JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ووصف تقنيات التطور والعزلة على التكيف وأظهرت لانتاج مشتقات سلالة Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 التي تكون قادرة على تستهلك بسرعة هيكسوز والسكريات مختلطة البنتوز في انزيم saccharified hydrolyzates undetoxified وتتراكم أكثر من 40 جم / لتر من الإيثانول.

Abstract

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Introduction

على 1.3 مليار طن الجافة السنوية المقدرة من الكتلة الحيوية lignocellulosic أن تدعم إنتاج الإيثانول والسماح للولايات المتحدة للحد من استهلاك النفطية بنسبة 30٪. 1 على الرغم من أن محطة الكتلة الحيوية خليط عوائد التحلل السكر الغنية في الجلوكوز والفركتوز، يتم إنشاء مثبطات انزيم من المعالجة الكيميائية اللازمة لكسر هيميسيلولوز وفضح السليلوز لهجوم الأنزيمية. ويعتقد أن حمض الخليك، فورفورال، وهيدروكسي (HMF) أن تكون المكونات الرئيسية بين العديد من المثبطات التي تشكل أثناء المعالجة. من أجل المضي صناعة الإيثانول lignocellulosic إلى الأمام، والبحوث وإجراءات للسماح للتطور سلالات الخميرة قادرة على قيد الحياة وتعمل على استخدام كل هيكسوز والسكريات البنتوز في وجود هذه المركبات المثبطة هناك حاجة بكفاءة. وضعف إضافي كبير من سلالات الخميرة الصناعية التقليدية، مثل خميرة الخباز، هو عدم القدرة على fermen بكفاءةر زيلوز متاح في hydrolyzates من الكتلة الحيوية النباتية.

Pichia stipitis نوع السلالة NRRL Y-7124 (CBS 5773)، والتي سميت مؤخرا Scheffersomyces stipitis، هو الأم البنتوز خميرة تخمر ما هو معروف جيدا للتخمر الزيلوز إلى إيثانول. 2،3 تطور سلالة NRRL Y-7124 تم متابعتها هنا لأنه قد تم توثيقه ل لديها القدرة العظمى من سلالات الخميرة الأم إلى تراكم الإيثانول القابل للاسترداد اقتصاديا يتجاوز 40 جم / لتر مع القليل ثانوية إكسيليتول. 4،5،6 وسائل الإعلام الأمثل، S. stipitis سلالة NRRL Y-7124 ينتج 70 غرام / لتر من الإيثانول في 40 ساعة (1.75 جم / لتر / ساعة) بعائد 0.41 ± 0.06 غ / ز في الثقافات كثافة عالية الخلية (الخلايا 6 جم / لتر). 7،8 المقاومة لمثبطات انزيم الإيثانول، فورفورال، وHMF كما تم الإبلاغ عنها، 9 و S. وقد صنفت stipitis بين الخمائر تخمر البنتوز أصلية الواعدة المتاحة لإنتج الإيثانول على نطاق تجارين من غنوسيللولوز وكان 10 هدفنا هو تطبيق تنوعا hydrolyzates lignocellulosic undetoxified والضغوط اختيار الإيثانول لإجبار تطور نحو مشتق أكثر قوة من سلالة NRRL Y-7124 مناسبة للتطبيقات الصناعية. ومن أهم الميزات المحسنة سعى كانت أسرع معدلات السكر امتصاص في hydrolyzates تركيزا، وانخفاض diauxy لاستخدام السكر مختلطة أكثر كفاءة، والتحمل أعلى من الإيثانول ومثبطات. تطبيق س. كان stipitis إلى hydrolyzates undetoxified محورا رئيسيا للبحث من أجل القضاء على واضاف نفقات التشغيل المرتبطة عمليات إزالة السموم هيدروليساتي، مثل overliming.

وقد طبقت اثنين hydrolyzates اعدة صناعيا لإجبار تطور: انزيم saccharified الألياف الأمونيا سابقة التجهيز التوسع حطب الذرة هيدروليساتي (AFEX CSH) وتمييع سابقة التجهيز حمض التبن هيدروليساتي الخمور (PSGHL) ويجري تطوير 11،12 AFEX تكنولوجيا المعالجة لتقليل إنتاج مثبطات انزيم، في حين تمثل المعالجة حمض المخففة التكنولوجيا الحالية بأقل تكلفة والأكثر شيوعا تمارس لفضح الكتلة الحيوية السليلوزية لتسكر الأنزيمية. PSGHL هو فصله من السليلوز المتبقية بعد المعالجة وغنية بشكل مميز في زيلوز من هيميسيلولوز تحلل، ونسبة قليلة من الجلوكوز. AFEX CSH والتراكيب PSGHL تختلف عن بعضها البعض في الجوانب الرئيسية التي تم استغلالها لإدارة عملية التطور. AFEX CSH هو أقل من ذلك في الألدهيدات الفوران ومثبطات حامض الخليك ولكن أعلى في الأحماض الأمينية ومصادر نيتروجين الأمونيا مقارنة مع PSGHL (الجدول 1). يقدم PSGHL تحديا إضافيا من الفركتوز يجري السكر السائد المتاحة. وهكذا PSGHL المناسب لإثراء خصيصا لتحسين استخدام الفركتوز في hydrolyzates، وضعف منع الاستخدام التجاري للالخميرة المتاحة. حتى بين الخمائر تخمر البنتوز الأم، والاعتماد على XYLO السكر الأمثلحد ذاتها لدعم نمو الخلايا وإصلاح يصبح أكثر صعوبة في hydrolyzates بسبب مجموعة متنوعة من الأسباب: نقص العناصر الغذائية، مثبطات مما تسبب في أضرار واسعة النطاق إلى الخلية السلامة الهيكلية، واضطراب التمثيل الغذائي بسبب الاختلالات الأكسدة 9 النيتروجين مكملات، خاصة في شكل الأحماض الأمينية، ويمكن أن تمثل تكلفة تشغيلية هامة للتخمير. وتمت دراسة تأثير مكملات النيتروجين على فحص العزلة والترتيب مع hydrolyzates التبن.

وقد أثرى تحسين الأفراد في السكان تتطور باستخدام الضغوط اختيار متعددة تعتمد على التنوع الجيني الطبيعي للس. السكان stipitis والطفرات المستحثة بواسطة التعرض لاثنين من hydrolyzates متنوعة، والإيثانول أو الأشعة فوق البنفسجية. طبقت ضغوط الانتقاء بالتوازي وفي سلسلة لاستكشاف التقدم تطور س. stipitis نحو المشتقات المطلوب قادرة على النمو والهياج بكفاءة في hydrolyzates(الشكل 1). وقد أنجزت زراعة المتكررة للسكان وظيفية في hydrolyzates تحديا متزايد في microplates توظيف سلسلة تخفيف إما 12٪ غلوكان CSH AFEX وإلا أعد PGSHL في 20٪ مواد صلبة التحميل. تطبيق نمو تحدى الإيثانول على زيلوز في الثقافة مستمرة مزيد من التحسين AFEX CSH تكيف السكان من خلال إثراء للالظواهر يدل أقل قابلية للإيثانول القمع من استخدام الفركتوز. وقد أظهرت هذه الميزة الأخيرة مؤخرا إشكالية لاستخدام البنتوز من سلالة NRRL Y-7124 بعد تخمير السكر. 8 التخصيب على PSGHL جرى استكشاف بجانب توسيع وظائف هيدروليساتي.

المشتقات المفترضة تحسين س stipitis NRRL Y-7124 تم عزل من كل مرحلة من مراحل عملية التطور باستخدام تخصيب المستهدفة تحت ظروف الإجهاد والطلاء تخفيف لاختيار المستعمرات من السكان الأكثر انتشارا. قريب أبعادواستخدمت مؤشرات الأداء (RPIs) لتصنيف سلالات على أساس الأداء العام، حيث تم تقييم السلوك الحركي على أنواع مختلفة هيدروليساتي والمكملات الغذائية المطبقة. على الرغم من النجاحات التي تحققت في إجراءات تكيف مختلفة لتحسين وظائف س. stipitis في hydrolyzates lignocellulosic وقد تم توثيق سابقا، والسلالات مما يدل على انتاج الايثانول اقتصادية على hydrolyzates undetoxified لم يتم ذكر سابقا. 13-17 عن طريق إجراءات تطور إلى أن تصور بمزيد من التفصيل هنا، Slininger وآخرون. 18 وضعت السلالات التي تحسن بشكل كبير خلال سلالة الأم NRRL Y-7124 وقادرون على انتاج> 40 جم / لتر من الإيثانول في AFEX CSH وانزيم هيدروليساتي التبن saccharified (SGH) تستكمل بشكل مناسب مع مصادر النيتروجين. هذه السلالات الجديدة ذات الفائدة في المستقبل إلى غنوسيللولوز النامية لصناعة الإيثانول وكأصحاب علم الجينوم إضافية لبناء دراساتعلى تلك السلالة التسلسل سابقا NRRL Y-11545. 19 دراسة الجينوم من أهم السلالات التي تنتج أثناء المراحل المختلفة لتطور diagramed في الشكل 1 أن إلقاء الضوء على التاريخ من التغيرات الجينية التي وقعت خلال تطوير تمهيدا لمزيد من البحوث تحسين السلالة.

Protocol

1. إعداد ابتداء من المواد والمعدات اللازمة لفحوصات

  1. إعداد hydrolyzates باستخدام 18 إلى 20٪ الكتلة الحيوية الأولية الوزن الجاف في رد فعل المعالجة لاستخدامها في تطور والعزلة وإجراءات الترتيب. انظر Slininger وآخرون. 2015 18 للطرق مفصلة لإعداد AFEX المستشفى وهي PSGHL، وSGH مع ملاحق النيتروجين N1 أو N2 المستخدمة في تطور والعزلة أو الترتيب. انظر الجدول رقم 1 لتكوين كل نوع هيدروليساتي.
    ملاحظة: تم تعيين التحصينات النيتروجين من SGH كما SGH-N1 أو SGH-N2 تعرف على النحو التالي: SGH-N1 = SGH محصنة إلى 42: الكربون 1 الرحى إلى نسبة النيتروجين (C: N) مع مصادر النيتروجين بما في ذلك اليوريا، الأمينية خالية من فيتامين الأحماض من الكازين، D، L-تريبتوفان، L-السيستين، والفيتامينات من مصادر محددة (مثل أن ~ 15٪ من المولي النيتروجين N هي الأولي النيتروجين الأمينية (PAN) و~ 85٪ من N هي من اليوريا)؛ SGH-N2 = SGH محصنة إلى 37: 1 C: N مع اليوريا ودقيق الصويا كما بأقل تكلفة مصدر تجاري سالأحماض الأمينية و الفيتامينات و، وتوفير ~ 12٪ من N من PAN و 88٪ كما اليوريا.
  2. اكتساب ثقافة مجفف بالتجميد من سلالة الأم، Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) من مجموعة الثقافة ARS (المركز الوطني للبحوث استخدام الزراعي، بيوريا، إلينوي)، وإعداد الثقافات الأسهم الجلسرين وفقا لتوجيهات. الحفاظ على الثقافات الأسهم من الخميرة الأم ومشتقاته في 10٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية.
    1. الأسهم خط الجلسرين إلى سكر العنب خميرة الشعير ببتون (ي) أجار لوحات (3 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 3 غرام / لتر الشعير استخراج، 5 غرام / لتر ببتون، 10 جرام / لتر سكر العنب، 20 جرام / لتر أجار)، واحتضان 48- 72 ساعة على 25 درجة مئوية. 8 لوحات نموا يمكن تخزين ما يصل إلى أسبوع في 4 درجات مئوية قبل لاستخدام السائل قائح قبل الثقافة.
  3. إعداد الأمثل تعريف المتوسطة (تصنيع)، وسيلة الاصطناعية متوافق مع إجراءات صياغة الصناعية 20 التي وضعت سابقا لتحويل الأمثل للالزيلوز إلى إيثانول من شارع الوالدينعين Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 استخدام وسيلة محددة في كل precultures والثقافات لاختبارات بيولوجية أداء التخمير، وكذلك لإنتاج الإيثانول الطعن، وتطور الثقافة المستمر الزيلوز- تغذيها. يتم سرد التصميم تكوين لتكون مرجعا في الجدول 2.
  4. كما هو موضح سابقا، 18 تحليل الكتلة الحيوية الخلية باستخدام cuvette- أو لوحة صغيرة معمل القراءة، حسب الاقتضاء، لقياس الامتصاصية ثقافة في 620 نانومتر (A 620). Quantitate السكريات، والإيثانول، فورفورال، هيدروكسي (HMF)، وحمض الخليك في العينات الثقافة باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) أو تقرير الأنزيمية الروبوتية من الجلوكوز والفركتوز لأعلى إنتاجية.

2. نمي المشتقات قوية خلال نقل المسلسل علي AFEX CSH

  1. تطعيم preculture من سلالة NRRL Y-7124. نقل الخلايا من YM أجار إلى 75 مل التصميم + 150 غرام / لتر زيلوز للحفاظ على القدرة على النمو في سالإجهاد smotic. احتضان precultures في 125 مل قوارير مغلقة مع اسفنجة السيليكون المقابس 24 ساعة على 25 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة، 1 "المدار).
  2. قسامات المجمدة ذوبان الجليد من 6-12٪ غلوكان CSH AFEX في الماء البارد لمدة الاستخدام. ضبط درجة الحموضة إلى 5 إذا لزم الأمر وتصفية تعقيم قبل إعداد سلسلة التخفيف في 96-جيدا microplates.
  3. ملء microplates مع 50 ميكرولتر لكل بئر و 8 آبار في التخفيف هيدروليساتي، ثم تطعيم مع عدد قليل من ميكرولتر من preculture لكل بئر للسماح الامتصاصية الأولي (620 نانومتر) 620 ≥0.1. احتضان لوحات ثابت 24-48 ساعة عند 25 درجة مئوية في علبة بلاستيكية مع منشفة ورقية مبللة للرطوبة.
  4. عن طريق التخفيف هيدروليساتي الأكثر تركيزا التي نمت بشكل واضح إلى A 620> 1، ونقل 1-5 ميكرولتر إلى كل بئر من سلسلة تخفيف هيدروليساتي جديدة لتحقيق الأولي 620 ≥0.1.
  5. مراقبة ثقافة نمو 620 في microplates مع معمل. سلسلة تخفيف uninoculated سرفيس كوسيلة لمراقبة وفارغة. وترك أغطية لوحة في خلال رصد لمنع التلوث، وقراءات تبعا لذلك.
  6. إعداد مخزون الجلسرين الثقافات التكيف بصورة منتظمة لعزل اللاحقة من تحسين السلالات أو للاستخدام في reinoculating استمرار هيدروليساتي سلسلة التخفيف. لإعداد الأسهم، تجمع أربعة آبار (200 ميكرولتر) من أكبر تركيز هيدروليساتي المستعمر. خلط 1: 1 مع الجلسرين معقم 20٪ في cryovials، لتجميد الخلايا في 10٪ الجلسرين في -80 درجة مئوية.
  7. كرر الخطوات من 2،3-2،6 حتى النمو في 12٪ غلوكان CSH AFEX مرئيا باستمرار على مدار 24 ساعة.

3. خلية عزل واحدة المشتقات متسامح بعد التخصيب على AFEX CSH

  1. خط اختيار الأسهم الجلسرين الثقافات التكيف مع أجار YM، والشرائط استخدام لتطعيم 50 ميكرولتر من 3٪ أو 6٪ جلوكان AFEX CSH (الرقم الهيدروجيني 5) في كل من ثلاثة آبار صفيحة (الأولي 620 ~ 0.1). احتضان microplates 24 ساعة كما في الخطوة 2.3. تجمع نسخةاستعمرت الشركة المصرية للاتصالات الآبار على أعلى قوة هيدروليساتي مع النمو القوي، ولوحة تخفيف لYM أو 6٪ غلوكان AFEX CSH أجار. إعداد هذا الأخير بوصفه 1: مزيج 1 من فلتر تعقيم 12٪ غلوكان CSH AFEX مع دافئ مشبع 30 ز حل / L أجار.
  2. اختيار 5 المستعمرات واحد من أعلى معدلات النمو تظهر لوحة التخفيف بعد الحضانة 24-48 ساعة عند 25 درجة مئوية لتجميد كما الثقافات الأسهم الجلسرين. خط كل مستعمرة إلى لوحة YM. احتضان 24 ساعة. مع حلقة عقيمة، نقل متتالية وضعت الخلايا إلى وحدة تخزين صغيرة من الجلسرين 10٪، ومزيج تعليق الخلايا، وتوزيعها على 2-3 cryovials تجميد في -80 درجة مئوية.

4. تقييم أداء AFEX CSH المشتقات متسامح بالمقارنة مع الوالد

  1. اختبار عزلات في بسيطة الثقافات 6٪ غلوكان AFEX CSH دفعة.
    1. نقل الخلايا من 48 لوحات ساعة يشوبه من المخزونات الجلسرين لدرجة الحموضة 7 البوتاسيوم العازلة الفوسفات (0.4 ملم) لإعداد تعليق خلية مع 620 = 10. استخدم 1 ميكرولتر منكل تعليق لتطعيم كل أربعة آبار من 50 ميكرولتر 3٪ هيدروليساتي جلوكان المبدئي 620 = 0.2. احتضان microplates 24 ساعة كما في الخطوة 2.3. إعداد 3٪ غلوكان CSH AFEX في درجة الحموضة 5 عن طريق تمييع 12٪ غلوكان AFEX CSH 1: 3 مع الماء المعقم.
    2. نقل بئرين 24 ساعة صفيحة لتطعيم 25 مل precultures من درجة الحموضة 5 12٪ غلوكان CSH AFEX تستخدم في 50٪ من كامل قوتها. احتضان precultures في 50 مل قوارير مع إغلاق الإسفنج السيليكون لمدة 24 ساعة على 25 درجة مئوية، ~ 150 دورة في الدقيقة (1 "المدار) إعداد نصف القوة 12٪ غلوكان AFEX CSH من تمييع هيدروليساتي 1: 1 مع الماء المعقم.
    3. استخدام نصف القوة precultures حلامة لتطعيم مماثلة 25 مل الثقافات النمو الأولي 620 = 0.1. احتضان الثقافات النمو على النحو الوارد أعلاه (4.1.2) وعينة يوميا (0.2 مل). تراكمات مراقب من الكتلة الحيوية (A 620) وتركيزات السكريات ومنتجات التخمر (HPLC).
  2. بدلا من ذلك، repitch (أي الحصاد وصeuse) السكان من 6٪ جلوكان AFEX الخميرة نابعة من CSH للاختبار في 8٪ جلوكان الثقافات دفعة هيدروليساتي، كما هو موضح سابقا. 18
  3. بدلا من ذلك، المزيد من السكان اختبار repitched 6٪ جلوكان الثقافات CSH AFEX عن طريق تغذية مع 12٪ هيدروليساتي جلوكان، كما هو موضح سابقا. 18
  4. اختبار تأخر ثنائي خطوات النمو العزلات في الثقافات دفعة من التصميم مع السكريات مختلطة.
    1. تطعيم precultures من 75 مل التصميم مع 150 غرام / لتر زيلوز في 125 مل قوارير مع إغلاق سيليكون الاسفنج عن طريق التحويل حلقة من الشرائط الجلسرين YM. احتضان 24 ساعة كما في الخطوة 2.1.
    2. استخدام precultures لتطعيم مماثلة الثقافات 75 مل اختبار مع الحركة الديمقراطية البرتقالية تحتوي على 75 غرام / لتر من الجلوكوز و 75 غرام / لتر من الفركتوز في درجة الحموضة 6.5. يهز قوارير عند 25 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة. عينة يوميا.
    3. بدلا من ذلك، اختبار تأثير 0-15 غرام حامض / L الخليك على diauxy خلال التخمير من الجلوكوز والفركتوز باستخدام بروتوكول مماثل، باستثناء ضبط درجة الحموضة الأولية في 6.0 ± 0.2 في الثقافات اختبار للحفاظ على درجة الحموضة 6-7 دوعصابة استهلاك حمض الخليك، كما هو موضح سابقا. 18

5. تطبيق ثقافة متواصلة لتحديد لتحدى الإيثانول إكسيلوسي استخدام

  1. إعداد التصميم كما المستمر المتوسطة تغذية الثقافة مع 60-100 غرام / لتر زيلوز، 20-50 غرام / لتر من الإيثانول في درجة الحموضة 6.3 ± 0.2. اختيار مزيج من الفركتوز والايثانول لمحاكاة تخمير جزئي من 150 غرام / لتر زيلوز، على افتراض العائد المحتمل من ~ 0.5 غرام الإيثانول / ز الفركتوز، ولاستيعاب احتمال 50-70 غرام / لتر من الإيثانول تحدث. 8
  2. لتحضير اللقاح ثقافة المستمر، نقل ممثل AFEX مستعمرة CSH-متسامحة (مماثلة إلى مستعمرة 5 في المثال، الشكل 1) من خلال حلقة من لوحة YM 48 ساعة إلى 75 مل من زيلوز خالية من الايثانول تصنيع (100 غرام / لتر، في هذه الحالة) في 125 مل القوارير. احتضان عند 25 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة (1 "المدار) لمدة 24 ساعة. اختيار تركيز التصميم زيلوز preculture ليتطابق مع ثقافة مستمرة عقد الحجم الأولي.
  3. تطعيم حجم ثقافة مستمرة عقد التصميم في درجة الحموضة 6.3 ± 0.2 جود 100 غرام / لتر زيلوز + 20 جم / لتر من الإيثانول مع ~ 5-10 مل من التركيز preculture لعزل AFEX CSH-متسامح (مماثلة لمستعمرة 5، الشكل 1 ) للحصول على 100 مل في الأولي 620 ~ 0.5. الحفاظ على الثقافة عقد الحجم (V R)، عند 25 درجة مئوية في تغلف 100 مل الدوار قارورة أثار في 200 دورة في الدقيقة وتجهيزه مع القطب درجة الحموضة تعقيمها، تحكم درجة الحموضة وتعميم حمام مائي التحكم في درجة حرارته.
  4. في البداية، منذ نمو الخلايا سيكون بطيئا بسبب التعرض الإيثانول، وإعداد المتوسطة تغذية لجرعة باستخدام مضخة دفعتها درجة الحموضة. ضبط مضخة لتغذية درجة الحموضة 6.3 التصميم مع 100 غرام / لتر الفركتوز و 50 غرام / لتر من الإيثانول عندما يسقط التخمير ثقافة درجة الحموضة إلى 5.4، وبالتالي وقف مزيد من انخفاض درجة الحموضة. الحفاظ على حجم 100 مل مع مضخة مياه الصرف القشط باستمرار سطح الثقافة. ونتيجة لذلك، يرتفع تركيز الإيثانول مع استمرار عملية التمثيل الغذائي والتغذية.
  5. قياس المواد السائلة وأخذ عينات (1-2 مل) من الثقافات مستمرة كل 48-72 ساعة لتحليل تركيز خلية قابلة للحياة والمنتجات وركائز، كما هو موضح سابقا. 18 لمعرفة تركيز خلية قابلة للحياة، وجعل التسلسلية 01:10 التخفيفات من العينات في عازلة (انظر 4.1.1) وانتشار لوحة التخفيفات لأجار YM (انظر 1.2.1). واستنادا إلى معدلات التدفق جمع (س)، وحساب معدل التخفيف (D) (س / V R)، و، في المثال س stipitis، وتنوعت 0-،01 ساعة -1.
  6. توفير مخزونات الجلسرين بانتظام من خلال عزل من لوحات الجدوى من التخفيفات عينة مخزنة تشكيل 30-100 المستعمرات، وهو ما يمثل المستعمرين القوي الأكثر انتشارا في ذلك الوقت في تخصيب اليورانيوم. لوحات الفيضانات مع ~ 5 مل من 10٪ الجلسرين للسماح إعداد cryovials مكررة. للصيانة أو فترة راحة، ووقف ثقافة مستمرة وإعادة حسب الحاجة استخدام معظم المخزون الحالي (مقاومة) الجلسرين (ق).
  7. إلى إعادة تشغيل خط المخزون الجلسرين (ق) من أكثرالسكان مقاومة للYM أجار ونقل 24-48 خلايا ساعة من حلقة إلى ثقافة ما قبل من تصنيع خالية من الإيثانول لمدة الحضانة على النحو الوارد أعلاه. تطعيم 100 مل عقد حجم التصميم المبدئي ل620 0.5 باستخدام المركزات من الخميرة precultured، والسماح للثقافة أن تنمو بشكل متقطع إلى مرحلة ثابتة قبل أن يتم إعادة تشغيل تدفق المتوسطة الأعلاف.
  8. إذا الثقافات يمكن أن تنمو بشكل مطرد في> 0.01 ساعة -1 على الفركتوز في وجود> 25 جم / لتر إيثانول، بدء تغذية مستمرة الثقافة (الحركة الديمقراطية البرتقالية + 60 جرام / لتر زيلوز + الإيثانول تتراوح بين 30 و 50 جم / لتر) في أدنى مستوى معدل التخفيف ~ 0.01 ساعة -1 إلى 100 مل عقد حجم (في البداية التصميم + 60 جرام / لتر زيلوز + 20 جم / لتر من الإيثانول). مع مرور الوقت، ورفع الإيثانول في تغذية نحو 50 جرام / لتر. القبض على السكان المتقدمين في الأسهم الجلسرين.
    ملاحظة: المحافظة على معدل منخفض تخفيف يسمح بتشكيل لتركيز خلية يكفي للحد من ارتفاع توافر الأكسجين والدعم التخمير.
  9. اختياريا، وتطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) irradiatأيون شهريا إلى الجلسرين السكان الأسهم تستخدم لreinoculate الثقافات مستمرة.
    1. المستعمرات و resuspend من الجلسرين الشرائط الأسهم في 10 مل من التصميم (كما هو الحال في precultures) مع 60 جم ​​/ لتر الفركتوز، وتجميع جميع الأسهم في قارورة معقمة واحدة. تطبيق تعليق خلية مجمعة في ~ 5 × 10 8 قابلة للحياة خلية / مل فقط لتغطية قيعان 4-5 لوحات بيتري مع 6 مل / لوحة. للحصول على 6 تغطية مل من لوحة بتري المتاح القياسية، الاستغناء عن 15 مل للتغلب على التوتر السطحي، ثم قم بإزالة 9 مل.
    2. فضح كل لوحة ثقافة مفتوحة للأشعة فوق البنفسجية من مصدر الضوء في خزانة السلامة البيولوجية. ضبط وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية أو المسافة إلى الحصول على معدل القتل المطلوب> 90٪. هنا، يعرض لمدة 45 دقيقة في حوالي 56 سم من المصدر.
    3. تمييع تعليق خلية لوحة قبل وبعد التشعيع. معدل القتل تقدير يستند إلى مستعمرة. لس. stipitis سبيل المثال، كان معدل القتل ~ 97٪.
    4. نقل الثقافات المعرضة للأشعة فوق البنفسجية (24-30 مل) لاحباط COVالدو 50 مل قارورة، واحتضان عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة للسماح نسبة صغيرة من الخلايا قادرة على البقاء لإعادة الناس إلى ~ 1 × 10 8 قابلة للحياة س. stipitis خلية / مل. عن طريق منع reactivations الصورة، غطاء احباط يحفظ الطفرات في حين يتم تحضين الثقافات.
    5. استخدام الثقافة mutagenized إسكانها لتطعيم الثقافات المستمرة ل~ 1 × 10 7 قابلة للحياة خلية / مل. إعادة تشغيل التصميم + 60 جرام / لتر تغذية زيلوز المتوسطة التخصيب الإيثانول لمواصلة عملية الاختيار.

6. تقييم الجلسرين السكان المالية وتحديد تلك مع تحسين إكسيلوسي التخمير في وجود الإيثانول

  1. خط اختار الثقافات الأسهم الجلسرين لأجار YM كخطوة أولى في الشاشة للحصول على أفضل نمو وتخمير الزيلوز في وجود الإيثانول.
  2. نقل كل سكان تطورت ليتم عرضه من الشرائط أجار إلى 75 مل precultures في التصميم مع 150 غرام / لتر جلوكوز، واحتضان في 125 مل قوارير 96 ساعة قبل استخدامها كما قائح للثقافات الاختبار. سوف تتطلب أعداد كبيرة نابعة من الجلوكوز تحريض الانزيمات لاستخدام الفركتوز.
    1. لاختبار تحريض، حصاد كل ثقافة أو تعليق الخلايا إلى 30 مل، الأولي 620 من 40 في تصنيع +60 ز / L زيلوز + 30-45 غرام / لتر من الإيثانول، واحتضان عند 25 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة (1 "المدار) في 50 مل قوارير مع إغلاق الإسفنج السيليكون. رسم العينات مرتين يوميا لرصد امتصاص الفركتوز عن طريق التحليل HPLC.
  3. بدلا من ذلك، كما هو موضح في Slininger وآخرون، 18 لتقييم النمو على الفركتوز في وجود الإيثانول، وإعداد precultures كل سكان تطورت عن طريق التحويل حلقة إلى 75 مل من التصميم مع 150 غرام / لتر زيلوز في 125 مل القوارير، واحتضان 96 ساعة على 25 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة (1 "المدار). تلقيح الثقافات الاختبار إلى انخفاض الأولي 620 بنسبة 0.1 في 25 مل من الحركة الديمقراطية البرتقالية + 60 جرام / لتر زيلوز + 30-45 غرام / لتر من الإيثانول في 125 مل القوارير. احتضان قوارير عند 25 درجة مئوية، 300 دورة في الدقيقة، 1 "المدار وعينة.

معشوقة = "jove_title"> 7. عزل المستعمرات وحيدة الخلية التي تستخدم إكسيلوسي في PSGHL عندما الإيثانول هو الحاضر

  1. بناء على نتائج الخطوة 6، حدد الجلسرين السكان الأسهم تظهر القدرة الفائقة لتنمو على والهياج الزيلوز في وجود الإيثانول. استخدام هذه لوحات متتالية. تستخدم لوحات متتالية لإعداد كثيفة، تعليق خلية مخزنة من 620 = 5. ثم يتم استخدام الايقاف الخلية لتطعيم precultures في لوحات جيدا 96-العميقة إلى A 620 = 0.5. تطعيم 1 مل precultures على PSGHL مختلطة 1: 1 مع التصميم + 50 جرام / لتر الفركتوز (أي الإيثانول). احتضان precultures في 96-جيدا، لوحات بئر عميقة مع تبخر منخفضة تنفيس يغطي لمدة 48 ساعة على 25 درجة مئوية، 400 دورة في الدقيقة، 1 "المدار. منفصلة مختلف السكان الأسهم الجلسرين من الآبار الفارغة.
  2. استخدام كل preculture، تطعيم ستة عشر 1 مل تكرار الثقافات الأولي 620 ~ 0.5 في 1: 1 PSGHL: التصميم + 50 جرام / لتر زيلوز مع 20، 30، أو 40 غرام / لتر من الإيثانول لإثراء المستعمرين تسامحا. احتضان cultu التخصيبالدقة على غرار precultures.
  3. لكل سهم الجلسرين مختلفة، حصاد الآبار الثقافة مع أعلى تركيز الإيثانول السماح النمو وزيلوز الاستخدام. لوحة كل سطر الخلية لأجار YM للحصول على المستعمرات واحد انتشارا للحفاظ على الجلسرين. اختيار عشرة مستعمرات في كل سطر الخلية وخط كل لوحة أجار YM لإعداد الأوراق المالية الجلسرين.

8. وعلاوة على ذلك نمي قوية تطورت سلالات خلال نقل المسلسل علي PSGHL، أما بالنسبة AFEX CSH

  1. إعداد ما قبل ثقافات NRRL Y-7124 (الأم)، تطورت AFEX CSH المقاومة للعزل، والثقافة مستمرة تطورت السكان مع تعزيز القدرة على استخدام الفركتوز في وجود الإيثانول. تطعيم 75 مل من التصميم + 150 غرام / لتر زيلوز بواسطة حلقة من الشرائط الأسهم الجلسرين كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1) لعملية التكيف هيدروليساتي AFEX CSH.
  2. تمييع PSGHL بالماء لتقديم سلسلة من تركيزات متزايدة. إعداد لوحة الدقيقة 96 بشكل جيد لكل من خطوط الخلايا الثلاث باستخدام كلتخفيف PSGHL لملء 8 آبار مع 50 ميكرولتر. استخدام preculture لتطعيم كل 50 ميكرولتر الصغرى الثقافة من سلسلة تخفيف المبدئي 620 ~ 0،1-0،5.
    1. مواصلة تطور الخميرة في زيادة نقاط القوة في PSGHL باستخدام نفس الإجراء كما AFEX CSH التكيف هيدروليساتي المفصلة أعلاه (الخطوة 2) حتى الثقافات هي قادرة على النمو في هيدروليساتي كامل قوتها في مستقر 14 د متوسط نسبة ΔA 620 في Δtime كما واصلت عمليات النقل التسلسلي مدة أربعة أشهر إضافية.

9. عزل المستعمرات وحيدة الخلية عن طريق PSGHL التدرجات مع أو بدون الإيثانول التحدي

  1. الحصول على وحيدة الخلية يعزل مباشرة من لوحات التكيف النهائية كامل قوة PSGHL بواسطة الطلاء تخفيف لYM أجار. اختيار عشرة مستعمرات كبيرة لكل من خطوط الخلايا الثلاث وشريط خط لوحات YM لإعداد مخزون الجلسرين كما هو موضح سابقا (الخطوة 3.2).
  2. اختياريا، واستكشاف نقاط وقت سابق فيعملية التطور عن طريق عزل من المخزونات الجلسرين المخزنة من خطوط الخلايا الثلاث.
    1. تطعيم preculture لكل خط الخلية عن طريق حلقة من الجلسرين الشرائط الأوراق المالية واحتضان 24 ساعة على 30 مل التصميم + 50 جرام / لتر الفركتوز (50 مل القوارير، 25 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة).
    2. خلايا التحدي من precultures للنمو في هيدروليساتي، فحقن 50 ميكرولتر من 50٪ PSGHL في آبار صفيحة لالأولي 620 ~ 0.2 واحتضان ثابت 48 ساعة.
    3. انتشرت 0.1 مل من كل ثقافة المخصب على لوحات أجار PSGHL التدرج تتراوح من 0 إلى 50٪ قوة هيدروليساتي (تسليم ~ 300-400 خلايا قابلة للحياة في لوحة)، واختيار 10 المستعمرات واحد في كل سطر الخلية من أعلى درجة ممكنة من مجال التركيز هيدروليساتي التدرج . اختار 21 الإنتصارات المستعمرات إلى YM لإعداد الأوراق المالية الجلسرين كما في الخطوة 3.2.
    4. وكبديل لذلك إلى الخطوة 9.2.3، بدلا من تلقيح لوحات أجار التدرج، تطعيم الآبار من 96-جيدا لوحات صغيرة لالأولي 620 ~ 0.2، عرجإعادة الآبار مصممة لتحتوي على مجموعة من تركيزات هيدروليساتي 50-100 قوة٪ والايثانول 10-40 جرام / لتر. في هذه الحالة، ووضع لوحات صغيرة 72-96 ساعة وخلاف ذلك كما في الخطوة 2.3. عزل عشرة المستعمرات واحد من الآبار من أقسى مجموعات هيدروليساتي الإيثانول تظهر نموا عبر طلاء التخفيف، وإعداد مخزون الجلسرين كما في الخطوة 3.2.

10. في الشاشة الرئيسية، والقضاء على عزلات الأقل عن طريق مقارنة وتصنيف الأداء على PSGHL في شرطين المغذيات

  1. تطبيق عالية الإنتاجية بئر عميق شاشة لوحة من أداء PSGHL إلى الشاشة خمس مجموعات من ثلاثين يعزل جنبا إلى جنب مع NRRL Y-7124 الأم وعزل AFEX CSH-متسامح (مماثلة لمستعمرة 5 من تطور سبيل المثال الشكل 1)، وضوابط لاختيار ستة سلالات الأعلى (20٪) من كل مجموعة لتمريرها إلى المستوى فحص ثانوي (الخطوة 12).
  2. تنفيذ الشاشة في لوحات بئر عميقة مملوءة 1 مل لكل بئر وغطت وايال الأغطية الفولاذ المقاوم للصدأ مع سيليكون أسود الأختام التبخر منخفضة. المشبك جميع لوحات لمجلس إدارة الحاضنة / شاكر وتعمل على 25 درجة مئوية و 400 دورة في الدقيقة (1 "المدار شاكر). تصميم لوحة عن بئر عميقة ملء أنماط للسماح للفصل العزلات المختلفة عن طريق الآبار المفتوحة.
  3. لبدء الزراعات، واختيار حبة من الخلايا من الشرائط الجلسرين المحضرة من 30 العزلات التي تم الحصول عليها على النحو الوارد أعلاه (في الخطوات 3 و 7 و 9) لتكرار آبار التصميم + 50 جرام / لتر زيلوز واحتضان 48 ساعة.
  4. كوسيلة تحديا للpreculturing العزلات، وإعداد 50٪ PSGHL عن طريق خلط PSGHL 1: 1 مع التصميم + 10 جرام / لتر جلوكوز + 50 جرام / لتر الفركتوز. لفحص 30 العزلات وسلالتين تحكم، لوحات 2 مع 2 آبار في كل من 16 العزلات تمتلئ، وترك الآبار الفارغة بين العزلات المختلفة.
  5. للثقافات التحدي، ونقل، وبلغ حجم التداول 50 ميكرولتر من التصميم ما قبل الثقافات (A 620 ~ 10) إلى كل واحد منهما 50٪ الآبار ثقافة التحدي PSGHL لكل من العزلات وضوابط للحصول على initiالعال 620 ~ 0.5 واحتضان 72 ساعة.
  6. استخدام اثنين من وسائل الإعلام اختبار ثراء غذائية مختلفة لفحص يعزل: 60٪ PSGHL + تصنيع المواد الغذائية. و 75٪ PSGHL + المغذيات التصميم + ي. إضافة المواد المغذية التصميم (باستثناء السكر) في النصف من قوة وفقا لمعايير التصميم استخدام مع 50 جم / لتر السكر (الخطوة 1.3). كما يسميهم، إضافة المواد المغذية YM (باستثناء السكر) في نصف قوة القياسية من 3 غرام / لتر خلاصة الخميرة، 3 غرام / لتر الشعير استخراج، 5 غرام / لتر ببتون.
  7. تطعيم الثقافات اختبار عن طريق نقل 50 ميكرولتر من 72 ساعة 50٪ التحدي PSGHL قبل الثقافات لتطعيم 1000 ميكرولتر المبدئي 620 ~ 0.5 في خمسة آبار عميقة لكل اثنين من وسائل الإعلام الاختبار.
  8. تذوق كل عزل يوميا. ماصة محتويات جيدا لأنبوب microfuge وأجهزة الطرد المركزي (5533 x ج، 15 دقيقة) للحصول على الطافي على الايثانول والجلوكوز والفركتوز تحليل إنتاجية عالية. قياس الكتلة الحيوية 620 في 96-جيدا لوحات صغيرة (200 ميكرولتر / جيد) مع معمل.
  9. داخل كل مجموعة من 30 لolates اختبار (5 مجموعات لS. stipitis NRRL Y-7124 تطورت سلالات)، وحساب مؤشرات الأداء النسبي (RPI) كما هو موضح في الخطوة 11 أدناه واستخدامها لرتبة كل سلالة على أساس العائد الإيثانول (الحد الأقصى الإيثانول المتراكمة في السكر الأولي مرفق) و معدل امتصاص الفركتوز (تركيز الفركتوز المستهلكة لكل الأولية 96 ساعة) على كل وسائل الإعلام الاختبار.

عزلات 11. الترتيب في الشاشة الابتدائية PSGHL عن طريق مؤشر الأداء النسبي (RPI)

  1. وبعد الفحص الأولي، وحساب مؤشرات الأداء النسبية أبعاد (RPI) لرتبة ال 30 يعزل في كل التجارب الخمس المختلفة لشاشة العزلات على PSGHL مع اثنين من صيغ مختلفة المغذيات في التجربة، أي 60٪ PSGHL و 75٪ PSGHL.
  2. حساب الإحصائي المعلمة F للاستخدام في الترتيب الأداء العزلة ضمن مجموعة من العزلات في تجربة معينة: F = (XX متوسط) / ق. هنا، X هو أداء المعلمة، مثل الغلة (Y)أو معدل (R)، لاحظ لكل عزلة الفرد، في حين X متوسط والصورة هي متوسط والانحراف المعياري، على التوالي، من احظ X لجميع يعزل ضمن تجربة معينة. لالتوزيع الطبيعي، -2
  3. لكل عزل في تجربة، وحساب الأداء النسبي على أساس معدل، RPI R = (2 + F R) × 100/4، وكذلك حساب الأداء النسبي على أساس العائد، RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 . وتتراوح قيمة RPI من ~ 0 إلى 100 مئوية (الأقل إلى الأعلى). ثم حساب المتوسطات معهد سياسة البحث عن كل عزل داخل تجربة هيدروليساتي معين على النحو التالي: RPI متوسط = (RPI Y + RPI R) / 2، حيث يتم إعطاء المساهمات المحصول ونسبة متساوية الترجيح في هذا التطبيق.
    لاحظ أنه في عام، يمكن ترجيح المحصول ونسبة المعلمات إذا رأت غير متكافئة من حيث الأهمية.
  4. حساب RPI عموما عبر أنواع ن من hydrolyzates اختبار: RPI عموما = Σ ط = 1، ن [(RPI Y + RPI R) / 2] ط / ن. النظر في كل عزل في مجموعة تجريبية من 30 عزلة و 2 الضوابط. خلال الترتيب الأول من ~ 150 واحدة مستعمرة العزلات تتكيف مع زيلوز الغنية PSGHL، وRPI يتم احتساب عموما لمعدلات والعوائد عبر صياغات PSGHL اثنين المطبقة في الشاشة، أي 60٪ PSGHL و 75٪ PSGHL، حيث n = 2.
  5. وبناء على RPI عموما في كل تجربة، واختيار نسبة أعلى من العزلات لتمرير إلى الشاشة الثانوية. في هذا المثال، يتم اختيار أفضل 20٪ من سلالات لتمرير من خلال (أي 30 من 150 اختبار).

12. في الشاشة الثانوية، قارن الأداء الأعلى الشاشة الرئيسية على عدة Hydrolyzates اكتمل (> 100 غرام / لتر السكريات المختلطة) لتكشف عن أعلى عاملة سلالات قوية

  1. مقارنة الأداء الأفضل PSGHL على 6٪ غلوكان CSH AFEX وSGH المعدل مع مستويين من النيتروجين، SGH-N1 و N2 SGH-(تكوينالصورة كما في الجدول رقم 1) عن الترتيب النهائي. فحص 30 العزلات التي كانت الأفضل أداء في الشاشة بشكل جيد صحن عميق الأولية من PSGHL (الخطوات 10 و 11) والضوابط اثنين (سلالة الأم NRRL Y-7124 وعزل AFEX CSH-متسامح (مماثلة لمستعمرة 5، الشكل 1 مثال ).
  2. تبدأ الزراعات عن طريق التقاط حبة من الخلايا من الشرائط الجلسرين لتكرار الآبار العميقة من 1 مل التصميم + 50 جرام / لتر زيلوز كما كان من قبل، واحتضان 48 ساعة في النظام بشكل جيد لوحة العميق (خطوة 10.2). ثم نقل 50 ميكرولتر من precultures التصميم إلى 50٪ الثقافات التحدي SGH، واحتضان في النظام بشكل جيد لوحة عميق لمدة 72 ساعة للحصول على 620 في ~ 10). إعداد SGH 50٪ عن طريق خلط SGH 1: 1 مع الخالية من السكر التصميم + 50 جرام / لتر الفركتوز (درجة الحموضة 5.6).
  3. لكل من العزلات، تطعيم 16 مل قسامة من SGH-N1 أو SGH-N2 مع بيليه الخلية (15 دقيقة، 2711 x ج) من ثلاث آبار للثقافة التحدي لانتاج ثقافة الاختبار الأولي 620 ~ 2.0. احتضان الثقافات الاختبار في 25 & #176؛ C، 180 دورة في الدقيقة (1 "المدار) في 25 مل قوارير مع إغلاق سيليكون الإسفنج قوارير عينة يوميا وتحليل في الشاشة PSGHL.
  4. وبالمثل، يعزل الشاشة كما في الخطوات 12.2 و 12.3، ولكن هذه المرة بديلا SGH-N1 و N2 SGH-مع 6٪ غلوكان CSH AFEX في درجة الحموضة 5.2 لاستخدامها في إعداد ثقافة التحدي المتوسطة والثقافة اختبار المتوسطة. 50٪ الثقافات التحدي قوة، استخدم 6٪ AFEX CSH المخفف 1: 1 مع الماء لأنه هو النيتروجين كافية دون تعديل.
  5. كرر الخطوات من 12،1-12،4 لتكرار النتائج.

13. الرتبة بشأن الأداء من العزلات في الشاشة الثانوية عن طريق RPI عموما لتقييم استخدام متعددة Hydrolyzates كامل

  1. حساب مؤشرات الأداء النسبي (RPI) لرتبة كل واحد من أفضل 20٪ من العزلات (~ 30 من أصل 150) من الشاشة الرئيسية التي تم اختبارها في الشاشة الثانوية على انزيم saccharified تركيبات هيدروليساتي متفاوتة ثراء الغذائية.
  2. يسجل كلعزلها اختبارها في الشاشة الثانوية على أساس معدل امتصاص الفركتوز والعائد الإيثانول التي أجريت على ثلاث صيغ هيدروليساتي-saccharified انزيم سابقة التجهيز تشغيل في نسختين، بما في ذلك AFEX CSH (ط = 1 و 2)، SGH-N1 (ط = 3 و 4) وSGH -N2 (ط = 5 و 6).
  3. حساب RPI عموما لكل عزل، وتطبيق هذه المعلمة الترتيب لمزيد من غربلة قائمة العزلات متفوقة: RPI عموما = Σ ط = 1، ن [(RPI Y + RPI R) / 2] ط / ن، حيث ن = 6 .
    ملاحظة: إظهار حركية العزلات متفوقة في hydrolyzates SGH-N2 في الثقافات قارورة باتباع الإجراءات في Slininger وآخرون (18).

النتائج

وقد تطورت س stipitis باستخدام مزيج من ثلاث ثقافات الاختيار، التي شملت AFEX المستشفى وهي PSGHL، والثقافة مستمرة تحدى الإيثانول الزيلوز- بتغذية الشكل 1 يظهر العثور على الرسم التخطيطي للتجارب تطور أداء جنبا إلى جنب مع العزلات إما لأداء أكثر فعالية عموما، أو على نح...

Discussion

Several steps were critical to the success of the evolution process. First, it is key to choose appropriate selection pressures to drive the population evolution toward the desired phenotypes that are needed for successful application. The following selective stresses were chosen for S. stipitis development and applied at appropriate times to guide enrichment for the desired phenotypes: increasing strengths of 12% glucan AFEX CSH (which forces growth and fermentation of diverse sugars in the presence of acetic a...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)NovozymesNo product numberwww.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and XyalanaseNovozymesNo product numberwww.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy FlourArcher Daniels Midland Co. (ADM)63160ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)Sigma-AldrichP1300Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino AcidsBecton Dickinson and Company228830multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan Sigma-AldrichT3300multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine Sigma-AldrichC7352multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto AgarBecton Dickinson and Company214010multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt ExtractBecton Dickinson and Company218630multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast ExtractBecton Dickinson and Company212750multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybeanFlukaP0521-500gmultiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powderSigma-AldrichA8626CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%Sigma-AldrichC3506CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltraSigma-AldrichG6779CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%Sigma-AldrichT0376CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%Sigma-AldrichU0750CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACSFisher ChemicalD16-500CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%Sigma-AldrichX1500CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom platesBecton Dickinson Falcon351172multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 WiperKimberly-Clarktowel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)Corning Life Science Glass4980-125multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotationNew Brunswick Scientific (1-800-631-5417)M1335-0016multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP platesApplikon BiotechnologyZ365001700applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well platesApplikon BiotechnologyZ365001296applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate coverApplikon BiotechnologyV0W1040027applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich coverApplikon BiotechnologyV0W1040001applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropyleneApplikon BiotechnologyZC3DXP0240applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasksBellco1924-00032Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.Bellco1968-00100 (original Cat. No.)Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer OvenMathisAgTyp-Nbr BFA12 215307Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry AnalyzerYSI Life Sciences2900D-UPwww.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate SpectrophotometerBio-Tek Instruments, IncMQX200Rwww.biotek.com

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 Scheffersomyces stipitis Pichia stipitis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved