In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

Résumé

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

Résumé

Souches et les cellules progénitrices du pancréas adultes pourraient être une source potentielle de cellules bêta comme thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de diabète de type 1. Cependant, il est encore impossible de savoir si les cellules souches et progénitrices existent dans le pancréas adulte. Les stratégies de recherche à l'aide de cre-lox lignée-tracing chez les souris adultes ont donné des résultats qui soutiennent ou réfutent l'idée que les cellules bêta peuvent être générées à partir des canaux, l'emplacement présumé où adultes progéniteurs pancréatiques peuvent résider. Ces méthodes de lignage-tracing in vivo cre-lox, cependant, ne peuvent pas répondre aux questions de l' auto-renouvellement et multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. Pour commencer à répondre à cette lacune technique, nous avons conçu des essais de colonies en 3 dimensions pour progéniteurs pancréatiques. Peu après notre publication initiale, d'autres laboratoires développés indépendamment un similaire, mais pas identique, méthode appelée le test organoide. Par rapport à l'essai organoide, notre méthode emploieméthylcellulose, qui forme des solutions visqueuses qui permettent l'inclusion de protéines de matrice extracellulaire à faibles concentrations. Les essais contenant méthylcellulose-permettent la détection et l'analyse de cellules progénitrices au niveau d'une seule cellule, qui sont critiques quand progéniteurs constituent un petit sous-population plus facile, comme cela est le cas pour de nombreuses cellules souches d'organes adultes. Ensemble, les résultats de plusieurs laboratoires démontrent dans la différenciation in vitro auto-renouvellement et multi-lignée de cellules progénitrices comme pancréatiques de souris. Les protocoles actuels décrivent deux colonies des essais à base de méthylcellulose à caractériser les progéniteurs pancréatiques de souris; une contient une préparation commerciale de protéines de la matrice extracellulaire de souris et l'autre une protéine de matrice extracellulaire artificielle connue sous le nom d'un hydrogel de la laminine. Les techniques présentées ici sont 1) la dissociation du pancréas et le tri des CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ cellules canalaires de souris adultes, 2) la manipulation de la cellule unique des scellules SOUTENUS, 3) analyse seule colonie en utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation des colonies primaires dans une seule cellule suspensions et re-placage dans des essais de colonies secondaires pour évaluer l'auto-renouvellement ou de la différenciation.

Introduction

Le pancréas se compose de trois principales lignées cellulaires; cellules acineuses sécrètent des enzymes digestives, les conduits sécrètent mucine pour repousser les agents pathogènes et le transport des enzymes digestives dans l'intestin, et les cellules endocrines sécrètent des hormones, y compris l'insuline et le glucagon, qui maintiennent l'homéostasie du glucose. Au cours du développement embryonnaire du pancréas, les cellules canalaires précoces sont la source des cellules progénitrices tri-puissant capable de donner naissance aux trois lignées dans le pancréas d'animaux adultes ^1,2. Parce que les cellules souches et progénitrices adultes, telles que les cellules souches de la moelle osseuse, sont déjà utilisés avec succès pour traiter diverses maladies ^3, il y a un intérêt intense pour trouver les cellules souches et progénitrices dans le pancréas adulte. Si l'isolement et la manipulation de cellules souches et progénitrices pancréatiques adultes étaient possibles, ces cellules peuvent être utilisées pour traiter des maladies telles que le diabète de type 1, dans lequel les cellules sécrétant de l'insuline sont détruites par auto-immunité.

Que les cellules progénitrices tri-puissants existent encore dans les canaux pancréatiques adultes après l'achèvement du développement embryonnaire est une question qui est fortement débattue dans la communauté scientifique. Dans ce débat, et en utilisant in vivo cre-lox lignage techniques de traçage, Inada et ses collègues ont montré que les cellules canalaires murins adultes marqués avec un marqueur, l' anhydrase carbonique II, pourraient donner lieu à tous les trois lignées pancréatiques ^4. Cependant, l' utilisation d' autres marqueurs, tels que canalaires HNF1B ⁵ et Sox9 ^2, on a conclu que les cellules canalaires ne sont pas la principale source des cellules bêta chez des souris adultes.

Il y a plusieurs années, nous avons proposé que la cause du débat précité peut être dû à l'absence, dans le domaine de ^6,7, des outils d' analyse appropriés qui peuvent être utilisés pour mesurer l' auto-renouvellement et de multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. La technique in vivo de la lignée de traçage cre-lox dans mentionnéci-dessus peuvent fournir des preuves de la relation progéniteur-descendants au niveau de la population. Cependant, cette technique de traçage de la lignée est limitée dans son pouvoir de discerner si les cellules progénitrices simples peuvent se renouveler et de se différencier en plusieurs lignées. analyse unicellulaire est importante, car si plusieurs progéniteurs mono puissants, chacun ayant un potentiel de lignée différente, ont été analysés ensemble, ils peuvent apparaître collectivement avoir de lignées multiples capacités de différenciation. En outre, les cellules souches sont habituellement une population mineure d'un organe adulte. Les activités d'une population de cellules mineures pourraient être masqués par la population majeure. Par conséquent, un résultat négatif à partir d'une étude de population ne signifie pas nécessairement l'absence de cellules souches. Enfin, cre-lox lignée traçage ne permet pas actuellement la mesure de l'auto-renouvellement.

Pour commencer à répondre à l'écart technique dans le domaine de la biologie du pancréas de cellules progénitrices, colonie ^7-11 ou ^12-15 organoide essais utilisant des systèmes de culture 3D ont été conçus. Deux essais de colonies pour progéniteurs pancréatiques ont été développés dans notre laboratoire: l' un contient une préparation commerciale de murins protéines de la matrice extracellulaire (ECM) (voir Méthodes et Tableau équipement), et l'autre contient la laminine hydrogel, une artificielle protéine ECM définie ^7-11. Les cellules progénitrices sont mélangés dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Methylcellulose est un matériau biologiquement inerte et visqueux préparé à partir de fibres de bois et a été utilisée en routine dans des essais de colonies hématopoïétiques ^16. La méthylcellulose contenant un milieu semi-solide limite le mouvement de cellules souches individuelles de sorte qu'elles ne peuvent pas re-agrégat. Pourtant, le milieu est suffisamment souple pour permettre une cellule progénitrice de croître et de se différencier en une colonie de cellules dans l'espace 3D. Suivant la tradition des hématologues, une cellule pancréatique progénitrices qui a été capable de donner naissance à une colonie de cellules était named une unité formant colonie pancréatique (PCFU). PCFUs, lorsqu'il est cultivé dans l'essai de colonie contenant ECM-murin, donnent naissance à des colonies kystiques qui sont nommés colonies "Ring" ^7. Lors de l' addition d'un agoniste Wnt, R-spondin1, dans la culture contenant de l' ECM-murin, certaines colonies Anneau transformer en colonies "denses" ^7. Dans cet article, ces deux types de colonies cultivées dans la culture de l'ECM murin sont collectivement appelés «anneaux / denses" colonies. Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans les cultures qui contiennent laminine hydrogel, colonies "Endocrine / acineuses" sont formés ^7.

En utilisant une seule colonie analyses, il a été constaté que la majorité des colonies Ring / denses et Endocrine / acineuses, soit à partir des adultes (2-4 month-old) ^7,11 ou jeune (1 week-old) ⁹ pancréas de souris, d' exprimer tous les trois marqueurs de la lignée. Cela suggère que la plupart des PCFUs originaires sont tri-puissant. Dans l'essai de colonies contenant ECM-murin, PCFUs murin adulte robuste auto-renouvellement et l' expansion d' environ 500.000 fois plus de 11 semaines dans la culture ^7. ECM murine supporte de préférence la différenciation des cellules canalaires sur le système endocrinien et acineuses lignées, tandis qu'en présence de laminine hydrogel PCFUs murins sont encouragés à se différencier préférentiellement dans les cellules endocrines et acineuses et moins à la lignée canalaire ^7,9,11. Surtout, Insuline Glucagon ^{+ -} Les cellules mono-hormonal sont générés dans la culture d'hydrogel de la laminine et de sécréter de l' insuline en réponse au glucose in vitro de stimulation de ^7,9, ce qui suggère la maturité fonctionnelle. La différenciation potentielle ^7,9 tri-lignée et l' auto-renouvellement de ¹¹ PCFUs individuels sont confirmés par micromanipulation une seule cellule, à savoir, la mise en culture d' une cellule par puits pour la formation de colonies. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves qu'il existe des auto-renouvellement, le tri-potenT, des cellules souches, comme dans le pancréas de souris post-natale qui montrent des activités dans la culture 3D.

Les essais de PCFU murins décrits dans cet article sont issus d'un essai de colonie avant conçu pour les cellules progénitrices différenciées à partir de cellules murines embryonnaires souches (mESCs) ^17. Ce protocole est documenté en détail dans une autre publication JoVE ^18. Les composants et les techniques nécessaires pour réaliser le dosage de la colonie de souris contenant ECM pour adultes PCFUs culture sont les mêmes que pour les progéniteurs MESC dérivées ^17,18. Par conséquent, ces aspects de l'essai ne seront pas répétées ici; place les procédures suivantes seront abordées: 1) la dissociation du pancréas adulte et de tri CD133 ⁺ Sox9 / EGFP ⁺ cellules canalaires, qui enrichissent PCFUs de souris adultes ^7, 2) la manipulation de cellules isolées des cellules triées, 3) une seule colonie analyses utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation de colonies en suspension à cellule unique et re-placage dans ECM murin ou laminine essais hydrogel de colonies.

Protocole

Déclaration éthique: Nous adhérons aux normes éthiques largement acceptées dans la conduite de la recherche pour assurer la qualité et l'intégrité des résultats. L'expérimentation animale est effectuée selon des protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation Comité à City of Hope.

1. Préparer Suspension simple cellule à partir de Adult murin pancreata

NOTE: Dans les publications antérieures ^7,11, souris CD-1 ou de fond B6 ont été utilisés; les deux milieux ont donné des résultats similaires. Une lignée transgénique de souris (désigné Sox9 / EGFP) avec une meilleure protéine de fluorescence verte tirée par Sox9 loci ^19,20, a été créé dans le CD-1 fond.

1. Euthanasier 3 à 5 souris adultes en utilisant le CO ₂ gazeux pendant 1-2 min ou jusqu'à ce que les arrêts respiratoires. Ensuite, effectuez la dislocation cervicale sur chaque souris.
2. Disséquer et Préparer le pancreata.
   NOTE: Disséquer les souris dès que possible après l'euthanasie. Ceci est important pour éviter l'auto-digestion du pancréas en raisonaux changements post-mortem.
   1. Faire une incision verticale sur la ligne médiane de la paroi abdominale de la souris à l'aide de ciseaux et d'ouvrir la cavité abdominale. Trouver la rate et l'utilisation de pinces pour soulever doucement. Coupez le tissu conjonctif entre la rate et le lobe splénique du pancréas avec des ciseaux.
      1. Répétez cette pratique pour les lobes duodénaux et gastriques du pancréas. Placer les tissus du pancréas dans une boîte de Petri sur de la glace contenant de modification du tampon phosphate de la solution froide Dulbecco (DPBS), 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et de la pénicilline et de la streptomycine (P S /; solution complète désignée comme PBS / BSA).
   2. Retirer les tissus adipeux du pancréas sous un microscope à dissection en utilisant une pince à pointe fine.
      NOTE: Ceci est essentiel pour la santé des cellules pancréatiques dissociées dans les étapes suivantes.
      1. (Facultatif) Cochez la pancreata pour la fluorescence verte sous le stéréomicroscope de fluorescence en utilisant 488-509 nm d'excitation pour assurerexpression EGFP.
   3. Dans une culture tissulaire capot, rincer le tissu trois fois successivement dans trois boîtes de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de froid du PBS / BSA.
3. Générer des petits morceaux de tissus.
   1. Transférez le pancreata disséqués à une boîte de Pétri stérile sec pour enlever autant PBS / BSA que possible, et de les transférer à une autre boîte de Pétri à sec sur la glace.
   2. Préparer PBS / BSA contenant DNase I en ajoutant DNase I solution mère de 2 pi (1 million d'unités [MU] / ml) par 1 ml de PBS / BSA.
      NOTE: Cette solution est désignée PBS / BSA / DNase I. Faire ~ 200 ml de cette solution à la fois, qui couvrira une expérience de tri.
   3. Émincer le pancreata avec des ciseaux à ressort pendant 2-3 min ou jusqu'à ce que le tissu est en petits morceaux. Ajouter 2 à 3 ml de froid du PBS / BSA / DNase I aux morceaux de tissus dans la boîte de Petri pour les suspendre.
   4. Transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 ml sur de la glace avec une pipette de 10 ml. Porter le volume total à 10 ml avec du PBS / BSA / DNase l après avoir récupéré autant de tissu que possible.
4. Digest du pancréas en cellules Pièces Mostly simples.
   1. Ajouter collagénase B (100 mg / ml stock) 350-450 pi / 10 ml aux morceaux de tissu et incuber le tissu à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 8 min, en remuant toutes les 3-4 min. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 16 G ½ à élaborer et ensuite pulvériser la solution de tissu vers le bas de la paroi du tube de 50 ml à la température ambiante. Répétez cette opération sept fois.
      REMARQUE: Utilisez assez de force pour briser les amas de cellules, mais éviter les bulles de génération qui peuvent tuer les cellules.
   2. Retourner le tube dans le bain d'eau à 37 ° C ° C pendant 8 minutes et mélanger par tourbillonnement toutes les 3-4 min. Seringue le tissu vers le haut et vers le bas jusqu'à sept fois, comme mentionné ci-dessus, et de placer un échantillon (10 ul) de la solution de tissu sur une boîte de Petri à sec. Observer la solution de tissu sous, à contraste de phase inversée, microscope optique avec un objectif 10X. Attendez-vous à des cellules individuelles et une petite taille cgrappes ell d'être présents.
   3. Manipuler les cellules sur la glace à partir de ce moment pour ralentir ou arrêter l'activité de la collagénase. Ajuster le volume à 50 ml en utilisant le froid du PBS / BSA / DNase I. centrifuge les cellules à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 5 ml de froid du PBS / BSA / ADNase I à l'aide d'une pipette P1000.
5. Filtre à Rendement Suspensions cellulaires simples et Wash.
   1. Filtrer les cellules à travers un 70 um maille de nylon tasse de filtre, puis à travers un 40 um maille de nylon filtre coupe.
   2. Resuspendre les cellules dans 5 ml de PBS froid / BSA / DNase I et compter les cellules.
      NOTE: Pour 2-4 mois vieux B6 ou des souris CD-1, chaque pancréas peut produire ~ 5 ou 10 millions de cellules, respectivement. Ces chiffres peuvent varier entre les différents expérimentateurs. Si les débris cellulaires en excès est trouvé à comptage, amener le volume à 50 ml avec du PBS froid / BSA / ADNase I et centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C.
   3. Régler le volume de la suspension cellulaire à une concentration de 2 x 107 cellules / ml en utilisant froid PBS / BSA / DNase I.

2. Trier les cellules pancréatiques à Enrichissez progéniteurs formant des colonies

NOTE: De souris B6, CD133 ⁺ mais pas CD133 ^- cellules sont enrichies en PCFUs ^7,9,11. Les cellules CD133 ⁺ représentent environ 13% du total dissocie les cellules pancréatiques après que tous les paramètres de déclenchement sont appliqués ^11. De souris CD-1, les cellules CD133 ⁺ Sox9-EGFP ⁺ représentent généralement 4% de cellules pancréatiques totales, et cette population cellulaire est enrichie pour PCFUs ^7. Tri des cellules / EGFP ⁺ Sox9 CD133 ⁺ est décrite ici.

1. Colorer les cellules dissociées pancréatiques.
   1. Bloquer la totalité de la suspension de cellules isolées du pancréas pour réduire la liaison non spécifique en faisant incuber la suspension à cellule unique avec un anti-souris CD16 / 32 à 10 pg / ml de concentration finale pendant 5 min sur la glace.
   2. Retirer une aliquote de 1 x 10 ⁶ cellules (50 &# 181; l) pour colorer avec l'anticorps de contrôle d'isotype, IgG1 de rat conjugué à la biotine à 5 ug / ml de concentration finale, pendant 20 minutes sur la glace, en agitant chaque 5-7 min.
   3. Retirer une aliquote de 1 x 10 ⁶ cellules (50 pi) et de garder sur la glace comme un témoin non coloré.
   4. Teindre le reste des cellules avec un anticorps primaire anti-souris conjugué à la biotine CD133, à 5 ug / ml de concentration finale, pendant 20 min sur de la glace, en agitant toutes les 5-7 min.
2. Les cellules de lavage.
   1. Laver le contrôle isotypique des anticorps et des échantillons tachés primaires en amenant le volume à 1 ml avec du PBS / BSA / ADNase I et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape de lavage.
   2. Remettre en suspension le contrôle isotypique des anticorps et des échantillons tachés primaires dans du PBS / BSA / ADNase I, de sorte que la concentration finale est de 2 x 10 ⁷ cellules / ml.
3. Colorer le contrôle isotypique et des échantillons d'anticorps colorés primaires avec de la streptavidine (STV) de allophycocyanine marqué au (APC) à 2 & #181, g / ml de concentration finale. Incuber pendant 15 min sur la glace, tourbillonnant chaque 5-7 min.
4. Lavage des cellules et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
   1. Laver le contrôle isotypique et des échantillons d'anticorps primaires tachée deux fois avec PBS / BSA / DNase I, comme dans l'étape 2.2. Resuspendre les cellules dans PBS / BSA / DNase I avec DAPI (0,2 pg / ml concentration finale). Le volume final de l'échantillon témoin d'isotype doit être de 0,5 ml.
      REMARQUE: Assurez-vous que la densité finale de l'échantillon d'anticorps teinté primaire est approprié pour la trieuse à utiliser. Une concentration de 5 x 10 ⁶ cellules / ml est couramment utilisée pour le tri.
   2. Réglez le volume des cellules non colorées à 0,5 ml avec du PBS / BSA / PS / DNase I. Filtrez toutes les cellules à travers un maillage de 20 um avant le tri et de garder les cellules sur la glace dans l'obscurité.
5. Tri des cellules.
   1. Utiliser une buse de 80 um ou plus pour le tri.
      REMARQUE: les cellules endocrines pancréatiques murins sont sujettes à un stress physique. However, PCFUs murins ne semblent pas être affectés par le stress causé par le passage à travers un trieur ^7.
   2. Acquérir des événements cellulaires et des paramètres d'analyse sur la trieuse. Porte des cellules pour l' avant et les zones de dispersion latérale pour exclure les débris cellulaires ^7. Porte pour des largeurs de l'avant et de dispersion latérale pour exclure doublets cellulaires. Porte d'exclure DAPI ⁺ cellules mortes ^7. Gating choisir les paramètres pour les signaux EGFP et CD133-APC en fonction des valeurs issues des cellules de contrôle isotypique (figure 1).
   3. Recueillir les cellules triées dans 5 ml de tubes de polystyrène contenant 1,5 ml de milieu DMEM / F12 supplémenté avec 5% de sérum de foetus de veau (FCS). Centrifuger les populations triées à 400 g pendant 5 minutes et remise en suspension dans un petit volume (~ 200 ul) soit de DMEM / F12 ou du PBS / BSA / DNase I additionné de 5% de FCS. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à utilisation.
6. Comptez le nombre de cellules CD133 ⁺ Sox9-EGFP ⁺ obtenus à partir de la trieuse. Prenez un10 ul de l'échantillon de cellules et compter les cellules avec un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire.
   NOTE: L'utilisation de Hémacytomètre est recommandée car la machine compte de la trieuse sont souvent peu fiables.

3. Plate les cellules triées dans la colonie de dosage contenant murins ECM Protéines

NOTE: S'il vous plaît se référer aux protocoles détaillés pour le dépôt des cellules dans le dosage de la colonie contenant ECM-murin dans une autre publication JoVE ^18.

1. Préparer Culture Media.
   1. Préparer un milieu de culture contenant du milieu DMEM / F12, 1% (poids / volume) de méthylcellulose, 5% (v / v) de protéines d'ECM murines, 50% (v / v) de milieu conditionné à partir de cellules pancréatiques analogue MESC dérivés, 5% (v / v) de FCS, de 10 mmol / l de nicotinamide, 10 ng / ml d'activine B humaine recombinante, 0,1 nmol / L Exendin-4, et 1 ng / ml de facteur vasculaire, une croissance endothélial. Des procédés pour générer le milieu conditionné sont détaillées ailleurs ^18.
   2. Ajouter 750 ng / ml de 1 RSPO au milieusi la formation de colonies denses est souhaitée.
   3. Incuber la culture des protéines ECM murin à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 3 semaines.

4. Culture des cellules triées à 1 cellule par puits

REMARQUE: Les procédures suivantes sont applicables à la manipulation des cellules individuelles à l'aide de pipettes à la main et la bouche. Une approche alternative est d'acheter un micromanipulateur. Un micromanipulateur typique comprend un microscope inversé avec une plate-forme motorisée joystick actionné.

1. Préparer verre Pasteur Pipettes.
   1. L'utilisation d'un brûleur Bunsen, tirer la pointe d'une pipette Pasteur en verre à une pointe fine (~ 30 pm à l'ouverture). Les pipettes Pasteur en verre doivent avoir un bouchon de coton pour créer une barrière à l'écoulement d'air de l'opérateur.
   2. Autoclave les flammées pipettes Pasteur en verre à 121 ° C pendant 20 min pour la stérilisation.
2. Préparer des plaques à 96 puits pour la culture.
   1. Préparer froid semi-solide milieu de culture accordment le protocole décrit précédemment ^18.
   2. Répartir le milieu dans les puits internes d'une plaque de 96 puits à fond plat à faible liaison à 100 pl / puits en utilisant une seringue de 1 ml. Remplir les puits extérieurs avec de l'eau stérile pour maintenir l'humidité.
   3. Placer le plat de la culture sur la glace jusqu'à utilisation.
3. Préparer les cellules triées.
   1. Ajouter ~ 6.000 cellules recueillies à partir d'une trieuse à 2,5 volume final ml de DMEM / F12 / PS contenant 10% de FCS et 1% de méthylcellulose dans un tube 5 ml de polystyrène. Agiter vigoureusement pour mélanger les composants. Attendez 5 min ou jusqu'à ce que les bulles flottent à la surface du tube. Cette étape n'a pas besoin d'être effectuée sur la glace.
   2. Distribuer la solution de cellules à deux boîtes de 35 mm à 1 ml / plat en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 18 G ½.
   3. Répartir la solution de cellules dans le plat en secouant délicatement le plat à la main. Ne pas laisser le milieu semi-solide pour atteindre le bord de la boîte de 35 mm, comme les cellules individuelles à la marge de l'cann de puitsot être observée en utilisant clairement un microscope à lumière inversée.
4. Préparer la zone de travail autour d'un microscope.
   1. Préparer une solution contenant du DMEM / F-12 et 1% de méthylcellulose sans cellules (milieu «sans cellule), et distribuer la solution (comme décrit au point 4.3.2) en deux boîtes de Petri de 35 mm (1 ml par boîte) .
   2. Nettoyez et essuyez la zone de travail autour d'un microscope inversé à contraste de phase avec une solution d'alcool à 70%.
5. Assembler le Pipette avec la pièce Mouth.
   1. Choisissez une pipette Pasteur en verre stérile qui a été préparé à l'étape 4.1. Attacher la grande extrémité d'une pointe de pipette en plastique de 1 ml en haut de la pipette Pasteur en verre. Fixer la petite extrémité de l'embout de pipette en plastique de 1 ml à une extrémité d'un tube en caoutchouc à paroi mince, et l'embout buccal à l'autre extrémité du tube. Utiliser la même pipette en verre pour capter plusieurs cellules du même groupe.
   2. Dresser, par la bouche d'aspiration, un petit volume (~ 10 à 50 pi) de la«Non-cell" solution semi-solide faite à l'étape 4.4.1 avec la pipette Pasteur en verre.
      REMARQUE: La solution semi-solide à l'ouverture étroite de la pipette Pasteur en verre crée une résistance d'écoulement et fournit une barrière pour empêcher la contamination des cellules à prélever.
6. Choisissez une cellule unique.
   1. Placer le plat de 35 mm contenant les cellules triées sur la platine du microscope et retirez le couvercle.
   2. Trouver les cellules en utilisant une lentille et mise au point objectif 10X sur une cellule apte à être choisi.
   3. Trouvez et placer l'ouverture de la pointe de la pipette à côté de la cellule d'intérêt. Appliquer aspiration par la bouche.
      NOTE: La motion de la cellule devrait être assez lent, de sorte qu'il n'y a aucun risque de perdre la cellule pendant le processus plus tard. Le mouvement de la cellule entrant dans l'ouverture de la pipette doit être visible. Si le flux se déplace trop vite, changer pour une pipette avec une ouverture plus étroite.
7. Déposez la cellule unique dans une culture bien.
   1. Une fois que la cellule se trouve dans la pipette, utiliser la langue pour arrêter l'écoulement en bloquant l'ouverture de l'embout buccal. Faites une courte pause avant de retirer la pointe du milieu semi-solide pour assurer que le milieu semi-solide a cessé de couler.
   2. Placez la pointe de la pipette dans un puits dans la plaque de 96 puits préparé à l'étape 4.2. Poussez la cellule lentement en soufflant doucement dans la pièce de bouche. Marquer le puits après que la cellule est déposée, afin d'éviter le placage deux cellules dans un puits.
8. Assurez-vous que une seule cellule est placée dans un puits de culture.
   1. Placez la pointe de la pipette dans le «non-cellule" milieu préparé à l'étape 4.4.1. Tout en observant l'ouverture de la pointe sous le microscope, pousser la solution semi-solide restant. Attendez-vous pas de cellule à écouler la pointe de la pipette.
   2. Pour une double vérification, trouver l'emplacement dans le puits de culture où la cellule unique a été implantée.
9. Cultiver les cellules isolées à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant3 semaines.

5. Choisissez individuelle Colonies de culture semi-solide pour l'analyse microfluidique qRT-PCR

REMARQUE: Trois semaines après le placage triée CD133 ⁺ / eGFP ⁺ Sox9 dans l'essai de colonie contenant ECM-souris, l' anneau ou des colonies denses sont formées ⁷ (figure 2). Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans la culture d'hydrogel de la laminine, les colonies Endocrine / acineuses sont générées après environ une semaine ⁷ (Figure 2). Pour déterminer la composition de la lignée de chaque colonie, l' analyse microfluidique qRT-PCR est utilisée pour détecter l'expression des marqueurs de la lignée ^7. Pour la pré-amplification, une colonie est mélangé dans un mélange maître contenant une sonde mix TaqMan, tampon de réaction, et SuperScript III ^21. La puce 48.48 de tableau est ensuite utilisé pour des réactions PCR microfluidiques ^21.

1. Préparer la pré-amplification par PCRmélanger contenant 48 sondes.
   1. Pipette 1,5 pi de chaque sonde TaqMan (20x stock) dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 78 ul de tampon TE pour régler le volume à 150 pi.
2. Préparer le mélange maître en suivant les protocoles du fabricant ^21.
3. Placez 9 pi de mélange maître dans chacun 0,2 ml tube de réaction à paroi mince appropriés pour la PCR, et répétez cette étape jusqu'à 48 tubes.
4. Choisissez des colonies isolées de la culture semi-solide.
   NOTE: Ring / colonies denses sont plus grandes que les colonies Endocrine / acineuses, avec des diamètres allant de ~ 50 à 400 um ^9,11. Par conséquent, seul anneau / colonies denses sont cueillies à l'aide d'une pipette P10 équipé d'une pointe de pipette 10 ul qui est plié en une forme incurvée. Pour choisir le petit Endocrine / colonies acineuses (Figure 2), reportez - vous à l' étape 4.
   1. Localiser une colonie d'intérêt à fort grossissement (par exemple, 20X objectif), réduire l'agrandissement, et aspirate la colonie. (Facultatif) Prendre une image à contraste de phase de la colonie à cette étape afin de documenter les caractéristiques visibles de la colonie.
   2. Transférer la colonie dans le tube PCR contenant 9 pi de mélange maître.
   3. Choisissez la prochaine colonie. Jusqu'à 45 colonies au total peuvent être analysés par essai PCR, en laissant 3 points pour les contrôles.
5. Extraction d'ARN et synthèse d'ADNc avec pré-amplification.
   1. Vortex les échantillons vigoureusement avant d'effectuer la réaction thermique.
   2. Effectuez les réactions de cyclage thermique selon les instructions du fabricant ^21. Anneau / colonies denses nécessitent 14 cycles, les colonies Endocrine / acineuses nécessitent 16-20 cycles, et des cellules individuelles nécessitent 22 cycles.
      NOTE: Pré-amplification des ADNc peuvent être conservés à -20 ° C avant l'analyse microfluidique PCR.
6. Exécuter des réactions de PCR ultérieures, en utilisant une puce microfluidique, selon les instructions du fabricant ^21.

6. Whole Mont immunocoloration des Colonies

1. Récolte et Fix Colonies.
   1. Ramassez les colonies sous le microscope, comme dans les étapes 4 ou 5.4, et les ajouter à une solution de paraformaldéhyde à 4%. Incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce.
   2. Laver les colonies avec 1X PBS deux fois pour 10-30 min à température ambiante. Stocker les colonies fixées à 4 ° C dans 1,5 ml des tubes scellés avec de la paraffine.
2. Colorer les colonies avec des anticorps.
   1. colonies de transfert à un puits d'une plaque de 96 puits noir avec un fond clair contenant 200 pi de tampon de blocage (5% âne et / ou de sérum de chèvre, 0,1% de Triton X-100 dans PBS 1x). Incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce.
   2. Diluer l'anticorps primaire à une concentration prédéterminée (par exemple, 1: 500 pour le hamster anti mucine anticorps 1) en utilisant un tampon de blocage. Transférer les colonies à un endroit propre bien avec 200 pi d'anticorps primaire, et incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce. Wcendres des colonies 3 fois avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20. Transfert des colonies dans un nouveau puits avec 200 ul de 1 x PBS / Tween 20 0,1% pendant 10 min à température ambiante pour chaque lavage.
   3. Diluer l'anticorps secondaire à une concentration pré-déterminée (par exemple, 1: 2000 pour l' anticorps de hamster anti-arménienne de chèvre) en utilisant un tampon de blocage. Conserver la solution dans l'obscurité. Transférer les colonies pour nettoyer les puits contenant 200 pi d'anticorps secondaire, et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Laver les colonies 3 fois avec PBS / 0,1% de Tween 20, comme dans l'étape 6.2.2.
3. colonies contre-tache avec DAPI et visualiser par microscopie confocale.
   1. Transférer les colonies dans les puits avec du PBS contenant 300 nM DAPI et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
   2. Transférer les colonies DAPI-colorées à un plat à fond de verre de Pétri 35 mm pour la visualisation. Placez une lamelle sur le dessus des colonies pour empêcher l'évaporation.
   3. Utiliser un microscope confocal pour capturer les images. Pour visualiser DAPI staining, utiliser excitation à deux photons longueur d'onde de 730-950 nm. Utiliser un laser à argon à une longueur d'onde de 458 nm pour exciter des fluorochromes ayant des longueurs d'onde d'émission de 519 et 561 nm. Utiliser un laser hélium-néon avec une longueur d'onde de 633 nm pour exciter des fluorochromes avec des longueurs d'onde d'émission de 665 nm.

7. Dissocier et Re-plaque primaire Ring / Dense Colonies dans secondaires Colony Assays

NOTE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Éviter le choc froid aux cellules dans cette procédure, autant que possible, comme mettre les cellules sur la glace ou le lavage des cellules avec PBS froid / BSA. De telles pratiques réduisent la viabilité des cellules re-plaquées.

1. Préparer Solutions.
   1. tampon de lavage pré-chaud (DMEM / F12; P / S, 0,1% de BSA) dans un bain d'eau à 37 °.
   2. Préchauffer une plaque de 96 puits (fond plat, une faible liaison) dans un incubateur à 37 °. Ajouter 100 ul de 100% de FCS, à un puits de la plaque et d'une solution de trypsine-EDTA 100 ul de 0,25% à une deuxièmebien.
2. Collecter Colonies.
   1. Choisissez et mettre en commun un total de 20 ou plus Anneau / colonies denses dans des cultures primaires à l'aide de pointes de pipette 10 pi, tel que décrit à l'étape 5.4.
   2. Placez les colonies dans un endroit chaud (au moins RT) tampon de lavage (~ 1000 pi) dans un tube de 1,5 ml et un essorage à 400 g pendant 5 min. Retirer le surnageant.
3. Dissocier les colonies dans Suspensions de cellules uniques à l'aide de trypsine.
   1. Transférer le volume restant (20 pi ou moins), qui contient les colonies dans le puits contenant une solution de trypsine à chaud (préparé en 7.1).
   2. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° (et non un bain d'eau) pendant 1,5 min. Retirer la plaque et la pipette les colonies à quelques reprises. Incuber à 37 ° C pendant encore 1,5 min.
   3. Retirer la plaque et la pipette de haut en bas un peu plus de temps pour briser les colonies. Vérifiez sous le microscope pour voir si les colonies ont été dispersées principalement en suspension à cellule unique.Évitez de trop-digestion des colonies.
4. Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant FCS.
   1. Transférer 100 ul de FCS chaud dans le puits qui contient les cellules. Pipette monter et descendre plusieurs fois. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml contenant 1000 pi de tampon de lavage chaud. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Laver deux fois avec un tampon chaud.
   3. Resuspendre les cellules dans ~ 200 pi de tampon ou un milieu de culture.
5. Comptez le nombre de cellules en utilisant un hématimètre. Gardez la suspension cellulaire à la température ambiante.
6. Re-plaque cellules dans des essais de colonies secondaires contenant soit des protéines de la MEC de souris (5% v / v) ou de la laminine hydrogel (100 pg / ml) dissociées et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   NOTE: Pour ré-étalement des cellules dans les protéines d'ECM murins, utilisez 2,500-5,000 cellules par puits et de la culture pendant 2-3 semaines. Pour re-cipants dans la culture d'hydrogel de laminine, utilisez 10,000-25,000 cellules par puits et la culture pour 7-12 jours.

Résultats

Cellules progénitrices pancréatiques adultes peuvent être enrichis par fluorescence activée par tri cellulaire (Figure 1). La lignée de souris transgéniques Sox9 / EGFP utilisé ici d' abord été généré à la suite du projet GENSAT Brain Atlas ^19, et le rapporteur de l' EGFP est sous le contrôle d'un chromosome bactérien artificiel contenant ~ 75 kb en amont et ~ 150 kb des séquences en aval de Sox9 ²⁰ . Chez ces souris, EGF...

Discussion

Les essais de colonies pancréatiques et seule colonie analyses décrites ici ont été inspirés par les hématopoïétiques essais de colonies contenant de méthylcellulose qui ont joué un rôle majeur dans le décryptage de la biologie des cellules souches hématopoïétiques dans les dernières décennies ^23. Dans ces essais (Figure 5), dissociées des cellules pancréatiques sont étalées dans des milieux semi-solides avec des facteurs de croissance appropriés et des protéines d'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murine ECM proteins (Matrigel)	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	354230	Stock kept at -20oC
Laminin Hydrogel	Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA)		Stock kept at -20oC
Methylcellulose	Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan)		1500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15g/cm/s) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Mediatech (Manassas, VA, USA)	21-031-CV
Phosphate Buffered Saline	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
50mL Flacon Conical vial	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352070
100mmx20mm Suspension culture dish	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	430591
Bovine Serum Albumin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412
Penicillin/Streptomycin	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15070-063
DNase1	Calbiochem (Darmstadt, Germany)	260913
Collagenase B	Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland)	11088831001	Stock kept at -20oC
Anti-mouse CD16/32	Biolegend (San Diego, CA, USA)	101310	low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control	Biolegend (San Diego, CA, USA)	400522
Rat IgG1 κ Isotype Control	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-4301-82
Anti-CD133-Biotin	eBioscience (San Diego, CA, USA)	13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7	Biolegend (San Diego, CA, USA)	113812
Streptavidin-Allophycocyanin	Biolegend (San Diego, CA, USA)	405207
4',6-Diamidino-2-phenylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	3571	Stock kept at -20oC
Anti-mucin 1	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA)	HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Mediatech(Manassas, VA, USA)	10-092-CV
Fetal Bovine Serum	Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA)	101	Stock kept at -20oC
Tris Ethylenediaminetetraacetic acid	TEKnova (Hollister, CA, USA)	T0221
Rneasy Micro Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	74004
QuantiTec Reverse Transcription Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit	Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA)	11753-100
Paraformaldehyde	Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA)	SC-281692
Goat serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	005-000-121	Stock kept at -20oC
Donkey serum	Jackson Immuno (West Grove, PA, USA)	0017-000-121	Stock kept at -20oC
Triton X-100	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T9284
Trypsin	Sigma (St. Louis, MO, USA)	T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acid	Invitrogen (Waltham, MA,  USA)	15575-020
Trypsin-EDTA	Life Technologies (Waltham, MA, USA)	25200-056
Sterile Water	Gibco (Grand Island, NY, USA)	15230-147	Molecular biology grade
Pasteur Pipette	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	13-678-8B
40um Filter Mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-1
70 um filter mesh	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)	08-771-2
TC Plate 96 Well Suspension	Sarstedt	83.3924 (Previously 83.1835)
1cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	309659
10cc Syringe	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	301604
48.48 Dyanmic Array Chip	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)	85000800
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA)	4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P7949
Glass Bottom Dish	MatTek (Ashland, MA, USA)	P35G-1.5-14-C	35 mm petri dish with glass bottom
Mouth Piece/ Rubber Tubing	Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)	MP-SET
Nicotinamide	Sigma (St. Louis, MO, USA)	N0636	Stock kept at -20oC
Vascular Endothelial Growth Factor	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	293-VE	Stock kept at -80oC
Activin B	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	659-AB	Stock kept at -80oC
Extendin 4	Sigma (St. Louis, MO, USA)	E7144	Stock kept at -20oC
Rspondin-1	R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)	3474-RS	Stock kept at -80oC
Falcon 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	352054
PrecisionGlide Needle 18Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305196
PrecisionGlide Needle 16Gx1 1/2	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)	305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3473
Costar 96 Black Well Plate	Corning Inc. (Corning, NY, USA)	3603	Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope	Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD	Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell Sorter	Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)