתוח וקלות מניפולציה גנטית סטריאוטיפית שלהם מאוד, לשעבר vivo לגרום להם מערכת מודל מצוינת עבור גישה זו ^10,11. באופן ספציפי, מגבלה משמעותית לפרשנות של תא בודד genנתוני דואר ביטוי הוא כי זיהוי אמין של מדינות תא ביניים רומן במהלך פיתוח דורש תזמון מאוד זהיר של אוסף רקמות ^9. הדבר נחוץ כדי להבטיח כי ההטרוגניות בין תאים שנתפסו מייצג ההטרוגניות בתוך רקמה בנקודת זמן אחת ולא הטרוגניות בביטוי גנים שהציג התמיינות תאים תלוי גיל. בהשוואה לעכברים, פיתוח עובר דג זברה יכול להיות מסונכרן בדיוק על פני מספר גדול של עובר ^12. בנוסף, עם גדלי מצמד גדולים, עוברי דג זברה יכולים לשמש מקור שופע של תאי גזע מולידם.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד תאים מעוברים דג הזברה ללכוד תאים בודדים באמצעות מעגל מיקרופלואידיקה משולבת זמינים מסחרית (IFC) מערכת שבבים autoprep עבור ניתוח ביטוי גנים qRT-PCR. פרוטוקול זה יכול להיות להעברה מיד על כל מבחני ריבוב תפוקה גבוהה כולל כלרצף transcriptome המאפשר ניתוח מקיף יותר של ההטרוגניות הסלולר ^13. הוא מציע גם מספר יתרונות מבחני ביטוי גנים מסורתיים. פרוטוקול בידוד תא הבודד מניב כדאיות גבוהה לאחר FACS, אשר מקטינה את חלקם של תאים נפגעים כלולי יישומים במורד זרם. באמצעות IFC, תאים שצולמו עשויים להיות שנצפו ישירות להעריך שיעורים ללכוד ולהעריך תא בריאות מורפולוגית. בנוסף, פרוטוקול זה הוא החלים רחב לקהילת מחקר דג הזברה, המחייב רק קו דג מהונדס שכותרתו וגישה לטכנולוגיות ללכוד תאי microfluidic.

כהוכחה עקרונית, תאים בודדים נגזרו אבות לב הבודדים שנתפסו על שבב IFC, ולאחר מכן את השפע היחסי של סמני בידול לב נמדד על ידי qRT-PCR. ניתוח התבטאות גנים ברמת התא הבודדה מוכיח כי אבות לב לדור בכפיפה אחת עם differe שלהםצאצאי ntiating. התובנה שנצבר פרופיל תא בודד של אבות לב עשוי לשפוך אור על ההטרוגניות דפוסי ביטוי גנים בין ובתאים לב במהלך ההתפתחות חוליות, אשר עשויים להיות רעולי פנים בניתוחים מבוסס אוכלוסיה מסורתית.

Protocol

פרוטוקול זה מחייב שימוש דג זברה לחיות, מבוגר לייצר עוברים. עוברים נקצרים לאיסוף רקמות. זה חיוני כדי לקבל את אישור ועדה בוחן אתיקה המתאימה לנהל את הניסוי הזה.

1. השג עובר מבוימים

1. היום לפני הניסוי, להכין בריא, דג זברה מבוגרת לרבייה. מניחים זכר אחד ונקבה אחת משני צדי המתרס של מחיצה ברורה בתוך אקווריום רבייה.
2. חזור על 1.1 לקערות רבייה רבות ככל הכרחיות ליצירת עובר מספיק עבור היישום במורד הזרם. השג עובר מן הדגים הוא סוג בר דגים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון בסוג התא של עניין.
   הערה: מספר העוברים הדרושים יישומים במורד הזרם שלבים 2-8 תלוי השפע היחסי של תאים בעלי עניין בנקודת הזמן של עניין. אמנם זה עשוי להשתנות לפי סוג התא, 200 עוברים לייצר 2,000-5,000 תאים ממוינים כאשר גאמות של עניין מייצגים <1.0% של תאים הכולל ב 24 hpf (שעות לאחר ההפריה).
3. למחרת בבוקר, להחליף את המים במכל גידול החיות ידי העברת דגים לאקווריום רבייה טרי להסיר את המחיצה. הטה את הטנק בזווית לעודד רבייה.
4. איסוף עובר מבוים.
   1. כל 15 דק ', לאסוף עובר על ידי העברה למבוגרי טנק רבייה טרי להעביר את הביצים אשר נשארות מאחור דרך מסננת תה.
      הערה: עוברי דג הזברה לפתח סינכרוני כאשר שמרו על צפיפויות וטמפרטורות דומות.
   2. יש לשטוף את הביצים עם ביצת מים (0.21 גר '/ ל מלחים אוקיינוס ​​מיידי ב 1 ליטר מים מזוקקים פעמים) ולהעביר בצלחת פטרי. מעביר את צלחת פטרי חממה ולחה על 28.5 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר.
5. שעתיים לאחר האוסף האחרון, מופרית מיון, עוברים רב-תאיים לתוך 10 ס"מ בצלחות פטרי ולהפחית צפיפות 50 עוברים לכל צלחת. עובר בחר מתוך אחת, 15חלון של אוסף זמן דק 'עבור יישום במורד הזרם. דגירה עוברת על 28.5 מעלות צלזיוס.
   הערה: לדוגמה, לאסוף עוברים בשעה 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 9:45, 10:00 ו 10:15. השוואת פני נקודות זמן, אם את המספר הגדול ביותר של עוברים מופרים הם מהציפורניים שנאספו בשעת 9:00, ולאחר מכן להשתמש רק עובר אלה עבור יישומים במורד זרם.

2. הגדרה עבור דיסוציאציה תא יחידה

1. כ -30 דקות לפני נקודת הזמן של עניין (18 hpf) סרים עוברות מן הסיסי שלהם באופן ידני עם מלקחיים בסדר.
2. אסוף ולתייג את המידע הבא לכל מצב: שני 2 מ"ל צינורות microcentrifuge, מסננת תא אחד 40 מיקרומטר, בצלחת תרבית תאים אחד 35 מ"מ, ושני צינורות FACS עקף עם מסננת תא 35 מיקרומטר.
3. צ'יל החומרים הכימיים הבאים על קרח: מי ביצה המכילים מלחי אוקיינוס ​​מיידי 0.21g / L ב 1 ליטר מים מזוקקים פעמים; דה-yolking מאגר המכיל 55 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ KCl, ו -1.25 מ"מ NaHCO ₃; ו FACS מאגר המכיל L-15 של ליבוביץ תקשורת בתוספת 5% בסרום שור עובר חום מומת.
4. תביאו 1 מ"ל לדגימה של מגיב סלולרי דיסוציאציה 1 עד RT. Cell ההפשרה 1 מ"ל דיסוציאציה מגיב 2 לדגימה על הקרח. מביאים RT מיד לפני השימוש.

3. דיסוציאציה תא יחיד

1. בעזרת פיפטה זכוכית הנישאת רחבה, להעביר 100-300 עובר לצינור צנטריפוגות מיקרו 2 מיליליטר נפח מינימאלי של ביצת מים.
2. להרדים העובר על ידי החלפת מים עם 1 מיליליטר קר כקרח ביצת מי הצללת צינורית קרח למשך 20 דקות.
   זהירות! זה קריטי כדי לקבל את אישור ועדת ביקורת חית טיפול נאותה מוסדית שיטת המתת חסד זה (מצמרר על קרח ואחריו תא דיסוציאציה כמו המתת חסד משנית). המתת חסד רגיל בדרך כלל דורש כי עובריים <3 ימים לאחר הפריה הם מולבנים לאחר שהם מקוררים, אשר אינו מתאים לקבלת תאי קיימא.
3. לשטוף את העוברים פעמיים עם מים ביצה 1 מ"ל קר כקרח. כדי לשטוף, השתמש פיפטה זכוכית נישאת רחבה להסיר ביצת מים P1000 להוסיף ביצת מים.
4. הסר את החלמון על ידי החלפת המים העובר עם 1 מיליליטר Deyolking הצפת triturating 8-12 פעמים עם טיפ P1000, או עד החלמון נמס ורק גופות העוברים גלויות.
5. אסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1. השתמש פיפטה להסיר את supernatant בעדינות מבלי לשבש את גלולת הרקמות. Re- להשעות במים 1 מ"ל ביצה.
6. 3.5 חזור על שלב עבור סכום כולל של שלושה שוטף, אבל על שטיפה של דבר, מחדש להשעות ב 1 מ"ל תא RT דיסוציאציה מגיב 1.
7. מדגירים מגיבים סלולארי דיסוציאציה 1 במשך 10 דקות ב RT עם צינורות בצורה אופקית. כל 2-3 דקות, בעדינות triturate עם טפטפת P1000 כדי למנוע clumping.
   הערה: ידית דגימות בעדינות במהלך שלבי טחינה דקים. מתישהו גוש יחיד, גדול יהווה בצינור מתוך סבך גופים עוברים. רצון זהלפזר בעיכול נוסף שנעזר טחינה דקה ועדינה. לא מערבולת.
8. אסוף רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 3 דקות. הסר supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל תא דיסוציאציה מגיב 2.
9. דגירה של 5-15 דקות ב RT. מניחים את הצינורות בצורה אופקית. כל 2-3 דקות, בעדינות triturate למנוע clumping. כל 5 דקות, להעריך את התקדמות עיכול.
   1. כדי להעריך את ההתקדמות העיכול, לדלל 2 supernatant μl לתוך 18 μl FACS הצפת פיפטה כמו טיפה על צלחת תרבית תאים.
   2. מניחים coverslip על מדגם ולבחון תחת מיקרוסקופ בתרבית רקמה בהגדלות 10X ו 20X.
      הערה: ההכנה אמורה להופיע כמו שילוב של תאים בודדים, קבוצות קטנות, אשכולות גדולים, וגוף העובר מדי פעם בעיקר שלמים.
   3. חזותי להעריך את השיעור בהכנה כי הוא תאים בודדים ואשכולות קטנים.
      הערה: Over-עיכול יפחית כדאיות; תת עיכול יפחית תשואת תא בודדת.
10. אסוף את הכנת התא על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות ב 1 מ"ל קר חיץ FACS.
11. להרטיב מסננת תא 40 מיקרומטר עם FACS חוצץ. לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר על צלחת תרבית תאים 35 מ"מ. שטוף את זמן תא המסנן אחת עם 1 מיליליטר FACS מיון חיץ.
12. העברת זרם דרך צינור 2 מ"ל microcentrifuge. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות מחדש להשעות ב 100 μl FACS חוצץ.
13. רוזן תשואת תא באמצעות hemocytometer. בהמשך לדלל דגימות 5x10 ⁶ תאים לכל מיליליטר, או ריכוז אופטימלי מומלצים מכונת בחירת FACS. אופציונלי בספירת תאי התשואה על hemocytometer, תאים מתים counterstain עם trypan כחול כדי לאשר הכדאיות של התכשיר התא לפני מיון FACS.
    הערה: תכשירים כי הם גם לדלל ייקח סכום עודף של זמן כדי למיין. תכשירים כי הם גם גoncentrated נוטים להתגודד לתוך multimers והם לא טובים למיון אוכלוסייה טהורה.
14. שמור 10-20% של כל דגימת שימוש באפליקציות כמו בלא כתם. לקבלת דוגמיות הנותרים, תאים מתים כתם על ידי הוספת חי ניאון / מת (L / D) אפליה לצבוע לתוך מדגם זה. אין לשטוף.
    הערה: כל צבע פלואורסצנטי חודרת תאים עם ממברנות וכתמי תא שנפגעו חומצות גרעין עשויות לשמש לצבוע L / D, ובלבד ספקטרום הקרינה תואם מכונת FACS של תאי תיוג בחירת fluorophore של עניין.
    1. אין לשטוף את ההכנה לאחר הוסיף לצבוע כמו כמה תאים ימותו העוברים טיהור FACS וצריכים מוצאים מהאוכלוסייה הממוינת.
15. להרטיב את מסננת מיקרומטר תא 35 כתרים צינור FACS עם 20 חיץ μl FACS. הוספת תאים אל מסננת ולאסוף על ידי כוח הכבידה. אחסן על הקרח.

4. FACS העשרה

1. השתמש FACS להעשיר עבור יחיד, תאי חיים המבטאים את בסמן פלורסנטי.
   1. גדר שער להבחין בין תאים מן ההריסות על מגרש פיזור של פיזור קדימה (FSC-A) משרעת לעומת משרעת פיזור בצד (SSC-A), שניהם עם דרוג ליניארית.
      זהירות! תאי דג זברה הן בדרך כלל קטנה יותר מאשר עכבר או תאים אנושיים. הדבר בא לידי ביטוי בהפרדת בסיס תחתונה בין תאים ופסולת.
   2. מהשער שנקבע 4.1.1, להגדיר שער להעשיר עבור תאים בודדים ואינם כוללים multimers באמצעות פיזור העלילה של גובה פיזור קדימה (FSC-H) וגובה פיזור נמוך בצד (SSC-H), שניהם עם דרוג ליניארית.
      הערה: תאים עם גבוה FSC-H לא פרופורציונאלי והנמוך SSC-H הם multimers סביר ואינם נכללים מיון.
   3. ממערך שער 4.1.2, באמצעות צבע שולט יחיד, להגדיר שער לכלול תאי חיים רק באמצעות פיזור עלילה של FSA-A עם דרוג ליניארית משרעת של הערוץ המשמש לאיתור L / כתם D עם דרוג יומן. כלול L / D תאים שליליים.
   4. מהשער שנקבע 4.1.3, באמצעות צבע שולט יחיד, להגדיר שער לכלול תאי חיים רק עם קרינה חיובית באמצעות פיזור עלילה של-A FSA עם דרוג משרעת ליניארי של הערוץ המשמש לאיתור סמן תא חלבון פלואורסצנטי עם דרוג יומן . כלול תאים חיוביים.
   5. גדר כל פקדי פיצוי, ואם יש צורך, לתת דין וחשבון על התערבות בין L / D כתם ספקטרום חלבון פלואורסצנטי.
2. היגיון מעין סט לתאים מתחלקים כל השערים להגדיר בשלב 4.1.
   1. שימוש בתאי שכותרתו כפול, ודא gating עבור מיון התא.
      הערה: תאים למיון יהיה תאים ולא פסולת, תאים בודדים ולא multimers, L / D שלילי קרינת תאים חיוביים.
3. מיין 2,000-4,000 תאים מן האוכלוסייה עניין לתוך 5 μl של קר FACS חוצץ בצינור microcentrifuge על הקרח. כדי למזער גז ומתח על תאים במהלך מיון, השתמש לחצים הנמוכים ביותר אפשריים עבור התאמְמַיֵן.
   הערה: אגל 5 μl של חיץ FACS משמש ככרית תאי יציאת מכונת FACS. איסוף 2,000-4,000 תאים ישירות לתוך FACS חוצץ מבטל את הצורך צנטריפוגה לפני הטעינה על שבבי IFC. מומלץ להשתמש באסטרטגיה זו משום צנטריפוגה יכול להוביל להיווצרות של multimers אם תאים לדבוק זה בזה גלולה.
4. להעריך את הניתוח הכדאי שלאחר המיון.
   1. ההעברה 1 μl מסודר תאים לצינור FACS טרי עם 100 μl FACS מיון חיץ 1: 1,000 דילול של כתם L / D. להעביר את התאים באמצעות סדרן FACS עם האסטרטגיה gating בשלב 4.1. השתמש שיעור L / D משלילי לחיובי להעריך כדאיות של תאים ממוינים.

5. תאי עומס על מיקרופלואידיקה צ'יפ

1. באמצעות hemocytometer, למדוד גם את הריכוז וגודל תאים ממוינים.
   1. לדלל תאים ממוינים לפחות 10 μl. לדלל aliquot של 5 μ; תאי L עם 5 μl trypan כחולים. עומס על hemocytometer ולהחיל coverslip.
   2. איסוף תמונות שדה בהיר של כל התאים 4 x 4 רשתות של hemocytometer. ספירת תאים חיים ולחשב תאים / מ"ל ​​חי. תאים חיים אינם תופסים trypan כחול.
      הערה: השתמש בכל תוכנה לניתוח תמונה רגילה למדוד את הקוטר של כל תאי החיים. חשבת את הסטייה הממוצעת ורמת גודל התא, ובחר צלחת IFC מתאימה בטווח גודל תא של עניין. אם טווח תאי גודל בפישוק מגוון גודל תא צלחת IFC, השתמש הצלחות מרובות כדי ללכוד המגוון הרחב של תאים בעלי עניין.
2. תאי עומס על צלחת IFC פי הוראות היצרן (ראה חומרים).
   1. לדלל התאים 1x10 ⁶ תאים / מ"ל ולבצע אופטימיזציה הציפה לפי הוראות היצרן.
      הערה: אופטימיזציה חוק ארכימדס מבטיחה כי התאים לא לשקוע לקרקעית ולא לצוף למעלה של wel טעינהl לטעינה אופטימלית על שבב IFC. יחס חיץ תאים עשויים להשתנות לפי סוג התא, אך בדרך כלל נע 6: 4-7: 3 של תאים: חיץ.
   2. הוספת תאים לצלחת דרוכה-IFC. צלחת טען לתוך מכונת fluidics תואמת, ולהפעיל תסריט טעינת תא לדחוף תאים דרך מעגל מיקרופלואידיקה ולתוך נתיבים ללכוד.
3. ודא תאים ונתקעו אתרים ללכוד בצלחת IFC.
   1. הסר את צלחת IFC ממכונה fluidics. הר צלחת IFC על מיקרוסקופ מצויד מתאם צלחת.
   2. אסוף תמונות של שדה קרינה בהירים עבור כל אתר לכיד בהגדלה 10X.
      הערה: פעמים ללכוד Brightfield עשויים לנוע בין 10-50 מילישניות, תלוי בעוצמת המנורה. פעמים לכידות קרינה עשויות לנוע בין 250-750 מילישניות, תלויים בהיר fluorophore. הימנע overexposing תאים כדי למנוע נזקי.

6. סינתזה cDNA

1. בצע תמוגה התא באתרו פי שאניצלחת FC הוראות היצרן.
   1. הוספת מאגרים תמוגה לבארות בצלחת IFC. צלחת לטעון על מכונת fluidics התואם תסריט תמוגה תא בטווח לפי הוראות יצרן.
2. בצע שעתוק לאחור על פי הוראות יצרן צלחת IFC.
   1. הוספת ריאגנטים שעתוק לאחור לצלחת IFC. צלחת לטעון על מכונת fluidics תואם. הפעל סקריפט שעתוק לאחור. תנאי אופניים לדוגמא: 1 מחזור של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 1 מחזור ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1., ולאחר מכן 1 מחזור ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. בצע-הגברה מראש עם בדיקות גן ספציפי על פי הוראות יצרן צלחת IFC.
   הערה: בשל לפרט יותר שלהם עם מספרים נמוכים להעתיק, להשתמש בדיקות fluorogenic שהכותרת ולא בדיקות מותאמות לשימוש עם צבעי intercalator.
   1. פריימרים ברכה לדלל לכל 180 ננומטר סופי. להוסיף פריימרים ונקווה לצלחת IFC. צלחת טען על fluidi תואםמכונת cs. תסריט preamplification לרוץ.
4. בצע-הגברה מראש עם תנאי המחזור הבאים: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז 18 מחזורים עם denaturing ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ואז חישול וסיומת ב 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. חנות מראש מוגבר cDNA ב 4 ° C עד הקציר. קציר cDNA מהצלחת microfluidic בהתאם להוראות וחנות של היצרן ב -20C עד השימוש.

7. cDNA בחר תאים בודדים עבור יחיד יעד qRT-PCR

1. לדלל cDNA ב -25 מגיב דילול μl פי הוראות היצרן.
   הערה: תשואה סופית משוערת היא 28 μl של cDNA מראש מוגבר לכל תא. שמורת aliquot של diluent לשימוש כשלט ללא תבנית qRT-PCR.
   1. בהתייחסו בשדה בהיר ותמונות ניאון רשמו בשלב 5.3.2, להבקיע כל אתר ללכוד. באופן ידני לספור ולהקליט את מספר התאים. להעריך ולהקליט אם כל תא הוא שפעתorescent.
      הערה: כל אתר מסוים עשוי להכיל 0, 1, או> 1 התא, שם> תא 1 כולל אתרים ללכוד המכילים מספר תאים ו / או פסולת בלתי מזוהה. אם התמונות הן באיכות מספקת, ערך פיקסל עשוי גם להיות מוקצה לכמת את עוצמת האות פלואורסצנטי.
2. דגימות בחרו לניתוח qRT-PCR.
   1. בחר דוגמאות cDNA מאתר ללכוד שזוהו בשלב 7.2 המכילים תא 1 מדויק עם קרינה חיובית. בריכה 1 aliquots μl של cDNA מכל מדגם.
      הערה: זהו "הפול" בקרה חיובית משמש כדי לקבוע אם הגנים של עניין באים לידי ביטוי בכל אחד מן התאים שנבחרו.
   2. בחר cDNA מלפחות אתר ללכוד אחד שמכיל בדיוק 0 תאים כביקורת שלילית. השתמש diluent משלב 7.1.2 כביקורת ללא תבנית.
3. הפעל assay qRT-PCR.
   1. השתמש בדיקות יחידות המשמשות הגברה מראש בשלב 6.4.1. טען את כל דגימות triplicatדואר. תנאי רכיבה על אופניים לתגובה 10 μl על צלחת גם 384: 1 מחזור 50 ° C 2 דקות, 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורים עם denaturing על 95 מעלות צלזיוס 15 שניות ואז חישול והסיומת ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות.

ניתוח 8. נתונים

1. אמת מוצרי qRT-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית. אשר המוצר היא להקה אחת ב משקל מולקולרי צפוי (משתנה עבור כל בדיקה).
   הערה: אם בדיקה מייצרת להקות מרובות או להקה יחידה בגודל הולם, אז סגולי מוטל בספק, וזה כולל את הגן מניתוח.
2. בדוק את כל קימורי הגברת החשבון עבור בתופעות חריגות ^14. חשב את הערך CT הממוצע עבור כל שילוב מדגם / גן ^15.
   הערה: ערכי CT עבור בקרות חיוביות בדרך כלל נעים בין 10-30. ערכי CT עבור פקדים שליליים בדרך כלל נעים בין 35-40 (לא הגברה). ערכי CT 30-35 נחשבים ביטוי נמוך מאודוצריך לפרש בזהירות ^14.
3. נתונים דווח
   1. אם דגימות ליפול CT = 10-30, הנתונים עשויים להיות כמו כן דווח כי שינוי לקפל יחסית שפע תמליל מדגם שליטה.
      הערה: מקפלים שינוי שווה 2 ^ ^{(- ΔΔCT)} שבו ΔCT הוא ביחס גן משק על ידי הפחתת CT הממוצע של המדגם מן גן משק ו ΔΔCT הוא ההבדלים ΔCT בין המדגם לבין כביקורת חיובית ^15.

תוצאות

כהוכחה עקרונית, ביטוי גנים הוערך לחקור דינמיקת בידול במהלך התפתחות של לב. בשנת דג זברה, אבות לב נובעים אוכלוסיית mesodermal של תאי נודדים אל mesoderm הצלחת לרוחב הקדמי שבו הם פתיל כדי ליצור את צינור הלב ליניארי. לפני היתוך, אבות לב מתחילים לבטא את nkx2.5 גור?...

Discussion

השיטה המתוארת במסמך זה השתמש ביטוי של חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​מקדם ספציפי תאים מהסוג להעשיר אוכלוסייה של ובתאים לב מעוברי דג זברה לשימוש במערכת ללכוד microfluidic בסיוע תא בודד להעריך ביטוי של תת-קבוצה של גני לב יחיד תאים. ובלבד יכולות עירור ופליטה לייזר FACS עול?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11254-20	For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml	GeneMate	C-3261-1
40 um cell strainer	Biobasic	SP104151
35 mm culture dish	Falcon	351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer	Falcon	352235
P1000 and tips	Rainin	17005089
P20 and tips	Rainin	17005091
IFC chip manufacturer's protocol	Fluidigm	100-6117	Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette	VWR	14673-010	For transferring embryos
Adult wild type zebrafish	N/A		We used AB line
Adult transgenic zebrafish	N/A		We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water	N/A
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
NaCl	FisherScientific	S271-3	make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl	Sigma Aldrich	P5405	make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014	make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15	Gibco	21083-027
FBS	FisherScientific	03-600-511	Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE	Life Technologies	12605-010	Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax	Genlantis	T200100	Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional)	Sigma	P5147
L/D Dye - Sytox Blue	Life Technologies	S34857	Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue	Gibco	15250-061
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes			Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a	Life Technologies	Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4	Life Technologies	Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5	Life Technologies	Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7	Life Technologies	Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc	Life Technologies	Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1	Life Technologies	Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix	Life Technologies	4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit	Fluidigm	100-5319	Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM	Life Technologies	4458237	Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water	Corning	46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um)	Fluidigm	100-5757	IFC plate for small cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine	Fluidigm	100-5477	For IFC plate use
Hemocytometer	Sigma Aldrich	Z359629	For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope			For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope			For assessing single cell digestion
FACS machine			For isolating cells of interest