מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Summary

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

Abstract

גזע ובתאים מהלבלב המבוגר יכולים להיות מקור פוטנציאלי של תאי בטא דמוי טיפולי לטיפול בחולי סוכרת מסוג 1. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם תאי גזע מולידם להתקיים בלבלב המבוגר. אסטרטגיות מחקר באמצעות-לקס cre שושלת-התחקות בעכברים בוגרים הניבו תוצאות כי גם תמיכה או להפריך את הרעיון כי תאי הבטא ניתן להפיק מן הצינורות, מיקומו המשוער שבו אבות לבלב מבוגרים עשויים להימצא. Vivo ב אלה שיטות cre-לקס התחקות השושלת, לעומת זאת, לא יכול לענות על השאלות של התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב השושלת צורך להגדיר תא גזע. כדי להתחיל פונה פער הטכני הזה, אנחנו ממציאים מבחני מושבה 3 ממדים עבור אבות לבלב. זמן קצר לאחר הפרסום הראשוני שלנו, מעבדות אחרות שפותחו באופן עצמאי דומה, אך לא זהה, שיטה המכונית assay organoid. בהשוואה assay organoid, השיטה שלנו מעסיקהmethylcellulose, המהווה פתרונות צמיגים המאפשרים הכללת החלבונים תאים מטריקס בריכוזים נמוכים. המבחנים המכיל methylcellulose להתיר זיהוי קל וניתוחים של ובתאים ברמת התא בודד, אשר הם קריטיים כאשר אבות מהווים אוכלוסייה-משנה קטן, כמו במקרה של תאי גזע איבר רבים מבוגר. יחד, תוצאות מכמה מעבדות להפגין במבחנת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאים דמויים לבלב מעכברים. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים שני מבחני מושבה מבוסס methylcellulose לאפיין אבות לבלב עכבר; אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבונים תאי מטריקס murine והשני חלבון תאי מטריקס מלאכותי המכונה הידרוג'ל laminin. הטכניקות המוצגות כאן הן 1) דיסוציאציה של הלבלב ומיון של CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ תאים ductal מעכברים בוגרים, 2) מניפולציה תא בודד של יםתאי orted, 3) מושבה אחת המנתח באמצעות immunostaining qRT-PCR ו כל ההר microfluidic, ו -4) דיסוציאציה של מושבות עיקריות לתוך תא בודד השעיות מחדש ציפוי לתוך מבחני מושבה משני להעריך התחדשות עצמית או בידול.

Introduction

הלבלב מורכב משלוש שושלות תאים עיקריות; תאים acinar להפריש אנזימי עיכול, צינוריות להפריש mucin להדוף פתוגנים ולהעביר אנזימי עיכול כדי במעיים, ותאי האנדוקרינית להפריש הורמונים, כולל אינסולין וגלוקגון, כי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז. במהלך ההתפתחות העוברית של הלבלב, תאי ductal מוקדם הם המקור של ובתאים תלת-עוצמה המסוגל והוליד שלושה שושלות של pancreata של בעלי חיים בוגרים ^1,2. מכיוון שתאי גזע ובתאים מבוגרים, כגון תאי גזע ממוח העצם, כבר משמשים בהצלחה לטיפול במגוון מחלות ^3, יש עניין רב במציאת תאי הגזע ועל מי שהגה בלבלב המבוגר. אם בידוד מניפולציה של תאי גזע ועל מי שהגה לבלב המבוגרים היו אפשריים, תאים אלה יכולים לשמש לטיפול במחלות כגון סוכרת מסוג 1, שבה תאי מפרישי האינסולין נהרסים על ידי אוטואימוניות.

s = "jove_content"> אם ובתאים תלת-עצמה עדיין קיימים צינוריות לבלב מבוגרות לאחר השלמת התפתחות עוברית היא שאלה התווכחה בכבדות בקהילה המדעית. בדיון זה, ושימוש in vivo cre-לקס השושלת-התחקות טכניקות, Inada ועמיתים לעבודה הראו כי תאי ductal בעכברים בוגרים שסומנו בסמן, anhydrase פחמתית השנייה, יכול מעוררים שלוש כל שושלות הלבלב ^4. עם זאת, באמצעות סמנים ductal אחרים, כגון HNF1b ⁵ ו Sox9 ^2, זה היה להסיק כי תאים ductal אינם המקור העיקרי של תאי בטא בעכברים בוגרים.

לפני מספר שנים, הצענו כי עילת הדיון הנ"ל יכולה להיות בגלל החוסר, בתחום ^6,7, של כלי אנליטיים מתאימים שיכול לשמש למדידת התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב שושלת צורך להגדיר תא גזע. טכניקת in vivo cre-לקס התחקות השושלת ציינההנ"ל יכול לספק ראיות קשר הצאצאים-אב ברמת אוכלוסייה. עם זאת, טכניקת התחקות בשושלת זו מוגבלת שביכולתה כדי להבחין אם ובתאים יחידים יכולים עצמי לחדש להתמיין שושלות מרובות. ניתוח מתא בודד חשוב כי אם אבות מונו-עוצמה כמה, כל אחד עם פוטנציאל באים ממשפחות שונות, נותחו יחד, הם עשויים להופיע באופן קולקטיבי יש יכולות בידול רב השושלת. בנוסף, תאי גזע הם בדרך כלל אוכלוסיית קטין של איבר בוגר. הפעילות של אוכלוסיית תא קטין יכולה להיות רעולה פנים על ידי האוכלוסייה הגדולה. לכן, תוצאה שלילית ממחקר האוכלוסייה אינה מעידה בהכרח על העדר תאי גזע. לבסוף, מעקב שושלת-לקס cre אינו מאפשר כרגע המדידה עצמית והתחדשות.

כדי להתחיל בהתמודדות טכנית הפער בתחום ביולוגיה של התא ובתאים הלבלב, המושבה ^7-11 או organoid ^12-15 באמצעות מערכות תרבות 3D תוכננו. שני מבחני מושבה עבור אבות לבלב פותחו במעבדה שלנו: אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבוני מטריקס murine התאיים (ECM) (ראה שיטות וציוד טבלה), והשני מכיל הידרוג'ל laminin, חלבון ECM מלאכותי מוגדר ^7-11. ובתאים מעורבבים methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק. Methylcellulose הוא חומר אינרטי וצמיג ביולוגית מוכן סיבי עץ, ויש בו נעשה שימוש באופן שגרתי מבחני המושבה hematopoietic ^16. את methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק מגביל את תנועתם של ובתאים יחידים, כך שהם לא יכולים מחדש המצרפי. עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תאים ובתאים לגדול להתמיין מושבה של תאים בחלל 3D. בהמשך למסורת של המטולוגים, תא ובתאים הלבלב כי היה מסוגל והוליד מושבה של תאים היה nאמד יחידת המושבה יוצרי הלבלב (PCFU). PCFUs, כאשר גדל ב assay המושבה ECM המכיל בעכברים, להצמיח מושבות פיברוזיס ששמם "טבעת" מושבות ^7. עם תוספת של אגוניסט Wnt, R-spondin1, לתוך תרבות ECM המכיל בעכברים, כמה מושבות טבעת לההפך "צפוף" מושבות ^7. במאמר זה, אלה שני סוגי מושבות הגדלים בתרבית ECM בעכברים הם יכונו "טבעת / צפופות" מושבות. כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבויות המכילות הידרוג'ל laminin, "האנדוקרינית / acinar" מושבות נוצרות ^7.

שימוש יחיד מושבה ניתוחית, נמצא כי רוב מושבות טבעת / סמיך האנדוקרינית / acinar, או ממבוגר (2-4 בן חודש) ^7,11 או צעיר (1 שבועות בן) ⁹ לבלב בעכברים, לבטא את כל השלושה סמני שושלת. הדבר מצביע על כך שרוב PCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. ב assay מושבת ECM המכיל בעכברים, PCFUs בעכברים הבוגר וחסון עצמי לחדש ולהרחיב כ -500,000 פעמים מעל 11 שבועות בתרבות ^7. ECM Murine מועדף תומך התמיינות של תאים ductal על שושלות האנדוקרינית acinar, ואילו בנוכחות הידרוג'ל laminin, PCFUs murine מעודדים להבדיל מועדף לתאי האנדוקרינית acinar ופחות אל שושלת ductal ^7,9,11. חשוב לציין, אינסולין ⁺ גלוקגון ^- תאי-הורמונלית מונתה נוצר בתרבות הידרוג'ל laminin ולהפריש אינסולין בתגובה לגלוקוז גירוי במבחנה ^7,9, דבר המצביע על בגרות פונקציונלית. הבידול תלת-השושלת ^7,9 פוטנציאל ההתחדשות עצמית ¹¹ של PCFUs הבודד אושר על ידי המיקרומניפולציה תא בודד, כלומר, culturing תא אחד לכל טוב עבור היווצרות מושבה. יחד, תוצאות אלו מספקים ראיות שיש עצמית חידוש,-poten תלתt, דמויי תאים ובתאים בלבלב בעכברים לאחר הלידה המציגות פעילויות בתרבות 3D.

מבחני PCFU murine המתואר במאמר זה לקוחים מתוך assay המושבה לפני המיועד ובתאים הבדיל מתאי גזע עובריים בעכברים (mESCs) ^17. פרוטוקול זה מתועד בפירוט אחר פרסום יופיטר ^18. הרכיבים וטכניקות התרבות נדרשו לבצע את assay מושבת ECM המכיל בעכברים עבור PCFUs המבוגר זהים עבור אבות נגזרות המסקלין ^17,18. לכן, היבטים אלה של assay לא יחזור על עצמו כאן; במקום הנהלים הבאים יטופלו: 1) דיסוציאציה של הלבלב מבוגר ומיון תאים CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ ductal, המעשירים PCFUs מעכברים בוגרים ^7, 2) מניפולציה תא בודד של תאים ממוינים, 3)-מושבה אחת מנתח באמצעות qRT-PCR ו כל הר immunostaining, ו -4) דיסוציאציה של Colonie microfluidicים לתוך ההשעיה תא בודד מחדש ציפוי לתוך ECM בעכברים או מבחני המושבה הידרוג'ל laminin.

Protocol

הצהרה אתית: אנו דבקי הסטנדרטים האתיים מקובל מחקר כדי להבטיח את האיכות ואת היושרה של התוצאות. ניסויים בבעלי חיים נערכים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש ב העיר של תקווה.

1. כן השעית תא בודד מתוך למבוגרים Murine pancreata

הערה: בפרסומים לפני ^7,11, CD-1 או רקע B6 עכברים שימשו; הן רקע הניב תוצאות דומות. קו עכבר מהונדס (המיועד Sox9 / EGFP) עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת מונע על ידי Sox9 לוקוסים ^19,20, נוצר ברקע CD-1.

1. להרדים 3 עד 5 עכברים בוגרים באמצעות גז CO ₂ למשך 1-2 דקות או עד מפסיק לנשום. לאחר מכן, לבצע פריקת צוואר רחם על כל עכבר.
2. לנתח ולהכין את pancreata.
   הערה: לנתח העכברים בהקדם האפשרי לאחר המתת חסד. זה חשוב כדי למנוע עיכול אוטומטי של הלבלב בשללשינויים שלאחר המוות.
   1. ביצוע חתך אנכי על קו האמצע של דופן הבטן של העכבר באמצעות מספריים ופתח את חלל הבטן. מצא את הטחול להשתמש במלקחיים כדי להרים אותו בעדינות. חותכים את רקמת החיבור בין הטחול ואת האונה הטחול של הלבלב עם מספריים.
      1. חזור על הנוהג הזה עבור אונות תריסריון קיבה של הלבלב. מניחים את רקמות הלבלב בצלחת פטרי על קרח המכיל פתרון חיץ פוספט שונה של קר Dulbecco (DPBS), אלבומין 0.1% שור (BSA), ו פניצילין סטרפטומיצין (P / S; פתרון מלא יועד PBS / BSA).
   2. הסר רקמות שומן מהלבלב תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים בסדר-קצה.
      הערה: זה קריטי עבור בריאותו של תאי לבלב ניתקו בשלבים הבאים.
      1. (אופציונלי) סמן את pancreata פלואורסצנטי ירוק תחת סטראו הקרינה באמצעות עירור ננומטר 488-509 כדי להבטיחביטוי EGFP.
   3. במנדף בתרבית רקמה, יש לשטוף את הרקמה שלושה ברצף פעמים בשלוש 100 מ"מ צלחות פטרי המכיל 10 מיליליטר של קר PBS / BSA.
3. צור חתיכות קטנות של רקמות.
   1. מעביר את pancreata גזור לצלחת יבשה סטרילית פטרי כדי להסיר כמה שיותר PBS / BSA ככל האפשר, ולהעבירם אחר צלחת פטרי יבשה על קרח.
   2. הכן PBS / BSA המכיל DNase אני על ידי הוספת 2 μl DNase אני פתרון מניות (1 מיליון יחידות [MU] / מ"ל) לכל 1 מ"ל PBS / BSA.
      הערה: פתרון זה מיועד PBS / BSA / DNase I. הפוך ~ 200 מ"ל של פתרון זה בבת אחת, אשר יכסה אחד הניסוי מיון.
   3. לרכך את pancreata באמצעות מספרי האביב במשך 2-3 דקות או עד הרקמה לחתיכות בסדר. להוסיף 2-3 מ"ל של קר PBS / BSA / DNase אני אל פיסות הרקמה בצלחת פטרי להשעות אותם.
   4. מעבירים את חתיכות רקמה על צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח עם טפטפת 10 מ"ל. תביאו את הנפח הכולל עד 10 מ"ל עם PBS / BSA / DNase l לאחר שהחלים רקמות ככל האפשר.
4. תקציר הבתרים הלבלב לתוך תאים בודדים בעיקר.
   1. להוסיף B collagenase (100 מ"ג / מ"ל ​​המניות) ב 350-450 μl / 10 מ"ל אל פיסות הרקמה דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 8 דקות, מתערבל כל 3-4 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל עם מחט 16 ½ G להכין ובהמשך לרסס הפתרון רקמות לאורך הקיר של הצינור 50 מ"ל ב RT. חזור שבע פעמים זה.
      הערה: השתמש מספיק כוח כדי לשבור את צבירי תאים, אך להימנע בועות יצירה שעשויה להרוג את התאים.
   2. החזר את הצינור אל באמבט מים ב 37 ° C במשך 8 דקות ומערבבים על ידי מתערבל כל דקות 3-4. מזרק הרקמה מעלה ומטה שבע פעמים, כאמור לעיל, ומניח מדגם (10 μl) של הפתרון רקם על צלחת פטרי יבשה. שים פתרון הרקמה תחת מיקרוסקופ הפוכה, שלב בניגוד, אור עם עדשה אובייקטיבית 10X. צפו תאים בודדים וכמה ג קטן בגודלאשכולות ell להיות נוכחים.
   3. טפלו התאים על הקרח מנקודה זו ואילך להאט או להפסיק את הפעילות של collagenase. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל באמצעות קר PBS / BSA / DNase I. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend ב 5 מ"ל של DNase קר PBS / BSA / I באמצעות pipettor P1000.
5. סנן להניב השעיות תא בודדות ולשטוף.
   1. סנן את התאים דרך כוס מסנן רשת ניילון 70 מיקרומטר ולאחר מכן דרך כוס מסנן רשת ניילון 40 מיקרומטר.
   2. Resuspend התאים 5 מ"ל קר PBS / BSA / DNase אני לספור את התאים.
      הערה: במשך 2-4 חודשים בן B6 או CD-1 עכברים, כל לבלב עשוי להניב ~ 5 או 10 מיליון תאים, בהתאמה. מספרים אלה עשויים להשתנות בין experimentalists השונה. אם פסולת תאים מופרזת נמצא בספירה, ולהביא את נפח עד 50 מ"ל עם קר PBS / BSA / DNase אני צנטריפוגות התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   3. כוון את עוצמת הקול של השעית התא בריכוז של 2 x 107 תאים מ"ל / באמצעות I. קר PBS / BSA / DNase

2. מיין לתאים עשר לבלב מושבת יוצרי אבות

הערה: מעכברים B6, CD133 ⁺ אבל לא CD133 ^- תאים מועשרים עבור PCFUs ^7,9,11. תאי CD133 ⁺ מייצגים ~ 13% מכלל תושבי העיר ניתקים לתאי לבלב לאחר שכל פרמטרי gating מוחלים ^11. מ CD-1 עכברים, CD133 ⁺ Sox9-EGFP ⁺ תאים בדרך כלל מייצגים ~ 4% של תאי לבלב מוחלטים, אוכלוסיית תא זה היא מועשר עבור PCFUs ^7. מיון של תאי CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ מתואר כאן.

1. להכתים את תאי הלבלב ניתק.
   1. חסום את ההשעיה תא בודד הלבלב כולו להפחית את הלא ספציפית מחייב ידי דוגרים ההשעיה תא יחיד עם CD16 אנטי עכבר / 32 בשעה 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי עבור 5 דקות על הקרח.
   2. הסרת aliquot של 1 x 10 ⁶ תאים (50 &# 181; l) להכתים עם נוגדן אלוטיפ, IgG1 עכברוש מצומדות ביוטין ב 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי, במשך 20 דקות על הקרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
   3. הסרת aliquot של 1 x 10 ⁶ תאים (50 μl) ולשמור על הקרח כפקד בלא כתם.
   4. הכתם שארית התאים עם נוגדן ראשוני ביוטין מצומדות אנטי עכבר CD133, בשעה 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי, במשך 20 דקות על הקרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
2. תאי כביסה.
   1. שטפו את אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני על ידי הבאת את עוצמת הקול עד 1 מ"ל עם PBS / BSA / DNase אני צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. חזור על שלב זה כביסה.
   2. Resuspend שליטה אלוטיפ דגימות מוכתם הנוגדן העיקרי PBS / BSA / DNase אני, כך הריכוז הסופי הוא 2 x 10 ⁷ תאים / מ"ל.
3. הכתם אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני עם streptavidin (STV) allophycocyanin -labeled (APC) בשעה 2 & #181; g / ml ריכוז סופי. דגירה במשך 15 דקות על קרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
4. כביסה תאים ו -4 ', 6-diamidino-2-phenylindole מכתים (DAPI).
   1. שטפו את אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני פעמיים עם אני PBS / BSA / DNase, כמו בשלב 2.2. Resuspend התאים PBS / BSA / DNase אני עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל). ההיקף הסופי של מדגם שליטת אלוטיפ צריך להיות 0.5 מיליליטר.
      הערה: ודא כי הצפיפות הסופית של מדגם הנוגדן מוכתם העיקרי מתאימה הסדרן לשמש. ריכוז של 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל משמש באופן שגרתי למיון.
   2. כוון את עוצמת הקול של תאים בלא כתם 0.5 מ"ל עם PBS / BSA / PS / DNase I. מסנן כל התאים דרך רשת 20 מיקרומטר לפני מיון לשמור על התאים על הקרח בחושך.
5. מיון התאים.
   1. השתמש זרבובית 80 מיקרומטר או גדולים למיון.
      הערה: תאי האנדוקרינית לבלב Murine נוטים ללחץ פיזי. הוwever, PCFUs בעכברים אינו מופיע להיות מושפע הלחץ שנגרם על ידי עובר דרך סדרן ^7.
   2. רוכשת אירועים התא ופרמטרים ניתוח על סדרן. שער התאים עבור קדימה באזורי פיזור הצד להוציא תא פסול ^7. שער עבור רוחבי קדימה פיזור בצד להוציא כפילויות התא. שער להוציא DAPI ⁺ תאים מתים ^7. בחר gating פרמטרים עבור אותות EGFP ו CD133-APC המושתתים על הערכים מתא אלוטיפ (איור 1).
   3. אוספים את התאים מסודרים לתוך 5 מ"ל צינורות פוליסטירן המכיל 1.5 מ"ל של מדיום DMEM / F12 בתוספת 5% נסיוב עגל עוברית (FCS). צנטריפוגה האוכלוסיות מיון ב 400 XG במשך 5 דקות ו resuspend בנפח קטן (~ 200 μl) של או DMEM / F12 או PBS / BSA / DNase אני בתוספת 5% FCS. שמור את התאים על הקרח עד לשימוש.
6. ספירת CD133 ⁺ Sox9-EGFP ⁺ תאים המתקבלים הסדרן. קח10 מדגם תא μl לספור את התאים עם hemacytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים.
   הערה: שימוש hemacytometer מומלץ כי ספירת מכונית מן הסדרן היא בדרך כלל לא אמינה.

3. פלייט תאים ממוינים לתוך Assay המושבה המכילים חלבונים Murine ECM

הערה: עיין פרוטוקולים מפורטים עבור ציפוי של תאים לתוך assay המושבה ECM המכיל murine אחר פרסום יופיטר ^18.

1. כן תרבות מדיה.
   1. כן בינוני תרבות המכיל בינוני DMEM / F12, 1% (wt / v) methylcellulose, 5% (v / v) חלבוני ECM בעכברים, 50% (v / v) בינוני מותנות מתאי לבלב דמוי המסקלין נגזר, 5% (v / v) FCS, 10 מילימול / nicotinamide L, 10 ng / B Activin רקומביננטי אנושי מ"ל, 0.1 nmol / L exendin-4, ו -1 ng / הצמיחה של אנדותל כלי הדם מ"ל גורם-A. שיטות להפקת המדיום המותנה מפורטות במקום אחר ^18.
   2. להוסיף 750 ng / ml של RSPO-1 עד בינוניאם היווצרות מושבה צפופה היא רצויה.
   3. דגירת תרבות חלבון ECM בעכברים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 3 שבועות.

4. התרבות תאים ממוינים ב 1 נייד לכל טוב

הערה: ההליכים הבאים חלים על מניפולציה תאים בודדים באמצעות טפטפות היד לפה. גישה חלופית היא לרכוש micromanipulator. Micromanipulator טיפוסי כולל מיקרוסקופ הפוך עם פלטפורמת ג'ויסטיק מופעל, ממונע.

1. כן פיפטות פסטר זכוכית.
   1. באמצעות מבער בונזן, להוציא את קצה פיפטה פסטר זכוכית לנקודת קנס (~ 30 מיקרומטר בפתיחה). את pipettes הזכוכית פסטר צריך פקק כותנה כדי ליצור מחסום לזרימת האוויר מהמפעיל.
   2. חיטוי טפטפות זכוכית פסטר להטה ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עבור עיקור.
2. כן 96-פלטות היטב לתרבות.
   1. כן הסכם בינוני תרבות חצי מוצק קרing לפרוטוקול שתואר לעיל ^18.
   2. מחלק את המדיום לתוך הבארות הפנימיות של צלחת 96-היטב נמוכה מחייבת שטוח תחתון ב 100 μl / גם באמצעות מזרק 1 מיליליטר. מלא את הבארות החיצוניות עם מים סטריליים כדי לשמור על לחות.
   3. מניחים את צלחת תרבות על הקרח עד לשימוש.
3. הכן את התאים הממוינים.
   1. הוסף ~ 6,000 תאים שנאספו סדרן 2.5 נפח סופי מ"ל של DMEM / F12 / PS FCS המכיל 10% ו methylcellulose 1% בתוך שפופרת קלקר 5 מ"ל. לנער במרץ כדי לערבב את המרכיבים. מתן 5 דקות או עד הבועות לצוף אל החלק העליון של הצינור. צעד זה אינו צריך להתבצע על קרח.
   2. מחלקים את פתרון התא לשני מנות 35 מ"מ ב 1 מ"ל / תבשיל באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 18 ½ מחט G.
   3. מורחים את פתרון התא בצלחת ידי נדנדה המנה בעדינות ביד. אל תאפשרו בינוני חצי מוצק להגיע למרווח של המנה 35 מ"מ, כמו תאים בודדים בשוליים של cann היטבot להיות נצפה בבירור באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה.
4. הכן את משטח העבודה בסביבות מיקרוסקופ.
   1. הכן תמיסה המכילה DMEM / F-12 methylcellulose בינוניים 1% ללא כל התאים (בינוני "אין תאים '), ולחלק את הפתרון (כמתואר 4.3.2) לשתי 35 מ"מ צלחות פטרי (1 מ"ל לכל צלחת) .
   2. נקי ולנגב את אזור העבודה סביב מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך עם פתרון אלכוהול 70%.
5. הרכב את פיפטה עם חתיכת הפה.
   1. פיק פיפטה פסטר זכוכית סטרילית כי היה מוכן בשלב 4.1. חבר את הקצה הגדול של קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל לחלק העליון של פיפטה פסטר זכוכית. חבר את הקצה הקטן של קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל ל קצה אחד של צינור גומי דק דופן, ואת שופר אל הקצה השני של הצינור. השתמש באותו פיפטה זכוכית להרים מספר תאים מאותה קבוצה.
   2. צייר למעלה, על ידי יניקת פה, נפח קטן (~ 10 עד 50 μl) של"אין תאים" חצי מוצק פתרון עשה צעד 4.4.1 עם פיפטה פסטר זכוכית.
      הערה: הפתרון חצי מוצק על הפתח הצר של פיפטה הזכוכית פסטר יוצרת התנגדות זרימה מספקת מחסום על מנת למנוע זיהום של התאים להיות ניטל.
6. בחר תא יחיד.
   1. מניחים את צלחת 35 מ"מ המכיל את התאים מסודרים על הבמה מיקרוסקופ ולהסיר את המכסה.
   2. מצא את התאים באמצעות עדשה 10X אובייקטיבי התמקדות תא מתאים להיות נטל.
   3. מצא ומניחים פתיחת קצה פיפטה ליד התא של עניין. החל יניקה דרך הפה.
      הערה: התנועה של התא צריכה להיות די איטית, כך שאין סיכון לאבד את התא במהלך התהליך מאוחר יותר. התנועה של תא הזנת פתיחת פיפטה צריכה להיות גלויה. אם הזרימה נעה מהר מדי, לשנות כדי פיפטה עם פתח צר.
7. להפקיד את התא הבודד לתוך באר תרבות.
   1. לאחר התא נמצא פיפטה, להשתמש בלשון לעצור את הזרימה על ידי חסימת פתיחת פי החתיכה. השהה בקצרה לפני נסיגת הקצה מהמדיום חצי המוצק כדי להבטיח כי המדיום חצי מוצק הפסיק לזרום.
   2. הניחו את קצה פיפטה לתוך באר צלחת 96-היטב מוכן בשלב 4.2. לדחוף את התא לאט על ידי נושבת בעדינות לתוך חתיכת הפה. מארק הבאר לאחר התא מופקד, כדי למנוע ציפוי שני תאים לתוך באר.
8. ודא כי תא בודד מושם ובכן תרבות.
   1. הניחו את קצה פיפטה ב 'לא-תא' מוכן בינוני בשלב 4.4.1. תוך שמירה על פתיחת הקצה תחת מיקרוסקופ, לדחוף את הפתרון חצי מוצק נותרים. צפו שום תא לזרום החוצה את קצה פיפטה.
   2. כדי לבדוק פעמים, למצוא את המיקום גם בתרבות שבה התא הבודד הושתל.
9. תרבות תאים אחת ב 37 ° C ב 5% CO ₂ עדעד 3 שבועות.

5. פיק מושבות הפרט מ תרבות חצי-מוצק עבור ניתוח Microfluidic qRT-PCR

הערה: שלושה שבועות לאחר הציפוי מסודר CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ תאים לתוך assay ECM המכיל המושבה בעכברים, טבעת או מושבות צפופות נוצרות ⁷ (איור 2). כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבות הידרוג'ל laminin, מושבות האנדוקרינית / acinar נוצרות לאחר כשבוע ⁷ (איור 2). כדי לקבוע את הרכב שושלת היוחסין של כל מושבה, ניתוח microfluidic qRT-PCR משמש כדי לזהות את הביטוי של סמני שושלת ^7. עבור הגברה מראש, מושבה ממוזגת תערובת אמן המכיל תערובת בדיקת TaqMan, מאגר תגובה, ואת עילי III ^21. השבב 48.48 מערך מכן משמש תגובות microfluidic PCR ^21.

1. הכן את ההגברה מראש PCRלערבב המכיל 48 בדיקות.
   1. פיפטה 1.5 μl של כל בדיקה TaqMan (מלאי 20x) בצינור 1.5 מ"ל. להוסיף 78 μl של חיץ TE כדי לכוונן את עוצמת הקול כדי 150 μl.
2. מכינים את תערובת אמן על ידי הבאים פרוטוקולים מהיצרן ^21.
3. מניחים 9 μl של תמהיל מאסטר לתוך צינור כל תגובה 0.2 מ"ל דק דופן מתאים PCR, וחזור על שלב זה עד 48 צינורות.
4. פיק מושבות אחת מן התרבות חצי מוצק.
   הערה: הטבעת / מושבות צפופות שגודלם עולים על מושבות האנדוקרינית / acinar, עם בקטרים ​​הנעים בין 50 ~ 400 מיקרומטר ^9,11. לכן, צלצול יחיד / מושבות צפופות נקטפות באמצעות pipettor P10 לבוש עם קצה פיפטה 10 μl מקופל לתוך צורה מעוגלת. עבור לקטוף את האנדוקרינית הקטנה / מושבות acinar (איור 2), מתייחס לשלב 4.
   1. אתר מושבה של עניין בהגדלה גבוהה (למשל, עדשה אובייקטיבית 20X), להפחית את ההגדלה, ו aspiratדואר המושבה. (אופציונאלי) קח תמונת שלב ניגודיות של המושבה בשלב זה לתעד את המאפיינים הגלויים של המושבה.
   2. מעבירים את המושבה לתוך הצינור PCR המכיל 9 μl של תמהיל מאסטר.
   3. פיק למושבה הבאה. עד 45 מושבות בסך הכל ניתן לנתח לכל בטווח PCR, עוזבות 3 נקודות עבור פקדים.
5. מיצוי RNA וסינתזה cDNA עם הגברה מראש.
   1. וורטקס הדגימות במרץ לפני ביצוע התגובה התרמית.
   2. בצע את תגובות רכיבת תרמית על פי הוראות היצרן ^21. מושבות טבעת / צפופות דורשות 14 מחזורים, האנדוקרינית / מושבות acinar דורשות 16-20 מחזורים, תאים בודדים דורשים 22 מחזורים.
      הערה: cDNAs הגברת קדם ניתן לאחסן ב -20 ° C לפני ניתוח PCR microfluidic.
6. הפעל PCR תגובות עוקבות, באמצעות שבב microfluidic, על פי הוראות היצרן ^21.

6. Immunostaining מושבות ההר השלמה

1. קציר ולתקן מושבות.
   1. תרימי המושבות מתחת למיקרוסקופ, כמו בשלבים 4 או 5.4, ולהוסיף אותם פתרון paraformaldehyde 4%. דגירה O / N ב 4 ° C עם רעד עדין.
   2. שטוף את המושבות עם 1X PBS פעמים במשך 10-30 דקות ב RT. אחסן את המושבות הקבועות ב 4 ° C ב 1.5 מיליליטר צינורות חתומים עם פרפין.
2. כתם המושבות עם נוגדנים.
   1. מושבות העברה אחד טובה של צלחת שחורה 96-היטב עם תחתית שקופה המכילה 200 μl של חיץ חסימה (חמורים 5% ו / או סרום עיזים, 0.1% Triton X-100 ב PBS 1x). דגירה O / N ב 4 ° C עם רעד עדין.
   2. לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז שנקבע מראש (למשל, 1: 500 עבור אוגר נגד mucin 1 נוגדן) באמצעות חסימת חיץ. מעביר את המושבות נקיות היטב עם 200 μl של נוגדן ראשוני, דגירת O / N ב 4 ° C עם רעד עדין. Wאפר המושבות 3 פעמים עם PBS המכיל 0.1% Tween 20. העברת המושבות לתוך באר חדשה עם 200 μl של 1x PBS / 0.1% Tween 20 במשך 10 דקות ב RT עבור כל שטיפה.
   3. לדלל את הנוגדנים משני לריכוז שנקבע מראש (למשל, 1: 2,000 נוגדן אוגר עז נגד ארמני) באמצעות חיץ חסימה. שמור את הפתרון בחושך. מעביר את המושבות לנקות בארות המכילות 200 μl של נוגדנים משני, דגירה במשך שעה 2 ב RT. שטפו את מושבות 3 פעמים עם PBS / 0.1% Tween 20, כמו בשלב 6.2.2.
3. מושבות מתפרצות כתם עם DAPI ולדמיין עם מיקרוסקופיה confocal.
   1. מעביר את המושבות לתוך בארות עם PBS המכיל 300 ננומטר DAPI דגירה במשך 5 דקות ב RT.
   2. מעבירים את מושבות DAPI מוכתם לצלחת זכוכית התחתונה פטרי 35 מ"מ לשם ויזואליזציה. במקום להחליק על גבי העטיפה של מושבות על מנת למנוע אידוי.
   3. שימוש במיקרוסקופ confocal כדי ללכוד את התמונות. כדי להמחיש DAPI staining, השתמש גל עירור שני פוטונים של 730-950 ננומטר. השתמש לייזר ארגון עם אורך גל של 458 ננומטר לרגש fluorochromes עם אורכי גל הפליטה של ​​ננומטר 519 ו 561. השתמש לייזר הליום-נאון עם אורך גל של 633 ננומטר לרגש fluorochromes עם אורכי גל הפליטה של ​​665 ננומטר.

7. לנתק ו Re-צלחת ראשית טבעת / מושבות צפופות לתוך מבחני מושבה משנית

הערה: כל הנהלים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. הימנע הלם קר אל התאים בהליך זה ככל האפשר, כגון הצבת תאים על תאי קרח או שטיפה עם PBS קר / BSA. שיטות אלה מצמצמות את הכדאיות של תאים מצופים מחדש.

1. הכינו פתרונות.
   1. חיץ לשטוף טרום חמים (DMEM / F12; P / S; 0.1% BSA) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   2. טרום לחמם צלחת 96-היטב (תחתית שטוחה; נמוך המחייבת) בתוך 37 ° C חממה. הוספת 100 μl 100% FCS כדי גם אחד צלחת 100 μl פתרון 0.25% טריפסין- EDTA על השניטוֹב.
2. אסוף המושבות.
   1. פיק וברכת סך של 20 או יותר טבעת / מושבות צפופות בתרבויות ראשוניות באמצעות 10 טיפי פיפטה μl, כפי שמתוארת בשלב 5.4.
   2. מניחים את מושבות חם (לפחות RT) חיץ לשטוף (בערך 1000 μl) בצינור 1.5 מ"ל ספין ב 400 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
3. לנתק את המושבות לתוך תא בודד השעיות באמצעות טריפסין.
   1. מעביר את נפח הנותרים (20 μl או פחות), אשר מכיל את המושבות, לבאר המכיל פתרון טריפסין חם (שהוכן 7.1).
   2. דגירה את הצלחת באינקובטור 37 ° C (לא באמבט מים) עבור 1.5 דקות. הסר את הצלחת ו פיפטה מושב כמה פעמים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות אחרות.
   3. הסר את את הצלחת ו פיפטה ולמטה עוד כמה פעמים כדי לשבור את המושבות. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם המושבות פוזרו בעיקר לתוך השעית תא בודד.הימנע-עיכול על המושבות.
4. לעצור את התגובה טריפסין ידי הוספת FCS.
   1. העברת 100 μl של FCS החם לתוך הבאר המכילה את התאים. עד פיפטה ולמטה כמה פעמים. העברת התאים לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 1,000 μl חיץ לשטוף חם. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב RT.
   2. שטפו פעמיים עם חיץ חם.
   3. Re- להשעות את התאים ~ 200 μl של חיץ או בינוני תרבות.
5. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. שמור את ההשעיה תא ב RT.
6. Re-צלחת תאים ניתק לתוך מבחני המושבה משני המכיל גם חלבונים ECM בעכברים (5% v / v) או הידרוג'ל laminin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   הערה: לקבלה מחדש תאי ציפוי לחלבוני ECM בעכברים, השתמש 2,500-5,000 תאים לכל היטב בתרבות במשך 2-3 שבועות. לקבלת מחדש pating לתוך תרבות הידרוג'ל laminin, השתמש 10,000-25,000 תאים לכל טוב ותרבות 7-12 ימים.

תוצאות

ניתן להעשיר תאי בוגרים ובתאי לבלב על ידי מיון תא מופעל קרינה (איור 1). שורת העכבר המהונדס Sox9 / EGFP משמשת כאן נוצרה הראשונה כתוצאה של פרויקט אטלס מוח GENSAT ^19, ואת כתב EGFP נמצא תחת השליטה של כרומוזום חיידקים מלאכותי המכיל ~ 75 kb במעלה או ~ 150 kb רצפ?...

Discussion

מבחני מושבת לבלב המושבה אחת ניתוחי המתואר כאן נוצרו בהשראת מבחני מושבת hematopoietic המכיל methylcellulose אשר שחקו תפקיד מכריע בפענוח הביולוגיה של תאי אבות היווצרות דם בעשורים האחרונים ^23. מבחנים אלה (איור 5), תאים ניתקים לבלב הם מצופים לתוך methylcellulose המכיל תקשורת חצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murine ECM proteins (Matrigel)	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	354230	Stock kept at -20oC
Laminin Hydrogel	Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)		Stock kept at -20oC
Methylcellulose	Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)		1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Mediatech (Manassas, VA, USA)	21-031-CV
Phosphate Buffered Saline	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
50mL Flacon Conical vial	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352070
100mmx20mm Suspension culture dish	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	430591
Bovine Serum Albumin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412
Penicillin/Streptomycin	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
DNase1	Calbiochem (Darmstadt, Germany)	260913
Collagenase B	Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)	11088831001	Stock kept at -20oC
Anti-mouse CD16/32	Biolegend (San Diego, CA, USA)	101310	low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control	Biolegend (San Diego, CA, USA)	400522
Rat IgG1 κ Isotype Control	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-4301-82
Anti-CD133-Biotin	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7	Biolegend (San Diego, CA, USA)	113812
Streptavidin-Allophycocyanin	Biolegend (San Diego, CA, USA)	405207
4',6-Diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	3571	Stock kept at -20oC
Anti-mucin 1	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)	HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Mediatech(Manassas, VA, USA)	10-092-CV
Fetal Bovine Serum	Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)	101	Stock kept at -20oC
Tris Ethylenediaminetetraacetic acid	TEKnova (Hollister, CA, USA)	T0221
Rneasy Micro Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	74004
QuantiTec Reverse Transcription Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)	11753-100
Paraformaldehyde	Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)	SC-281692
Goat serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	005-000-121	Stock kept at -20oC
Donkey serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	0017-000-121	Stock kept at -20oC
Triton X-100	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T9284
Trypsin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acid	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	15575-020
Trypsin-EDTA	Life Technologies (Waltham, MA, USA)	25200-056
Sterile Water	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15230-147	Molecular biology grade
Pasteur Pipette	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	13-678-8B
40um Filter Mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-1
70 um filter mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-2
TC Plate 96 Well Suspension	Sarstedt	83.3924 (Previously 83.1835)
1cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	309659
10cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	301604
48.48 Dyanmic Array Chip	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	85000800
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)	4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P7949
Glass Bottom Dish	MatTek (Ashland, MA, USA)	P35G-1.5-14-C	35 mm petri dish with glass bottom
Mouth Piece/ Rubber Tubing	Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)	MP-SET
Nicotinamide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	N0636	Stock kept at -20oC
Vascular Endothelial Growth Factor	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	293-VE	Stock kept at -80oC
Activin B	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	659-AB	Stock kept at -80oC
Extendin 4	Sigma (St. Louis, MO, USA)	E7144	Stock kept at -20oC
Rspondin-1	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	3474-RS	Stock kept at -80oC
Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352054
PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305196
PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3473
Costar 96 Black Well Plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3603	Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope	Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell Sorter	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)