Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في المقايسات مستعمرة المختبر للكشف عن تجديد الذات والتمايز للخلايا السلف عزل من البنكرياس الفئران الكبار وضعها. في هذه المقايسات، الأسلاف البنكرياس تؤدي إلى مستعمرات الخلايا في الفضاء 3 الابعاد في المتوسطة التي تحتوي على ميثيل شبه صلبة. ووصف بروتوكولات للتعامل مع الخلايا وحيدة وتوصيف المستعمرات الفردية.

Abstract

الجذعية والخلايا الاولية من البنكرياس الكبار يمكن أن يكون مصدرا محتملا للخلايا تشبه بيتا العلاجية لعلاج المرضى الذين يعانون من داء السكري من النوع 1. ومع ذلك، فإنه لا يزال غير معروف ما إذا كانت الجذعية والسلف خلايا موجودة في البنكرياس الكبار. وقد أسفرت استراتيجيات البحث باستخدام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن البحث عن المفقودين النسب في فئران بالغة النتائج التي إما دعم أو دحض فكرة أن خلايا بيتا يمكن أن تتولد من القنوات، ومكان يفترض حيث يمكن أن يقيم الكبار الأسلاف البنكرياس. هذه الأساليب لتعقب النسب في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، ومع ذلك، لا يمكن الإجابة على الأسئلة على تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز اثنين والمعايير اللازمة لتحديد الخلايا الجذعية. للبدء في معالجة هذه الفجوة التقنية، ونحن وضعت المقايسات مستعمرة 3 الأبعاد لالأسلاف البنكرياس. بعد فترة وجيزة نشر الأولي لدينا، وضعت غيرها من المختبرات بشكل مستقل مماثل، ولكن ليست متطابقة، طريقة تسمى الفحص عضوي الشكل. بالمقارنة مع فحص عضوي الشكل، ويعمل لدينا وسيلةميتيل، التي تشكل الحلول اللزجة التي تسمح للإدراج البروتينات المصفوفة خارج الخلية بتركيزات منخفضة. تسمح المقايسات التي تحتوي على ميثيل أسهل كشف وتحليل الخلايا الاولية على مستوى وحيدة الخلية، التي تعتبر بالغة الأهمية عندما تشكل الأسلاف صغيرة شبه سكان، كما هو الحال بالنسبة للعديد من الخلايا الجذعية الجهاز الكبار. معا، والنتائج من عدة مختبرات يتظاهرون في المختبر تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز الخلايا الشبيهة السلف البنكرياس من الفئران. البروتوكولات الحالية تصف تحليلين مستعمرة القائم على ميثيل لتوصيف الأسلاف الماوس البنكرياس. واحد يحتوي على إعداد التجارية من البروتينات المصفوفة خارج الخلية الفئران والأخرى الاصطناعي خارج الخلية البروتين مصفوفة يعرف هيدروجيل laminin. التقنيات المعروضة هنا هي 1) التفكك البنكرياس والفرز من CD133 + Sox9 / EGFP + الخلايا الأقنية من فئران بالغة، 2) التلاعب خلية واحدة من لياليخلايا orted، 3) مستعمرة واحدة تحلل باستخدام ميكروفلويديك QRT-PCR وكله جبل المناعية، و 4) تفكك المستعمرات الأولية إلى وحيدة الخلية تعليق وإعادة الطلاء، إلى فحوصات مستعمرة الثانوية لتقييم التجديد الذاتي أو تمييز.

Introduction

ويتكون البنكرياس من ثلاثة الأنساب الخلية الرئيسية؛ خلايا عنيبية تفرز الإنزيمات الهضمية، القنوات الناقلة لإفراز الميوسين لدرء مسببات الأمراض ونقل الإنزيمات الهضمية إلى الأمعاء، وخلايا الغدد الصماء تفرز الهرمونات، بما في ذلك الأنسولين والجلوكاجون، التي تحافظ على مستوى السكر في التوازن. أثناء التطور الجنيني من البنكرياس، وخلايا الأقنية المبكرة هي مصدر الخلايا الاولية ثلاثي قوية قادرة على التسبب في الأنساب الثلاثة في بنكرياسات الحيوانات الكبار 1،2. لأن الجذعية والسلف الخلايا البالغة، مثل الخلايا الجذعية لنخاع العظم، وبالفعل استخدمت بنجاح لعلاج أمراض مختلفة 3، وهناك اهتمام كبير في العثور على الخلايا الجذعية والسلف في البنكرياس الكبار. إذا كانت العزلة والتلاعب من الخلايا الجذعية والسلف البنكرياس الكبار ممكنة، وهذه الخلايا يمكن استخدامها لعلاج أمراض مثل السكري من النوع 1، حيث يتم تدمير الخلايا المفرزة للأنسولين من قبل المناعة الذاتية.

الصورة = "jove_content"> سواء الخلايا الاولية ثلاثي قوي لا تزال موجودة في قنوات البنكرياس الكبار بعد الانتهاء من التطور الجنيني هو السؤال الذي يدور جدل كبير في الأوساط العلمية. في هذا النقاش، واستخدام في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، وأظهر تقنيات تتبع النسب INADA وزملاء العمل أن الكبار خلايا الأقنية الفئران المسمى مع علامة، الأنهيدراز الكربونيك الثاني، يمكن أن يؤدي إلى كل الأنساب البنكرياس ثلاثة 4. ومع ذلك، باستخدام علامات الأقنية الأخرى، مثل HNF1b 5 و Sox9 2، تم التوصل إلى أن خلايا الأقنية ليست هي المصدر الرئيسي للخلايا بيتا في فئران بالغة.

قبل عدة سنوات، اقترحنا أن سبب النقاش المذكورة أعلاه قد يكون راجعا إلى نقص في مجال 6،7، من الأدوات التحليلية المناسبة التي يمكن استخدامها لقياس تجديد الذات ومتعددة النسب تمايز اثنين والمعايير اللازمة ل تحديد الخلايا الجذعية. في الجسم الحي لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لتعقب النسب المذكورة تقنيةأعلى يمكن أن توفر دليلا على العلاقة سلف-ذرية على مستوى السكان. ومع ذلك، هذه النسب تقنية تتبع يقتصر في وسعها لتبين ما إذا كانت الخلايا السلف واحدة يمكن تجديد الذات وتفرق في الأنساب متعددة. تحليل وحيد الخلية هو المهم لأنه إذا تم تحليل عدة الأسلاف أحادية قوية، مع كل إمكانات النسب المختلفة، جنبا إلى جنب، فإنها قد تظهر مجتمعة أن يكون متعدد النسب قدرات التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الجذعية وعادة ما تكون طفيفة السكان من جهاز الكبار. يمكن ملثمين أنشطة سكان الخلية طفيفة من قبل سكاني كبير. ولذلك، فإن نتيجة سلبية من دراسة السكان لا يعني بالضرورة عدم وجود الخلايا الجذعية. وأخيرا، لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن نسب تتبع لا يسمح حاليا للقياس على تجديد الذات.

للبدء في معالجة الفجوة التقنية في مجال البنكرياس بيولوجيا الخلية السلف، مستعمرة 7-11 أو عضوي الشكل 12-15 فحوصات باستخدام نظم استزراع 3D. وقد وضعت اثنين من المقايسات مستعمرة لالأسلاف البنكرياس في مختبرنا: واحد يحتوي على إعداد التجارية من الفئران البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) (انظر طرق ومعدات الجدول)، والآخر يحتوي على هيدروجيل laminin، وهو يعرف الاصطناعي البروتين ECM 7-11. يتم خلط الخلايا الاصلية في وسط شبه صلبة تحتوي على ميثيل. ميثيل هو مادة خاملة بيولوجيا ولزجة أعدت من ألياف الخشب، واستخدمت بشكل روتيني في المقايسات مستعمرة المكونة للدم (16). المتوسط ​​شبه صلبة تحتوي على ميثيل-يقيد حركة الخلايا الاولية واحدة بحيث لا يمكن إعادة مجموع المباراتين. ومع ذلك، فإن المتوسط ​​لينة بما يكفي للسماح لخلية سلفية لتنمو وتفرق في مستعمرة من الخلايا في الفضاء 3D. بعد تقليد أمراض الدم، كانت خلية سلفية البنكرياس التي كانت قادرة على التسبب في مستعمرة من الخلايا نآمد وحدة البنكرياس تشكيل مستعمرة (PCFU). PCFUs، عندما نمت في الفئران التي تحتوي على ECM مستعمرة الفحص، تؤدي إلى المستعمرات الكيسي التي يتم تسمية "الطوق" المستعمرات 7. على إضافة ناهض WNT، R-spondin1، في الثقافة التي تحتوي على ECM الفئران، تتحول بعض المستعمرات الدائري إلى مستعمرات "كثيفة" (7). في هذه المقالة، وهذين النوعين من المستعمرات نمت في الثقافة ECM الفئران يشار إليها مجتمعة ب "حزام / الكثيفة" المستعمرات. عندما يتم فصل الدائري / مستعمرات كثيفة في تعليق خلية واحدة، وإعادة مطلي إلى الثقافات التي تحتوي على laminin هيدروجيل، تتشكل "الغدد الصماء / عنيبية" المستعمرات 7.

باستخدام مستعمرة واحدة تحليلات، تبين أن غالبية المستعمرات الدائري / الكثيفة والغدد الصماء / عنيبية، سواء من الكبار (عمرها شهر 2-4) (القديمة أسابيع 1) 7،11 أو الشباب 9 البنكرياس الفئران، وأعرب عن ثلاثة علامات النسب. وهذا يشير إلى أن معظم PCFUs الناشئة هي ثلاثية قوية. في التي تحتوي على ECM الفئران مستعمرة فحص وتجديد الذات الكبار PCFUs الفئران بقوة وتوسيع ما يقرب من 500،000 مرة على مدى 11 أسابيع في الثقافة 7. ECM الفئران يدعم تفضيلي تمايز الخلايا الأقنية على الغدد الصماء وعنيبية الأنساب، في حين أنه في وجود هيدروجيل laminin، تشجع PCFUs الفئران للتمييز تفضيلي إلى خلايا الغدد الصماء وعنيبية وأقل من ذلك إلى نسب الأقنية 7،9،11. الأهم من ذلك، الأنسولين + الجلوكاجون - يتم إنشاء خلايا أحادية الهرموني في الثقافة هيدروجيل laminin وتفرز الأنسولين استجابة إلى جلوكوز التحفيز في المختبر 7،9، مما يدل على النضج وظيفية. وأكد التمايز ثلاثي النسب المحتملة 7،9 وتجديد النفس 11 من PCFUs فرد من المجهرية وحيدة الخلية، أي زرع خلية واحدة لكل بئر لتشكيل مستعمرة. معا، وتوفر هذه النتائج دليل على أن هناك، ثلاثي الهياج تجديد الذاتر، وخلايا تشبه السلف في البنكرياس الفئران بعد الولادة التي تظهر الأنشطة في الثقافة 3D.

وتستمد المقايسات PCFU الفئران الموضحة في هذه المقالة من مقايسة مستعمرة مسبق مصممة للخلايا السلف متباينة من الخلايا الفئران الجذعية الجنينية (mESCs) 17. تم توثيق هذا البروتوكول في التفاصيل في المنشور إن الرب آخر 18. المكونات والتقنيات اللازمة لأداء الفئران التي تحتوي على ECM فحص المستعمرة لPCFUs الكبار الثقافة هي نفسها بالنسبة للالأسلاف المستمدة مسك-17،18. لذلك، لن يتكرر هذه الجوانب من فحص هنا. بدلا من ذلك سيتم تناول الإجراءات التالية: 1) التفكك البنكرياس الكبار والفرز CD133 + Sox9 / EGFP + الخلايا الأقنية، والتي تثري PCFUs من فئران بالغة 7، 2) التلاعب وحيدة الخلية من الخلايا فرزها، 3) واحدة مستعمرة يحلل استخدام ميكروفلويديك QRT-PCR وكله جبل المناعية، و 4) تفكك كولونيالصورة في تعليق وحيد الخلية وإعادة الطلاء إلى ECM الفئران أو laminin المقايسات مستعمرة هيدروجيل.

Protocol

بيان الأخلاقي: ونحن نتمسك المعايير الأخلاقية المقبولة على نطاق واسع في إجراء البحوث لضمان جودة وسلامة النتائج. وتجري التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في مدينة الأمل.

1. إعداد تعليق خلية واحدة من الكبار الفئران بنكرياسات

ملاحظة: في المنشورات السابقة 7،11، استخدمت CD-1 أو خلفية B6 الفئران. وقد أسفرت هذه الخلفيات نتائج مماثلة. تم إنشاء خط المعدلة وراثيا الماوس (المعين Sox9 / EGFP) مع زيادة البروتين مخضر يقودها Sox9 مواضع 19،20، في الخلفية CD-1.

  1. الموت ببطء 3-5 فئران بالغة باستخدام ثاني أكسيد الكربون غاز 2 لمدة 1-2 دقائق أو حتى يتوقف التنفس. التالي، نفذ خلع عنق الرحم على كل فأر.
  2. تشريح وإعداد بنكرياسات.
    ملاحظة: تشريح الفئران في أقرب وقت ممكن بعد القتل الرحيم. وهذا أمر مهم لتجنب لصناعة السيارات في الهضم من البنكرياس بسببللتغيرات ما بعد الوفاة.
    1. جعل شق عمودي على خط الوسط من جدار البطن من الفأرة باستخدام مقص وفتح تجويف البطن. البحث الطحال واستخدام ملقط لرفع بلطف. قطع النسيج الضام بين الطحال والفص الطحال من البنكرياس مع مقص.
      1. كرر هذه الممارسة لفصوص الاثني عشر والمعدة البنكرياس. وضع أنسجة البنكرياس في طبق بيتري على الجليد التي تحتوي على المحلول البارد Dulbecco لتعديل عازلة الفوسفات (DPBS)، 0.1٪ زلال المصل البقري (BSA)، والبنسلين والستربتومايسين (P / S؛ الحل الكامل تسمى برنامج تلفزيوني / BSA).
    2. إزالة الأنسجة الدهنية من البنكرياس تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط غرامة طرف.
      ملاحظة: هذا أمر بالغ الأهمية لصحة خلايا البنكرياس فصلها في الخطوات التالية.
      1. (اختياري) للتحقق من بنكرياسات لمضان أخضر تحت مجهر تشريحي مضان باستخدام 488-509 نانومتر الإثارة لضمانالتعبير EGFP.
    3. في نسيج الثقافة هود، وشطف الأنسجة ثلاث مرات بالتتابع في ثلاثة أطباق 100 ملم بتري تحتوي على 10 مل من البرد PBS / جيش صرب البوسنة.
  3. توليد قطع صغيرة من الأنسجة.
    1. نقل بنكرياسات تشريح على طبق بتري معقمة جافة لإزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني / BSA وقت ممكن، ونقلها إلى طبق بيتري جافة أخرى على الجليد.
    2. إعداد برنامج تلفزيوني / BSA تحتوي على الدناز أنا بإضافة 2 ميكرولتر الدناز أنا حل سهم (1 مليون وحدة [MU] / مل) لكل 1 مل PBS / جيش صرب البوسنة.
      ملاحظة: يتم تعيين هذا الحل برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أولا جعل ~ 200 مل من هذا المحلول في آن واحد، والتي سوف تغطي تجربة واحدة الفرز.
    3. فرم بنكرياسات باستخدام مقص الربيع لمدة 2-3 دقائق أو حتى الأنسجة في القطع الجميلة. إضافة 2-3 مل من البرد PBS / جيش صرب البوسنة / الدناز الأول لقطع الأنسجة في طبق بيتري للتعليق عليها.
    4. نقل قطع من الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد مع ماصة 10 مل. جعل إجمالي حجم 10 مل مع برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز لتر بعد تعافيه قدر الأنسجة ممكن.
  4. هضم البنكرياس قطعة في خلايا في الغالب واحدة.
    1. إضافة كولاجيناز ب (100 ملغ / مل الأسهم) في 350-450 ميكرولتر / 10 مل لقطع الأنسجة واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 8 دقائق، يحوم كل 3-4 دقائق. استخدام حقنة 10 مل مع إبرة 16 ½ G لوضع وبعد ذلك رش حل الأنسجة أسفل جدار أنبوب 50 مل في RT. كرر هذه سبع مرات.
      ملاحظة: استخدام ما يكفي من القوة لتفريق مجموعات الخلايا ولكن تجنب فقاعات توليد التي قد تقتل الخلايا.
    2. عودة الأنبوب إلى حمام مائي عند 37 ° مئوية لمدة 8 دقائق ومزيج من قبل يحوم كل 3-4 دقائق. حقنة النسيج صعودا وهبوطا سبع مرات، كما ذكر أعلاه، ووضع العينة (10 ميكرولتر) من الحل الأنسجة على طبق بيتري جافة. مراقبة الحل الأنسجة تحت مقلوب، على النقيض من المرحلة، المجهر الضوئي مع 10X عدسة الهدف. نتوقع الخلايا واحد وبعض ج صغيرة الحجممجموعات الذراع ليكون حاضرا.
    3. التعامل مع الخلايا على الجليد من هذه النقطة لإبطاء أو وقف نشاط كولاجيناز. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام الباردة برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أولا الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend في 5 مل من البرد PBS / جيش صرب البوسنة / الدناز أنا باستخدام pipettor P1000.
  5. مرشح لانتاج تعليق خلية واحدة وغسل.
    1. تصفية الخلايا من خلال 70 ميكرومتر شبكة النايلون مرشح الكأس وبعد ذلك من خلال 40 ميكرون شبكة من النايلون مرشح الكأس.
    2. resuspend الخلايا في 5 مل الباردة برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز الأول وعدد الخلايا.
      ملاحظة: للحصول على العمر شهرا و2-4 B6 أو CD-1 الفئران، كل البنكرياس قد تسفر ~ 5 أو 10 ملايين الخلايا، على التوالي. قد تختلف هذه الأرقام بين التجريبيون مختلفة. إذا تم العثور المفرط حطام خلية في العد، تبرزي حجم 50 مل مع الباردة برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أنا وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. ضبط حجم تعليق خلية إلى تركيز 2 × 107 خلية / مل باستخدام الباردة برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أولا

2. فرز الخلايا في البنكرياس نمي أسلاف مستعمرة تشكيل

ملاحظة: من الفئران B6، CD133 + ولكن ليس CD133 - يتم إثراء خلايا لPCFUs 7،9،11. وتشكل الخلايا CD133 + ~ 13٪ من إجمالي نأت خلايا البنكرياس بعد تطبيق كافة المعايير النابضة 11. من CD-1 الفئران، CD133 + Sox9-EGFP + الخلايا تمثل عادة ~ 4٪ من مجموع خلايا البنكرياس، وإثراء هذه الفئة من السكان خلية للPCFUs 7. فرز الخلايا / EGFP + CD133 + Sox9 هو موضح هنا.

  1. وصمة عار على تنفصل الخلايا البنكرياس.
    1. منع كامل البنكرياس وحيدة الخلية تعليق للحد غير محددة وملزمة التي يحتضنها تعليق وحيد الخلية مع مكافحة فأر CD16 / 32 في 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي لمدة 5 دقائق على الجليد.
    2. إزالة قسامة من 1 × 10 6 خلايا (50 &# 181؛ ل) إلى وصمة عار مع isotype السيطرة الأجسام المضادة، البيوتين مترافق IgG1 الفئران في 5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، لمدة 20 دقيقة على الجليد، يحوم كل 5-7 دقائق.
    3. إزالة قسامة من 1 × 10 6 خلايا (50 ميكرولتر) والحفاظ على الجليد كعنصر تحكم غير ملوثين.
    4. وصمة عار على ما تبقى من الخلايا مع مكافحة فأر CD133 الأجسام المضادة الأولية البيوتين مترافق، في 5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، لمدة 20 دقيقة على الجليد، يحوم كل 5-7 دقائق.
  2. خلايا الغسيل.
    1. غسل isotype السيطرة وعينات ملطخة الأجسام المضادة الأولية عن طريق جعل حجم 1 مل مع برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أنا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة غسل.
    2. Resuspend وisotype السيطرة وعينات ملطخة الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أنا، وبالتالي فإن التركيز النهائي هو 2 × 10 7 خلية / مل.
  3. وصمة عار على isotype السيطرة وعينات ملطخة الأجسام المضادة الأولية مع streptavidin (STV) allophycocyanin -labeled (APC) في 2 & #181؛ ز / مل تركيز النهائي. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد، يحوم كل 5-7 دقائق.
  4. غسل الخلايا و4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) تلطيخ.
    1. غسل isotype السيطرة وعينات ملطخة الأجسام المضادة الأولية مرتين مع برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز الأول، كما في الخطوة 2.2. resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أنا مع دابي (0.2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي). يجب أن يكون الحجم النهائي للعينة isotype السيطرة 0.5 مل.
      ملاحظة: تأكد من أن الكثافة النهائية للعينة ملطخة الأجسام المضادة الأولية هي مناسبة لفارز لاستخدامها. هناك تركيز 5 × 10 6 خلية / مل يستخدم بشكل روتيني للفرز.
    2. ضبط حجم الخلايا غير ملوثين إلى 0.5 مل مع برنامج تلفزيوني / BSA / PS / الدناز أولا تصفية كل الخلايا من خلال شبكة 20 ميكرون قبل الفرز والحفاظ على الخلايا على الجليد في الظلام.
  5. فرز الخلايا.
    1. استخدام 80 ميكرون أو أكبر فوهة للفرز.
      ملاحظة: الفئران خلايا الغدد الصماء في البنكرياس عرضة للإجهاد البدني. هوويفر، لا تظهر PCFUs الفئران أن تتأثر التوتر الناجم عن مرورا فارز 7.
    2. الحصول على أحداث خلية والمعلمات التحليل على فارز. بوابة الخلايا للأمام والمناطق الجانب مبعثر لاستبعاد الحطام الخلية 7. بوابة إلى الأمام والجانب مبعثر الاعراض لاستبعاد الحلل خلية. بوابة لاستبعاد دابي + الخلايا الميتة 7. اختيار النابضة المعلمات للإشارات EGFP وCD133-APC على أساس القيم من الخلايا isotype السيطرة (الشكل 1).
    3. جمع الخلايا مرتبة في 5 مل أنابيب البوليسترين تحتوي على 1.5 مل من DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 5٪ مصل العجل الجنين (FCS). الطرد المركزي السكان فرزها في 400 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend في حجم صغير (~ 200 ميكرولتر) اما DMEM / F12 أو برنامج تلفزيوني / BSA / الدناز أنا تستكمل مع 5٪ FCS. تبقي الخلايا على الجليد حتى الاستخدام.
  6. حساب عدد من CD133 + Sox9-EGFP + الخلايا التي تم الحصول عليها من فارز. خذ10 ميكرولتر عينة الخلية وعدد الخلايا مع عدادة الكريات لتحديد كثافة الخلية.
    من المستحسن استخدام عدادة الكريات بسبب تهم الجهاز من فارز غالبا ما تكون غير موثوق بها: ملاحظة.

3. لوحة خلايا الترتيب في مستعمرة الفحص يحتوي على الفئران ECM البروتينات

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى البروتوكولات مفصلة لطلاء الخلايا في الفئران التي تحتوي على ECM مستعمرة الفحص في المنشور إن الرب آخر 18.

  1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام.
    1. إعداد مستنبت تحتوي على DMEM المتوسطة / F12، 1٪ (وزن / حجم) ميتيل، 5٪ (ت / ت) بروتينات ECM الفئران، 50٪ (ت / ت) مكيفة متوسطة من الخلايا تشبه البنكرياس المستمدة مسك، 5٪ (ت / ت) FCS، 10 مليمول / لتر نيكوتيناميد، 10 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف activin ب، 0.1 نانومول / لتر exendin-4 و 1 نانوغرام / مل الأوعية الدموية نمو بطانة عامل-A. وترد تفاصيل طرق لتوليد المتوسطة مكيفة في أماكن أخرى 18.
    2. إضافة 750 نانوغرام / مل من RSPO-1 إلى المتوسطإذا كان المطلوب تشكيل مستعمرة الكثيفة.
    3. احتضان الثقافة البروتين ECM الفئران عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 أسابيع.

4. الثقافة خلايا الترتيب في 1 خلية لكل حسنا

ملاحظة: تطبيق الإجراءات التالية لمعالجة الخلايا واحدة باستخدام اليد والفم الماصات. نهج بديل هو لشراء micromanipulator. يتضمن micromanipulator نموذجي مجهر مقلوب مع منصة مزودة بمحركات تعمل عصا التحكم.

  1. إعداد زجاج باستور ماصات.
    1. باستخدام موقد بنسن، استخلاص غيض من ماصة باستير الزجاج إلى نقطة غرامة (~ 30 ميكرون في افتتاح). يجب أن يكون ماصات باستور الزجاج سدادة قطنية لخلق حاجز لتدفق الهواء من المشغل.
    2. تعقيم الماصات الزجاج باستور ملتهب في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتعقيم.
  2. إعداد لوحات 96-جيدا للثقافة.
    1. إعداد البارد شبه صلبة الثقافة المتوسطة الاتفاقجي للبروتوكول وصفها سابقا 18.
    2. الاستغناء عن المتوسط ​​في الآبار الداخلية من لوحة 96-جيدا مسطحة القاع منخفضة ملزم في 100 ميكرولتر / جيدا باستخدام حقنة 1 مل. ملء الآبار الخارجي مع الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة.
    3. مكان الطبق الثقافة على الجليد حتى الاستخدام.
  3. إعداد خلايا الترتيب.
    1. إضافة ~ 6000 الخلايا التي تم جمعها من فارز إلى 2.5 الحجم النهائي مل من DMEM / F12 / PS تحتوي على 10٪ FCS و 1٪ ميثيل في أنبوب البوليسترين 5 مل. هزة بقوة لخلط المكونات. الانتظار لمدة 5 دقائق أو حتى فقاعات تطفو إلى أعلى الأنبوب. لا تحتاج هذه الخطوة التي يتعين القيام بها على الجليد.
    2. الاستغناء عن حل الخلية لمدة 35 أطباق مم في 1 مل / طبق باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 18 ½ G.
    3. نشر حل الخلية في الطبق هزاز بلطف الطبق باليد. لا تسمح المتوسطة شبه صلبة للوصول إلى هامش طبق 35 ملم، والخلايا واحدة في هامش القنا جيداملاحظتها بعد التمديد بشكل واضح استخدام مجهر الضوء المقلوب.
  4. إعداد مساحة العمل حول مجهر.
    1. جعل محلول يحتوي على DMEM / F-12 متوسطة و 1٪ ميثيل دون أي خلايا ( 'عدم الخلية المتوسطة)، والاستغناء عن الحل (كما هو موضح في 4.3.2) إلى قسمين 35 مم أطباق بتري (1 مل لكل طبق) .
    2. نظيفة ومسح منطقة العمل حول المجهر على النقيض من المرحلة مقلوب مع حل الكحول 70٪.
  5. تجميع ماصة مع قطعة الفم.
    1. اختيار العقيمة ماصة باستير الزجاج الذي تم إعداده في الخطوة 4.1. نعلق نهاية كبيرة من البلاستيك 1 مل ماصة إلى أعلى ماصة باستير الزجاج. نعلق نهاية صغيرة من البلاستيك 1 مل ماصة تلميح إلى واحدة من نهاية أنبوب المطاط رقيقة الجدران، ولسان حال إلى الطرف الآخر من الأنبوب. استخدام ماصة الزجاج نفسها لالتقاط عدة خلايا من نفس المجموعة.
    2. وضع، من خلال شفط الفم، حجم صغير (~ 10-50 ميكرولتر) من"لا خلايا" حل شبه صلبة مصنوعة في الخطوة 4.4.1 مع ماصة باستير الزجاج.
      ملاحظة: الحل شبه صلبة في فتحة ضيقة من ماصة باستير الزجاج يخلق مقاومة تدفق وتوفر حاجزا لمنع التلوث من الخلايا ويمكن الحصول عليها.
  6. اختيار خلية واحدة.
    1. مكان الطبق 35 ملم تحتوي على خلايا مرتبة على المسرح المجهر وإزالة الغطاء.
    2. العثور على الخلايا باستخدام 10X عدسة الهدف والتركيز على خلية مناسبة ويمكن الحصول عليها.
    3. البحث عن مكان افتتاح غيض ماصة بجانب الخلية من الفائدة. تطبيق شفط عن طريق الفم.
      ملاحظة: يجب أن تكون حركة الخلايا بطيئة جدا، حتى لا يكون هناك أي خطر من فقدان الخلية أثناء عملية في وقت لاحق. وينبغي أن تكون حركة الخلية دخول افتتاح ماصة مرئية. إذا يتحرك تدفق سريع للغاية، تغيير ماصة مع فتحة أضيق.
  7. إيداع خلية واحدة إلى حسنا الثقافة.
    1. مرة واحدة في الخلية في ماصة، واستخدام اللسان لوقف تدفق من خلال منع افتتاح قطعة الفم. وقفة لفترة وجيزة قبل سحب غيض من المتوسط ​​شبه صلبة لضمان أن تكون متوسطة شبه صلبة توقف المتدفقة.
    2. مكان غيض من ماصة في بئر في لوحة 96-جيدا أعدت في الخطوة 4.2. دفع الخلايا ببطء عن طريق النفخ برفق في قطعة الفم. علامة البئر بعد وتودع الخلية، لتجنب طلاء خليتين في بئر.
  8. التأكد من أن خلية واحدة وضعت في بئر الثقافة.
    1. مكان غيض ماصة في "لا خلايا" إعداد المتوسطة في الخطوة 4.4.1. مع مراعاة افتتاح غيض تحت المجهر، طرد الحل المتبقية شبه صلبة. نتوقع أي خلية في التدفق من طرف ماصة.
    2. إلى الاختيار المزدوج، والعثور على موقع في البئر الثقافة حيث تم زرع خلية واحدة.
  9. ثقافة الخلايا واحدة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة تصلإلى 3 أسابيع.

5. اختيار الفرد المستعمرات من ثقافة شبه الصلبة لتحليل ميكروفلويديك QRT-PCR

ملاحظة: بعد ثلاثة أسابيع من فرز الطلاء CD133 + Sox9 / EGFP + الخلايا في الفئران التي تحتوي على ECM مستعمرة الفحص، يتم تشكيل حلقة أو مستعمرات كثيفة 7 (الشكل 2). عندما يتم فصل الدائري / مستعمرات كثيفة في تعليق خلية واحدة وإعادة مطلي في الثقافة هيدروجيل laminin، يتم إنشاء المستعمرات الغدد الصماء / عنيبية بعد حوالي أسبوع واحد 7 (الشكل 2). لتحديد تكوين نسب كل مستعمرة، ويستخدم التحليل QRT-PCR ميكروفلويديك للكشف عن التعبير عن علامات النسب 7. لمرحلة ما قبل التضخيم، وهي مستعمرة مختلطة في مزيج الرئيسي يحتوي على مزيج TAQMAN التحقيق، رد فعل العازلة، ومرتفع الثالث 21. يتم استخدام رقاقة 48.48 مجموعة في وقت لاحق لردود الفعل PCR الموائع الدقيقة 21.

  1. إعداد ما قبل التضخيم PCRمزيج يحتوي على 48 تحقيقات.
    1. ماصة 1.5 ميكرولتر من كل مسبار TAQMAN (20x والأوراق المالية) في أنبوب 1.5 مل. إضافة 78 ميكرولتر من العازلة TE إلى ضبط مستوى الصوت إلى 150 ميكرولتر.
  2. تحضير مزيج الرئيسي عن طريق اتباع بروتوكولات من الشركة المصنعة 21.
  3. ضع 9 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل 0.2 مل أنبوب رد فعل رقيقة الجدران مناسبة لPCR، وكرر هذه الخطوة لمدة تصل إلى 48 الأنابيب.
  4. اختيار المستعمرات واحد من ثقافة شبه صلبة.
    ملاحظة: حلقة / مستعمرات كثيفة أكبر من المستعمرات الغدد الصماء / عنيبية، بأقطار تتراوح ما بين ~ 50-400 ميكرون 9،11. لذلك، يتم اختيار حلقة واحدة / مستعمرات كثيفة باستخدام pipettor P10 مزودة طرف ماصة 10 ميكرولتر أن عازمة إلى الشكل المنحني. للقبض على الغدد الصماء الصغيرة / المستعمرات عنيبية (الشكل 2)، الرجوع إلى الخطوة 4.
    1. تحديد موقع مستعمرة الفائدة في ظل تضخم مرتفع (على سبيل المثال، 20X عدسة الهدف)، والحد من التكبير، وaspiratالبريد المستعمرة. (اختياري) خذ صورة على النقيض من المرحلة المستعمرة في هذه الخطوة لتوثيق الخصائص المرئية للمستعمرة.
    2. نقل مستعمرة في أنبوب PCR يحتوي على 9 ميكرولتر من مزيج الرئيسي.
    3. اختيار مستعمرة المقبلة. ويمكن تحليل ما يصل الى 45 المستعمرات في المجموع في PCR المدى، وترك 3 نقاط لعناصر.
  5. استخراج الحمض النووي الريبي والتوليف [كدنا مع ما قبل التضخيم.
    1. دوامة العينات بقوة قبل تنفيذ رد فعل الحراري.
    2. أداء ردود الفعل الدراجات الحرارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 21. تتطلب عصابة / مستعمرات كثيفة 14 دورات، المستعمرات الغدد الصماء / عنيبية تتطلب 16-20 دورات، والخلايا واحدة تحتاج إلى 22 دورات.
      ويمكن تخزين ما قبل التضخيم cDNAs في -20 درجة مئوية قبل تحليل PCR ميكروفلويديك: ملاحظة.
  6. تشغيل تفاعلات PCR لاحقة، وذلك باستخدام رقاقة ميكروفلويديك، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 21.
6. كله جبل المناعية المستعمرات

  1. الحصاد وإصلاح المستعمرات.
    1. التقاط المستعمرات تحت المجهر، كما هو الحال في الخطوات من 4 أو 5.4، وإضافتها إلى حل لامتصاص العرق 4٪. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
    2. غسل المستعمرات مع 1X PBS مرتين لمدة 10-30 دقيقة في RT. تخزين المستعمرات ثابتة عند 4 درجات مئوية في 1.5 مل أنابيب مغلقة مع البارافين.
  2. وصمة عار على المستعمرات مع الأجسام المضادة.
    1. المستعمرات نقل إلى بئر واحدة من لوحة 96-جيدا السوداء مع قاع واضح تحتوي على 200 ميكرولتر من عرقلة العازلة (5٪ حمار و / أو مصل الماعز، 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X). احتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
    2. تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى تركيز محدد مسبقا (على سبيل المثال، 1: 500 عن الهامستر مكافحة الميوسين 1 الضد) باستخدام عازلة تمنع. نقل المستعمرات إلى نظيفة جيدا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الهز لطيف. Wرماد المستعمرات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.1٪ توين 20. نقل المستعمرات في بئر جديد مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X / توين 20 بنسبة 0.1٪ لمدة 10 دقيقة في RT لكل غسل.
    3. تمييع الأجسام المضادة الثانوية إلى تركيز محدد مسبقا (على سبيل المثال، 1: 2000 لماعز مكافحة الأرمن الأجسام المضادة الهامستر) باستخدام العازلة الحجب. إبقاء الحل في الظلام. نقل المستعمرات لتنظيف الآبار تحتوي على 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT. غسل المستعمرات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني / 0.1٪ توين 20، كما في الخطوة 6.2.2.
  3. المستعمرات مكافحة وصمة عار مع دابي وتصور مع المجهر متحد البؤر.
    1. نقل المستعمرات في الآبار مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 300 نانومتر دابي واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    2. نقل المستعمرات ملطخة دابي إلى 35 مم أسفل الزجاج طبق بيتري التصور. وضع زلة غطاء على رأس المستعمرات لمنع التبخر.
    3. استخدام المجهر متحد البؤر لالتقاط الصور. لتصور دابي staininز، استخدام اثنين من الفوتون الإثارة الطول الموجي من 730-950 نانومتر. استخدام ليزر الأرجون مع الطول الموجي 458 نانومتر لإثارة fluorochromes مع انبعاث موجات من 519 و 561 نانومتر. استخدام الليزر الهليوم نيون بطول موجي 633 نانومتر لإثارة fluorochromes مع انبعاث موجات من 665 نانومتر.

7. فصل وإعادة لوحة الابتدائية الدائري / الكثيفة المستعمرات في الثانوية مستعمرة فحوصات

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة. تجنب الصدمة الباردة إلى الخلايا في هذا الإجراء إلى أقصى حد ممكن، مثل وضع الخلايا على الجليد أو غسل الخلايا مع البرد PBS / جيش صرب البوسنة. هذه الممارسات تقلل من قابلية الخلايا مطلي إعادة.

  1. إعداد الحلول.
    1. غسل العازلة قبل الدافئ (DMEM / F12؛ P / S؛ 0.1٪ BSA) في 37 ° C حمام الماء.
    2. قبل دافئ لوحة 96-جيدا (مسطحة القاع، ملزمة منخفض) في الحاضنة 37 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرولتر 100٪ FCS إلى جانب واحد من لوحة و 100 ميكرولتر 0.25٪ حل التربسين-EDTA لثانية واحدةحسنا.
  2. جمع المستعمرات.
    1. انتقاء وتجميع ما مجموعه 20 أو أكثر الدائري / مستعمرات كثيفة في الثقافات الأولية باستخدام 10 ميكرولتر نصائح ماصة، كما هو موضح في الخطوة 5.4.
    2. وضع المستعمرات في الحارة (على الأقل RT) غسل العازلة (~ 1000 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل وتدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف.
  3. فصل المستعمرات إلى وحيدة الخلية تعليق باستخدام التربسين.
    1. نقل حجم المتبقية (20 ميكرولتر أو أقل)، الذي يحتوي على المستعمرات، في البئر الذي يحتوي الحل التربسين الدافئ (المعد في 7.1).
    2. احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية (وليس حمام مائي) لمدة 1.5 دقيقة. إزالة لوحة وماصة للمستعمرات عدة مرات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة أخرى.
    3. إزالة لوحة وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق المستعمرات. الاختيار تحت المجهر لمعرفة ما إذا كان قد تم تفريق المستعمرات في الغالب إلى تعليق وحيد الخلية.تجنب الإفراط في الهضم من المستعمرات.
  4. وقف رد الفعل التربسين التي كتبها إضافة FCS.
    1. نقل 100 ميكرولتر من السفح الحارة في البئر الذي يحتوي على الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل الخلايا في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1000 ميكرولتر غسل العازلة الدافئ. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    2. يغسل مرتين مع العازلة الدافئ.
    3. إعادة تعليق الخلايا في ~ 200 ميكرولتر من العازلة أو مستنبت.
  5. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الحفاظ على تعليق خلية في RT.
  6. إعادة لوحة نأت الخلايا في المقايسات مستعمرة الثانوية التي تحتوي إما بروتينات ECM الفئران (5٪ ت / ت) أو هيدروجيل laminin (100 ميكروغرام / مل)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: للحصول على إعادة طلاء الخلايا إلى بروتينات ECM الفئران، استخدم 2،500-5،000 خلايا لكل بئر والثقافة لمدة 2-3 أسابيع. لإعادة pating-في الثقافة هيدروجيل laminin، استخدم 10،000-25،000 الخلايا لكل بئر والثقافة عن 7-12 أيام.

النتائج

الخلايا الاولية البنكرياس الكبار يمكن إثراء مضان تنشيط الخلايا الفرز (الشكل 1). وقد ولدت Sox9 / EGFP خط الماوس المعدلة وراثيا المستخدمة هنا لأول مرة نتيجة لمشروع GENSAT الدماغ أطلس 19، ومراسل EGFP تحت سيطرة كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي...

Discussion

المقايسات مستعمرة البنكرياس ومستعمرة واحدة التحليلات الموصوفة هنا كانت مستوحاة من المقايسات مستعمرة المكونة للدم التي تحتوي على ميثيل التي لعبت دورا رئيسيا في فك رموز بيولوجيا الخلايا الاصلية المكونة للدم في العقود الماضية 23. في هذه المقايسات (الشكل 5)،

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

نشكر لوسي براون والكسندر Spalla من التحليل الخلوي الأساسية في مدينة الأمل للمساعدة في الفرز. ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01DK081587 وR01DK099734 إلى HTK، وU01DK089533 لADR، ومعهد المؤسسة الوطنية للعلوم منحة جبهة الخلاص الوطني DMR-1206121 وكاليفورنيا للطب التجديدي منحة RB5-07398 إلى DAT يدعم من معهد جوزيف جيه جاكوبس للهندسة الجزيئية للطب في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا لDAT، وتلك من مؤسسة أوكسنارد ومؤسسة إيلا فيتزجيرالد إلى HTK أيضا امتنان.

التمويل: ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01DK081587 وR01DK099734 إلى HTK، وU01DK089533 لADR، ومعهد المؤسسة الوطنية للعلوم منحة جبهة الخلاص الوطني DMR-1206121 وكاليفورنيا للطب التجديدي منحة RB5-07398 ل DAT يدعم من جوزيف جيه جاكوبسكما اعترف معهد الهندسة الجزيئية للطب في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا لDAT، وتلك من مؤسسة أوكسنارد ومؤسسة إيلا فيتزجيرالد إلى HTK العرفان. وشمل البحث الذي نشر في هذا المنشور العمل المنجز في التحليل الخلوي الأساسية والخفيفة المجهري الأساسية التصوير الرقمي بدعم من معهد السرطان القومي التابع لمعاهد الصحة الوطنية تحت رقم جائزة P30CA33572.

الراعي الدراسة: إن الراعي لا تشارك في تصميم الدراسة، وجمع، وتحليل، أو تفسير البيانات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Murine ECM proteins (Matrigel)Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)354230Stock kept at -20oC
Laminin HydrogelProvided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)Stock kept at -20oC
MethylcelluloseShinetsu Chemical (Tokyo, Japan)1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineMediatech (Manassas, VA, USA)21-031-CV
Phosphate Buffered SalineGibco (Grand Island, NY, USA)15070-063
50mL Flacon Conical vialCorning Inc. (Corning, NY, USA)352070
100mmx20mm Suspension culture dishCorning Inc. (Corning, NY, USA)430591
Bovine Serum AlbuminSigma (St. Louis, MO, USA)A8412
Penicillin/StreptomycinGibco (Grand Island, NY, USA)15070-063
DNase1Calbiochem (Darmstadt, Germany)260913
Collagenase BRoche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)11088831001Stock kept at -20oC
Anti-mouse CD16/32Biolegend (San Diego, CA, USA)101310low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype ControlBiolegend (San Diego, CA, USA)400522
Rat IgG1 κ Isotype ControleBioscience (San Diego, CA, USA)13-4301-82
Anti-CD133-BiotineBioscience (San Diego, CA, USA)13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7Biolegend (San Diego, CA, USA)113812
Streptavidin-AllophycocyaninBiolegend (San Diego, CA, USA)405207
4',6-Diamidino-2-phenylindoleInvitrogen (Waltham, MA,  USA)3571Stock kept at -20oC
Anti-mucin 1Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian HamsterJackson Immuno (West Grove, PA, USA)127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12Mediatech(Manassas, VA, USA)10-092-CV
Fetal Bovine SerumTissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)101Stock kept at -20oC
Tris Ethylenediaminetetraacetic acidTEKnova (Hollister, CA, USA)T0221
Rneasy Micro KitQiagen (Venlo, Netherlands)74004
QuantiTec Reverse Transcription KitQiagen (Venlo, Netherlands)205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitAmbion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)11753-100
ParaformaldehydeSanta Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)SC-281692
Goat serumJackson Immuno (West Grove, PA, USA)005-000-121Stock kept at -20oC
Donkey serumJackson Immuno (West Grove, PA, USA)0017-000-121Stock kept at -20oC
Triton X-100Sigma (St. Louis, MO, USA)T9284
TrypsinSigma (St. Louis, MO, USA)T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acidInvitrogen (Waltham, MA,  USA)15575-020
Trypsin-EDTALife Technologies (Waltham, MA, USA)25200-056
Sterile WaterGibco (Grand Island, NY, USA)15230-147Molecular biology grade
Pasteur PipetteFisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)13-678-8B
40um Filter MeshFisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)08-771-1
70 um filter meshFisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)08-771-2
TC Plate 96 Well SuspensionSarstedt83.3924 (Previously 83.1835)
1cc SyringeBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)309659
10cc SyringeBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)301604
48.48 Dyanmic Array ChipFluidigm (San Francisco, CA, USA)BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent KitFluidigm (San Francisco, CA, USA)85000800
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Grand Island, NY, USA)4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurateSigma (St. Louis, MO, USA)P7949
Glass Bottom DishMatTek (Ashland, MA, USA)P35G-1.5-14-C35 mm petri dish with glass bottom
Mouth Piece/ Rubber TubingRenova Life Inc. (College Park, MD, USA)MP-SET
NicotinamideSigma (St. Louis, MO, USA)N0636Stock kept at -20oC
Vascular Endothelial Growth FactorR&D Systems (Minneapolis, MN, USA)293-VEStock kept at -80oC
Activin BR&D Systems (Minneapolis, MN, USA)659-ABStock kept at -80oC
Extendin 4Sigma (St. Louis, MO, USA)E7144Stock kept at -20oC
Rspondin-1R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)3474-RSStock kept at -80oC
Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom TubeCorning Inc. (Corning, NY, USA)352054
PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)305196
PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate Corning Inc. (Corning, NY, USA)3473
Costar 96 Black Well PlateCorning Inc. (Corning, NY, USA)3603Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted MicroscopeCarl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell SorterBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)

References

  1. Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
  2. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  3. DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
  4. Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
  5. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  6. Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
  7. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  8. Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
  9. Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
  10. Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
  11. Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
  12. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
  13. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  14. Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
  15. Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
  16. Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
  17. Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
  18. Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
  19. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  20. Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
  21. Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
  22. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
  23. Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
  24. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  25. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
  26. Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
  27. Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112 FACS laminin PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved