Tecniche per l'evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo

Riepilogo

Tecniche di evoluzione e di isolamento Adaptive sono descritti e hanno dimostrato di produrre derivati di tensione Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 che sono in grado di consumare rapidamente esosi e zuccheri misti pentosi in enzima saccarificato idrolizzati undetoxified e di accumulare più di 40 g / L di etanolo.

Abstract

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Introduzione

Un 1,3 miliardi di tonnellate a secco annuo stimato di biomassa lignocellulosica potrebbero sostenere la produzione di etanolo e consentire agli Stati Uniti di ridurre il consumo di petrolio del 30%. ¹ Sebbene impianto a biomasse miscele rendimenti idrolisi zucchero ricchi di glucosio e xilosio, inibitori della fermentazione sono generati dal pretrattamento chimico necessario per abbattere emicellulosa ed esporre la cellulosa per l'attacco enzimatico. L'acido acetico, furfurolo, e idrossimetilfurfurale (HMF) si pensa di essere componenti chiave tra molti inibitori che si formano durante il pretrattamento. Per spostare l'industria dell'etanolo lignocellulosiche avanti, ricerca e procedure per consentire l'evoluzione di ceppi di lievito in grado di sopravvivere ed efficiente funzionamento di utilizzare sia esosi e pentosi in presenza di tali composti inibitori sono necessari. Una significativa debolezza aggiuntiva di ceppi di lievito industriali tradizionali, come Saccharomyces cerevisiae, è l'incapacità di fer efficientet il xilosio disponibile in idrolizzati di biomassa vegetale.

Pichia stipitis ceppo NRRL Y-7124 (CBS 5773), recentemente rinominato stipitis Scheffersomyces, è un lievito di fermentazione pentoso nativa che è ben noto a fermentare xilosio in etanolo. ^2,3 L'evoluzione del ceppo NRRL Y-7124 è stato perseguito qui perché è stato documentato per hanno il maggiore potenziale di ceppi autoctoni di lievito di accumulare etanolo economicamente recuperabili superiore a 40 g / L con poco sottoprodotto xilitolo. ^4,5,6 In mezzi ottimale, S. ceppo stipitis NRRL Y-7124 produce 70 g / L di etanolo a 40 ore (1,75 g / L / hr) con una resa di 0,41 ± 0,06 g / g in colture ad alta densità cellulare (cellule 6 g / L). ^7,8 Resistenza agli inibitori di fermentazione etanolo, furfurale e HMF è stata riportata anche, ⁹ e S. stipitis è stato classificato tra i più promettenti lieviti indigeni pentoso-fermentazione disponibili per scala commerciale di etanolo production da lignocellulosa. ¹⁰ Il nostro obiettivo era di applicare diverse idrolizzati lignocellulosici undetoxified e pressioni selettive etanolo per forzare evoluzione verso un derivato più robusta di ceppo NRRL Y-7124 adatto per applicazioni industriali. Chiave tra caratteristiche migliorate ricercati erano i tassi più veloci di zucchero di assorbimento in idrolizzati concentrati, ridotto diauxy per un utilizzo misto di zucchero più efficiente e più elevati tolleranze di etanolo e inibitori. L'applicazione di S. stipitis a idrolizzati undetoxified era un obiettivo chiave della ricerca per eliminare le spese di funzionamento aggiunto associati ai processi di disintossicazione idrolizzato, come overliming.

Due idrolizzati industrialmente promettenti sono state applicate per forzare l'evoluzione:. Enzima saccarificato espansione pretrattati paglia del mais idrolizzato fibra di ammoniaca (AFEX CSH) e diluire l'acido-pretrattati panico verga idrolizzato liquore (PSGHL) ^11,12 tecnologia di pretrattamento AFEX è stato sviluppato perminimizzare la produzione di inibitori della fermentazione, mentre diluito pretrattamento acido rappresenta la tecnologia minor costo corrente più comunemente praticato per esporre biomassa cellulosica per saccarificazione enzimatica. PSGHL è separabile dalla cellulosa che rimane dopo pretrattamento ed è tipicamente ricco di xilosio dal emicellulosa idrolizzato, ma a basso contenuto di glucosio. AFEX CSH e composizioni PSGHL differiscono l'uno dall'altro in aspetti chiave che sono stati sfruttati per gestire il processo di evoluzione. AFEX CSH è inferiore in aldeidi furano e inibitori dell'acido acetico ma superiore di aminoacidi e fonti di azoto ammoniacale rispetto PSGHL (Tabella 1). PSGHL presenta la sfida aggiuntiva di xilosio essere lo zucchero predominante disponibile. Così PSGHL è opportuno arricchire specificatamente per una migliore utilizzazione xilosio in idrolizzati, una debolezza prevenire l'uso commerciale di lievito disponibili. Anche tra i lieviti di fermentazione pentosi autoctoni, la dipendenza dal xylo zucchero non ottimalese per sostenere la crescita cellulare e la riparazione diventa ancora più impegnativo in idrolizzati a causa di una serie di motivi:. carenze nutrizionali, inibitori causando danni alla cella integrità strutturale e disagi per il metabolismo dovuti a squilibri redox ⁹ supplementazione azoto, in particolare sotto forma di aminoacidi, possono rappresentare un costo di esercizio significativo per fermentazioni. L'impatto della supplementazione di azoto sullo screening isolare e la classifica è stata esplorata con idrolizzati panico verga.

Individui migliorati sono stati arricchiti in una popolazione in continua evoluzione utilizzando più pressioni selettive affidamento sulla naturale diversità genetica del S. popolazione stipitis e mutazioni indotte da esposizioni a due idrolizzati diverse, etanolo o radiazioni UV. Pressioni di selezione sono stati applicati in parallelo ed in serie ad esplorare il progresso evoluzione S. stipitis verso derivati desiderati in grado di crescere e fermentare in modo efficiente in idrolizzati(Figura 1). La coltura ripetitivo delle popolazioni funzionali in idrolizzati sempre più difficili è stato realizzato in micropiastre utilizzando una serie di diluizioni di entrambi il 12% glucano CSH AFEX oppure PGSHL preparati al 20% di solidi di carico. L'applicazione di una crescita etanolo-sfidato il xilosio in coltura continua ulteriormente migliorata Afex CSH adattato popolazioni, arricchendo di fenotipi che dimostrano meno suscettibilità a etanolo repressione di utilizzo xilosio. Quest'ultima caratteristica è stata recentemente dimostrato problematico l'utilizzo pentoso dal ceppo NRRL Y-7124 dopo la fermentazione del glucosio. ⁸ Arricchimento su PSGHL è stato accanto esplorata per ampliare la funzionalità idrolizzato.

Derivati putativi migliorate di S. stipitis NRRL Y-7124 sono stati isolati da ogni fase del processo di evoluzione utilizzando arricchimento mirato in condizioni di stress e la placcatura di diluizione a raccogliere le colonie dalle popolazioni più diffuse. relativa adimensionaleindici di performance (RPI) sono stati utilizzati per classificare ceppi sulla base di prestazioni complessive, in cui il comportamento cinetico è stata valutata su diversi tipi idrolisati e supplementi nutrizionali applicate. Anche se i successi di varie procedure di adattamento per migliorare la funzionalità di S. stipitis in idrolizzati lignocellulosici sono stati precedentemente documentato, i ceppi che dimostrano la produzione di etanolo economica su idrolizzati undetoxified non sono stati precedentemente riportati. ^13-17 Utilizzando le procedure evoluzione da visualizzare in dettaglio qui, Slininger et al. ¹⁸ hanno sviluppato ceppi che sono notevolmente migliorate nel corso ceppo NRRL Y-7124 e sono in grado di produrre> 40 g / L di etanolo in AFEX CSH ed enzimi saccarificato idrolizzato panico verga (SGH) opportunamente integrato con le fonti di azoto. Questi nuovi ceppi sono di futuro interesse per la lignocellulosa in via di sviluppo per l'industria dell'etanolo e come soggetti di genomica ulteriori studi edificiosu quelli di ceppo precedentemente sequenziato NRRL Y-11545. ¹⁹ Uno studio di genomica dei migliori ceppi di prodotti durante le varie fasi di evoluzione diagramed nella figura 1 sarebbe chiarire la cronologia delle modifiche genetiche che si sono verificati durante lo sviluppo come un preludio ad ulteriori ricerche miglioramento ceppo.

Protocollo

1. Preparare Avvio di materiali e attrezzature per saggi

1. Preparare idrolizzati utilizzano da 18 a 20% peso secco biomassa iniziale nella reazione pretrattamento per uso nell'evoluzione, isolamento e procedure ranking. Vedere Slininger et al. 2015 ¹⁸ per i metodi dettagliati per preparare AFEX CSH, PSGHL, e SGH con supplementi di azoto N1 o N2 utilizzati in evoluzione, l'isolamento o la classifica. Vedere la Tabella 1 per la composizione di ogni tipo idrolizzato.
   NOTA: fortificazioni azoto di SGH stati designati come SGH-N1 o SGH-N2 definiti come segue: SGH-N1 = SGH fortificato a 42: 1 molare carbonio rapporto azoto (C: N) con fonti di azoto tra cui urea, ammino libero-vitamina acidi da caseina, D, L-triptofano, L-cisteina, e vitamine da fonti definiti (tale che ~ 15% molare di azoto N è azoto amminico primario (PAN) e ~ 85% di N è da urea); SGH-N2 = SGH fortificato a 37: 1 C: N con urea e farina di soia come il più basso costo fonte commerciale oaminoacidi e vitamine F, fornendo ~ 12% di N dal PAN e 88% come l'urea.
2. Acquisire una cultura liofilizzata del ceppo, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) dalla Culture Collection ARS (Centro Nazionale per la Ricerca utilizzo agricolo, Peoria, Illinois), e preparare glicerolo colture di come diretto. Mantenere culture azionari del lievito madre e dei suoi derivati ​​in 10% glicerolo a -80 ° C.
   1. scorte consecutive glicerolo al lievito malto peptone destrosio (YM) piastre di agar (3 g / l estratto di lievito, 3 g / L estratto di malto, 5 g / l peptone, 10 g / L di destrosio, 20 g / l di agar) ed incubare 48- 72 ore a 25 ° C. ⁸ piastre sviluppati può essere conservato fino ad una settimana a 4 ° C prima dell'utilizzo come liquido di pre-coltura inoculi.
3. Preparare definite in modo ottimale Media (ODM), un terreno sintetico compatibile con le procedure di formulazione industriali ²⁰ che è stato precedentemente sviluppato per la conversione ottimale di xilosio in etanolo dalla str genitoreain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Utilizzare il supporto definito in tutte le precultures e culture per il test biologici prestazioni di fermentazione e anche per l'etanolo in discussione, l'evoluzione della cultura continua xilosio-fed. Composizione ODM è elencato per riferimento nella tabella 2.
4. Come descritto in precedenza, ¹⁸ analizzare biomassa cellulare utilizzando uno spettrofotometro lettura cuvette- o micro-piastra, a seconda dei casi, per misurare la cultura di assorbanza a 620 nm (A _620). Quantificare zuccheri, etanolo, furfurale, idrossimetilfurfurale (HMF), e acido acetico in campioni di coltura mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o robotizzato determinazione enzimatica di glucosio e xilosio per una maggiore produttività.

2. Arricchisci Derivati ​​robusti durante il trasferimento seriale su AFEX CSH

1. Seminare un precoltura di ceppo NRRL Y-7124. Trasferire le cellule da YM agar a 75 ml ODM + 150 g / L xilosio per mantenere la capacità di crescere sotto olo stress smotic. Incubare precultures in 125 ml flaconi chiusi con la spugna in silicone spine 24 ore a 25 ° C con agitazione (150 rpm, 1 "orbita).
2. Scongelare aliquote congelate del 6-12% glucano CSH AFEX in acqua fredda per l'uso. Regolare il pH a 5, se necessario e filtro sterilizzare prima di preparare una serie di diluizioni in 96 pozzetti.
3. Riempire micropiastre con 50 pl per pozzetto e 8 pozzetti per la diluizione idrolizzato, poi inoculare con pochi microlitri di precoltura per pozzetto per consentire una assorbanza iniziale (620 nm) A ₆₂₀ ≥0.1. Incubare le piastre staticamente 24-48 ore a 25 ° C in una scatola di plastica con un tovagliolo di carta bagnata per l'umidità.
4. Usando la diluizione idrolizzato più concentrata che visibilmente cresciuto a A _620> 1, trasferimento 1-5 microlitri a ciascun pozzetto di una nuova serie di diluizione idrolizzato per ottenere iniziale A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Monitorare la cultura della crescita Una ₆₂₀ in micropiastre con uno spettrofotometro. Una serie di diluizioni non inoculato serves come controllo e vuoto. coperchi piastre vengono lasciati durante il monitoraggio per evitare la contaminazione, e le letture adeguati di conseguenza.
6. Preparare le scorte glicerolo di culture adattamento regolarmente per il successivo isolamento di ceppi migliorati o per l'uso in reinoculating la serie di diluizioni idrolizzato di continuare. Per preparare le scorte, piscina quattro pozzi (200 ml) della maggiore concentrazione idrolizzato colonizzato. Mescolare 1: 1 con il 20% glicerolo sterile in cryovials, per congelare le cellule in 10% glicerolo a -80 ° C.
7. Ripetere i passaggi 2,3-2,6 fino a una crescita nel 12% glucano CSH AFEX è costantemente visibile a 24 ore.

3. cellulari Isolare singolo tolleranti Derivati ​​dopo arricchimento AFEX CSH

1. Streak selezionato scorte glicerolo di culture di adattamento ai YM agar e utilizzare strisce per inoculare 50 ml di 3% o 6% glucano AFEX CSH (pH 5) in ciascuno dei tre pozzetti (iniziale A ₆₂₀ ~ 0,1). Incubare micropiastre 24 ore come al punto 2.3. Pool replicate colonizzato pozzi alla massima resistenza idrolizzato con una forte crescita, e piastra di diluizione a YM o 6% glucano AFEX CSH agar. Preparare il secondo come un 1: 1 mix di filtro sterilizzato il 12% glucano CSH AFEX con caldo soluzione / L agar 30 g autoclave.
2. Scegliere 5 singole colonie dalla più alta piastra di diluizione che mostra una crescita dopo incubazione di 24-48 ore a 25 ° C per congelare come glicerolo colture di. Streak ogni colonia ad una piastra YM. Incubare 24 ore. Con un'ansa sterile, trasferire una striscia sviluppato di cellule ad un piccolo volume di 10% glicerolo, miscela di sospendere le cellule, e distribuire a 2-3 cryovials per congelamento a -80 ° C.

4. valutare le prestazioni di AFEX CSH derivati ​​tolleranti Rispetto a Parent

1. Prova Isolati in semplici Culture 6% glucano AFEX CSH batch.
   1. Trasferire le cellule provenienti da 48 piastre hr striati dalle scorte glicerolo a pH tampone fosfato di potassio 7 (0,4 mm) per preparare sospensioni cellulari con A ₆₂₀ = 10. Usare 1 ml diogni sospensione per inoculare ciascuno dei quattro pozzi di 50 ml 3% idrolizzato glucano a siglare A ₆₂₀ = 0,2. Incubare micropiastre 24 ore come al punto 2.3. Preparare il glucano CSH 3% AFEX a pH 5 diluendo 12% glucano AFEX CSH 1: 3 con acqua sterile.
   2. Trasferimento due pozzi 24 ore micropiastre per inoculare 25 ml precultures di pH 5 al 12% glucano CSH AFEX utilizzati al 50% del fondo di forza. Incubare precultures in beute da 50 ml con silicio chiusure spugna per 24 ore a 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "orbita) Preparare la mezza forza 12% glucano AFEX CSH diluendo l'idrolizzato 1:. 1 con acqua sterile.
   3. Utilizzare mezza forza precultures idrolizzato per inoculare 25 ml simili culture di crescita a siglare A ₆₂₀ = 0,1. Incubare le culture di crescita come sopra (4.1.2) e assaggiare tutti i giorni (0,2 ml). Accumuli Monitor di biomassa (A ₆₂₀₎ e le concentrazioni di zuccheri e prodotti di fermentazione (HPLC).
2. Alternativamente, repitch (cioè, raccolta e reuse) popolazioni di 6% glucano AFEX lievito CSH-produzione di test a 8% glucano culture lotti idrolizzato, come descritto in precedenza. ¹⁸
3. In alternativa, altre popolazioni di prova delle repitched 6% glucano culture CSH Afex alimentando con il 12% idrolizzato glucano, come descritto in precedenza. ¹⁸
4. Prova ritardo diauxic degli isolati in colture lotti di ODM con zuccheri misti.
   1. Seminare precultures di 75 ml ODM con 150 g / L xilosio in 125 ml boccette con chiusure spugna silicone per trasferimento ad anello da YM striature glicerolo. Incubare 24 ore come al punto 2.1.
   2. Utilizzare precultures inoculare simili culture 75 ml di prova con ODM contenente 75 g / L di glucosio e 75 g / L di xilosio a pH 6,5. Agitare beute a 25 ° C, 150 rpm. Esempio di tutti i giorni.
   3. In alternativa, testare l'impatto di acido / L acetico 0-15 g su diauxy durante la fermentazione di glucosio e xilosio utilizzando un protocollo simile, tranne pH iniziale è fissato a 6,0 ± 0,2 in colture di prova per mantenere il pH 6-7 duanello consumo di acido acetico, come descritto in precedenza. ¹⁸

5. Applicare cultura continua a selezionare per l'etanolo-sfidato xilosio utilizzo

1. Preparare ODM come mezzo di alimentazione coltura continua con 60-100 g / L xilosio, 20-50 g / L di etanolo a pH 6,3 ± 0,2. Scegliere combinazioni di xilosio ed etanolo per simulare la fermentazione parziale di 150 g / l xilosio, ipotizzando un potenziale resa di ~ 0,5 g etanolo / g xilosio, e ad accogliere il potenziale di 50-70 g / L di etanolo a verificarsi. ⁸
2. Per preparare l'inoculo coltura continua, trasferire un rappresentante AFEX CSH-tolerant colonia (analogo a Colony 5 in esempio, la Figura 1) dal ciclo da un piatto YM 48 hr a 75 ml del ODM libera-etanolo (100 g / l xilosio, in questo caso) in 125 ml flaconi. Incubare a 25 ° C, 150 giri al minuto (1 "orbita) per 24 ore. Scegliere la precoltura concentrazione ODM xilosio che corrisponda a quello del volume iniziale tenendo coltura continua.
3. Seminare un volume di coltura continua ODM tiene a pH 6.3 ± 0.2 con 100 g / L xilosio + 20 g / L di etanolo con ~ 5-10 ml di un concentrato precoltura di un isolato AFEX CSH-tolerant (analogo a Colony 5, Figura 1 ) per ottenere 100 ml a iniziale a ₆₂₀ ~ 0.5. Mantenere la cultura trattenere volume (V _R), a 25 ° C in un matraccio incamiciata filatore 100 ml agitazione a 200 rpm e provvisto di sterilizzabile elettrodo pH, regolatore di pH e di circolazione bagno d'acqua a temperatura controllata.
4. Inizialmente, poiché la crescita cellulare sarà lenta a causa della esposizione etanolo, impostare il mezzo di alimentazione di dosare utilizzando una pompa pH azionato. Impostare la pompa per alimentare pH 6.3 ODM con 100 g / L xilosio e 50 g / L di etanolo durante la fermentazione cultura scende il pH a 5,4, fermando così ulteriormente goccia pH. Mantenere il volume a 100 ml con una pompa effluente schiumando continuamente la superficie cultura. Di conseguenza, la concentrazione di etanolo aumenta con il metabolismo e l'alimentazione continua.
5. Misurare effluenti e prelevano campioni (1-2 ml) da colture continue ogni 48-72 ore per l'analisi della concentrazione di cellule vitali, prodotti e substrati, come precedentemente descritto. ¹⁸ Per trovare la concentrazione di cellule vitali, rendere seriali 1:10 diluizioni dei campioni tampone (vedi 4.1.1) e la piastra di diffusione le diluizioni a YM agar (vedi 1.2.1). Sulla base di tassi di raccolta degli effluenti (Q), calcolare il tasso di diluizione (D) (Q / V _R), e, nell'esempio di S. stipitis, che variava dallo 0 al 0.01 h ^-1.
6. Salvare le scorte glicerolo regolarmente isolando dai piatti di fattibilità di diluizioni del campione buffered formando 30-100 colonie, che rappresenta i coloni robusti più diffuse a quel tempo in arricchimento. piastre inondazione con ~ 5 ml di glicerolo al 10% per permettere la preparazione di cryovials duplicati. Per la manutenzione o per una pausa, fermare la cultura continua e riavviare, se necessario utilizzando più recente (resistente) stock di glicerolo (s).
7. Per riavviare, striscia lo stock di glicerolo (s) di piùpopolazioni resistenti a YM agar e il trasferimento di 24-48 cellule hr per ciclo per una pre-cultura del ODM libera-etanolo per l'incubazione come sopra. Seminare i 100 ml in possesso di volume di ODM per iniziale A ₆₂₀ 0.5 utilizzando un concentrato di lievito precultured, e consentire la cultura di crescere batch saggio fase stazionaria prima che il flusso medio di alimentazione viene riavviato.
8. Se culture possono crescere costantemente a> 0,01 ore ^-1 xilosio in presenza di> 25 g / L di etanolo, avviare l'alimentazione continua coltura (ODM + 60 g / L xilosio + etanolo vanno 30 a 50 g / L) a bassa tasso di diluizione ~ 0,01 hr ^-1 a 100 ml in possesso del volume (inizialmente ODM + 60 g / L xilosio + 20 g / L di etanolo). Nel corso del tempo, aumentare l'etanolo nel mangime verso 50 g / L. Cattura popolazioni avanzate in scorte glicerolo.
   NOTA: Mantenere il tasso di diluizione basso permette la formazione di una concentrazione elevata di cellule sufficiente per ridurre la disponibilità di ossigeno e il supporto di fermentazione.
9. Opzionalmente, si applicano ultravioletta (UV) irradiatione mensile per glicerolo popolazioni azionari utilizzati per reinoculate culture continui.
   1. colonie Risospendere da stock di glicerolo striature in 10 ml di ODM (come in precultures) con 60 g / L xilosio e una piscina per tutti gli stock in un unico pallone sterile. Applicare la sospensione cellulare in pool a ~ 5 x 10 ⁸ vitali cellule / ml per coprire solo il fondo di 4-5 piastre di Petri con 6 ml / piastra. Per ottenere una copertura 6 ml di una piastra standard di Petri usa e getta, a meno di 15 ml di superare la tensione superficiale, e quindi rimuovere 9 ml.
   2. Esporre ogni piatto cultura aperta ai raggi UV dalla fonte di luce in un armadio di sicurezza biologica. Regolare il tempo di esposizione ai raggi UV o la distanza per ottenere il tasso di uccidere desiderato> 90%. Qui, esporre per 45 min a circa 56 cm dalla sorgente.
   3. Diluire sospensioni cellulari piastra prima e dopo l'irraggiamento. Stima tasso di uccidere sulla base di unità formanti colonie. Per la S. stipitis esempio, il tasso di uccidere era ~ 97%.
   4. Trasferire le culture UV-esposti (24-30 ml) di una lamina-CoVEred 50 beuta ml, e incubare a 25 ° C e 150 rpm per 24 ore per permettere la piccola percentuale di cellule vitali per ripopolare a ~ 1 x 10 ⁸ praticabile S. stipitis cellule / ml. Impedendo riattivazioni di foto, la pellicola di copertura conserva mutazioni mentre colture sono incubate.
   5. Utilizzare la cultura mutagenizzato ripopolata per inoculare culture continui a ~ 1 x 10 ⁷ cellule / ml vitali. Riavviare il ODM + 60 g / L di avanzamento medio xilosio etanolo arricchito per continuare il processo di selezione.

6. Valutare stock di glicerolo Popolazioni e individuare quelli con una migliore xilosio fermentazione in presenza di etanolo

1. Streak selezionato glicerolo colture stock di YM agar come il primo passo nella schermata migliore per la crescita e la fermentazione dello xilosio in presenza di etanolo.
2. Trasferire ogni popolazione evoluta per essere schermato da striature di agar a 75 ml precultures in ODM con 150 g / L di glucosio, e incubare in 125 ml palloni 96hr prima dell'uso come inoculi per colture di prova. Le grandi popolazioni di glucosio-grown richiederanno l'induzione di enzimi per l'utilizzo xilosio.
   1. Per testare induzione, raccogliere ogni cultura, sospendere le cellule a 30 ml, iniziale A ₆₂₀ di 40 in ODM +60 g / L xilosio + 30-45 g / L di etanolo, e incubare a 25 ° C, 150 rpm (1 "orbita) in 50 ml boccette con silicio chiusure spugna. Disegnare campioni due volte al giorno per il monitoraggio xilosio assorbimento mediante analisi HPLC.
3. In alternativa, come descritto in Slininger et al., ¹⁸ per valutare la crescita su xilosio in presenza di etanolo, preparare precultures di ciascuna popolazione evoluto dal trasferimento ad anello a 75 ml di ODM con 150 g / l xilosio in 125 ml boccette, e incubare 96 hr a 25 ° C, 150 rpm (1 "orbita). Seminare colture di prova ad un livello basso iniziale a ₆₂₀ 0,1 in 25 ml di ODM + 60 g / L xilosio + 30-45 g / L di etanolo in 125 ml flaconi. Incubare fiaschi a 25 ° C, 300 rpm, 1 "orbita e campione.

7. Isolare singole colonie di cellule che utilizzano xilosio in PSGHL Quando etanolo è presente

1. Sulla base dei risultati della fase 6, selezionare azionari popolazioni glicerolo che mostrano capacità superiore di crescere su e fermentare xilosio in presenza di etanolo. Utilizzare questi per piastre striscia. Le piastre a scansione vengono utilizzati per preparare dense, sospensioni cellulari tamponate di A ₆₂₀ = 5. Poi sospensioni cellulari vengono usati per inoculare precultures in pozzetti 96-profonde A ₆₂₀ = 0,5. Inoculare 1 ml precultures su PSGHL miscelati 1: 1 con ODM + 50 g / L xilosio (senza etanolo). Incubare precultures a 96 pozzetti, piatti e profondi con ventilato bassa evaporazione copertine per 48 ore a 25 ° C, 400 rpm, 1 "orbita. Separare diversi stock di glicerolo popolazioni di pozzi vuoti.
2. Utilizzando ogni precoltura, inoculare sedici 1 ml replicano culture iniziale A ₆₂₀ ~ 0,5 a 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xilosio con il 20, 30, o 40 g / L di etanolo per arricchire coloni tolleranti. Incubare cultu arricchimentores in modo simile a precultures.
3. Per ogni glicerolo diverso magazzino, raccogliere i pozzi di cultura con la più alta concentrazione di etanolo permettendo l'uso di crescita e xilosio. Piatto ciascuna linea cellulare di YM agar per ottenere singole colonie prevalenti conservare in glicerolo. Raccogliere dieci colonie per linea cellulare e striscia ciascuna ad una piastra di agar YM per stock di glicerolo preparazione.

8. Ulteriori Arricchisci robusta Evolved Ceppi durante il trasferimento seriale su PSGHL, come per AFEX CSH

1. Preparare pre-culture di NRRL Y-7124 (genitore), AFEX CSH-tolerant evoluta isolare, e la cultura continua evoluzione della popolazione con una maggiore capacità di utilizzare xilosio in presenza di etanolo. Seminare 75 ml di ODM + 150 g / L xilosio dal loop dal glicerolo archivi striature come descritto sopra (passo 2.1) per il processo di adattamento idrolizzato AFEX CSH.
2. Diluire PSGHL con acqua per fornire una serie di concentrazioni crescenti. Preparare una micropiastra a 96 pozzetti per ciascuna delle tre linee cellulari utilizzando ciascundiluizione PSGHL per riempire 8 pozzetti con 50 microlitri. Utilizzare precoltura per inoculare ogni 50 ml di micro-cultura delle serie di diluizione a siglare un ₆₂₀ ~ 0,1-0,5.
   1. Continuare l'evoluzione del lievito in aumento punti di forza di PSGHL utilizzando la stessa procedura del adattamento idrolizzato AFEX CSH sopra descritto (punto 2), fino a quando le culture sono in grado di crescere nel idrolizzato piena forza in una stalla 14-d rapporto medio di ΔA ₆₂₀ per Δtime i trasferimenti seriali sono proseguiti ulteriori quattro mesi.

9. singole colonie di cellule isolarli utilizzando PSGHL Sfumature con o senza etanolo sfida

1. Ottenere cella singola isola direttamente dalla piena forza PSGHL piastre di adattamento finali per la placcatura di diluizione per YM agar. Raccogliere dieci grandi colonie per ciascuna delle tre linee cellulari e bar consecutive a piastre YM preparare scorte glicerolo come precedentemente descritto (passo 3.2).
2. Facoltativamente, esplorare precedenti punti temporali inprocesso evolutivo isolando dalle scorte glicerolo memorizzati delle tre linee cellulari.
   1. Seminare una precoltura per ciascuna linea cellulare da loop dal glicerolo archivi striature e incubare 24 ore su 30 ml ODM + 50 g / L xilosio (beute da 50 ml, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Cellule sfida di precultures alla crescita idrolizzato inoculando 50 ml di 50% PSGHL in pozzetti a un iniziale A ₆₂₀ ~ 0.2 e incubando staticamente 48 ore.
   3. Distribuire 0,1 ml di ciascuna coltura arricchita su piastre di agar PSGHL pendenza che varia da 0 a 50% idrolizzato forza (consegna ~ 300-400 cellule vitali per piastra), e raccogliere 10 singole colonie per linea cellulare dalla superficie più alta possibile concentrazione idrolizzato del gradiente . ²¹ Streak scelto colonie di YM per stock di glicerolo preparazione come al punto 3.2.
   4. In alternativa al punto 9.2.3, invece di inoculare le piastre di agar gradiente, inoculare pozzetti di 96 pozzetti micro-piastre a siglare A ₆₂₀ ~ 0.2, where i pozzetti sono progettati per contenere un intervallo di concentrazioni idrolizzato dal 50 al 100% forza ed etanolo da 10 a 40 g / L. In questo caso, sviluppare micropiastre 72-96 hr e altrimenti come al punto 2.3. Isolare dieci singole colonie da pozzi dei più difficili combinazioni idrolizzato-etanolo che mostrano la crescita tramite diluizione in piastra, e preparare le scorte glicerolo come al punto 3.2.

10. In una schermata primaria, eliminare le Gli isolati inferiori confrontando e Ranking performance su PSGHL a due condizioni di nutrienti

1. Applicare uno schermo piatto fondo ben throughput elevato di prestazioni PSGHL allo schermo cinque serie di trenta isolati con NRRL Y-7124 genitori e isolare AFEX CSH-tolerant (analogo a Colonia 5 dell'esempio evoluzione figura 1) come controlli di scegliere sei migliori ceppi (20%) da ogni set per passare al livello di screening secondario (punto 12).
2. Effettuare lo schermo in pozzetti profondi pieni 1 ml per bene e wi coperteth coperchi in acciaio inox con silicone nero bassi sigilli evaporazione. Bloccare tutte le piastre al consiglio di amministrazione della incubatore / shaker e far funzionare a 25 ° C e 400 giri al minuto (1 "shaker orbita). Progettare tutto profondo pozzetti modelli di riempimento per consentire la separazione di diversi isolati dai pozzi aperti.
3. Per iniziare coltivazioni, scegliere una goccia di cellule provenienti da striature glicerolo preparati da 30 isolati ottenuti come sopra (nei punti 3, 7 e 9) ai pozzetti delle ODM + 50 g / L xilosio e incubare 48 ore.
4. Come mezzo sfida per preculturing isolati, preparare 50% PSGHL mescolando PSGHL 1: 1 con ODM + 10 g / L di glucosio + 50 g / L xilosio. Per lo screening 30 isolati e due ceppi di controllo, 2 piastre con 2 pozzetti per ciascuno dei 16 isolati sono pieni, lasciando pozzi vuoti tra i diversi isolati.
5. Per colture sfida, trasferimento, un volume di 50 ml di ODM pre-colture (A ₆₂₀ ~ 10) a ciascuno dei due pozzetti di coltura sfida PSGHL 50% per ciascuno degli isolati e controlli per ottenere un initiAl A ₆₂₀ ~ 0.5 e incubare 72 ore.
6. Utilizzare due mezzi di prova dei diversi ricchezza nutrizionale per lo screening isola: 60% PSGHL + ODM sostanze nutritive; e il 75% PSGHL + nutrienti ODM + YM. Aggiungere nutrienti ODM (esclusi zuccheri) a metà della forza di serie per ODM usare con 50 g / L di zucchero (passo 1.3). Come indicato, aggiungere sostanze nutrienti YM (esclusi zuccheri) a metà della concentrazione standard di 3 g / L di estratto di lievito, 3 g / L estratti di malto, 5 g / L peptone.
7. Seminare colture di prova con il trasferimento di 50 ml di 72 ore il 50% delle Sfide PSGHL pre-culture per inoculare 1.000 ml a siglare A ₆₂₀ ~ 0,5 in cinque pozzi profondi per ciascuno dei due mezzi di prova.
8. Campionare ciascuna isolare tutti i giorni. Pipettare il contenuto di un pozzo ad una provetta per microcentrifuga e centrifugare (5.533 xg, 15 min) per ottenere supernate per l'etanolo, il glucosio e xilosio analisi high throughput. Misurare biomassa come ₆₂₀ a 96 pozzetti micro-piastre (200 pl / pozzetto) con uno spettrofotometro.
9. All'interno di ciascun gruppo di 30 èolates testato (5 set per S. stipitis NRRL Y-7124 evoluti ceppi), calcolare indici di performance relativi (RPI) come descritto al punto 11 qui di seguito e utilizzare per classificare ogni ceppo sulla base di produzione di etanolo (massimo di etanolo accumulato per lo zucchero iniziale in dotazione) e velocità di assorbimento xilosio (concentrazione xilosio consumata per iniziale a 96 ore) su entrambi i mezzi di prova.

11. Classifica Isolati nella schermata principale PSGHL Utilizzando Performance Index relativa (RPI)

1. A seguito di screening primario, calcolare indici di performance relativi adimensionali (RPI), al fine di classificare il 30 isolati in ciascuno dei cinque diversi esperimenti per schermo isolati su PSGHL con due diverse formulazioni di nutrienti per esperimento, vale a dire, il 60% PSGHL e il 75% PSGHL.
2. Calcolare il parametro statistico F per l'uso in classifica prestazioni isolare all'interno di un gruppo di isolati testati in un dato esperimento: F = (XX _avg) / s. Qui, X è il parametro prestazioni, quali la resa (Y)o il tasso di (R), osservato per ogni individuo isolato, mentre X _AVG e s sono la media e deviazione standard, rispettivamente, di X osservata per tutti gli isolati all'interno di un dato esperimento. Per le distribuzioni normali, -2
3. Per ogni isolato in un esperimento, calcolare la performance relativa in base alla frequenza, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, e allo stesso modo di calcolare la performance relativa sulla base di rendimento, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . Il valore di RPI va da 0 a 100 ~ percentile (più basso al più alto). Poi calcolare le medie RPI per ogni isolato all'interno di un dato esperimento idrolizzato come segue: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, in cui i contributi di rendimento e di tasso sono dati lo stesso peso in questa applicazione.
   Si noti che, in generale, i parametri di rendimento e di tasso possono essere ponderati se ritenuto disuguale importanza.
4. Calcolare RPI _generale tra i tipi di n idrolizzati testati: RPI _generale = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Considerate ogni isolato in una serie sperimentale di 30 isolati e 2 controlli. Durante la classifica principale del ~ 150 single-colonia isolati adattato alle xilosio-ricchi PSGHL, l'RPI _globale è calcolato per i tassi e rendimenti attraverso le due formulazioni PSGHL applicati nello schermo, vale a dire, il 60% PSGHL e il 75% PSGHL, dove n = 2.
5. Sulla base di RPI _complessiva all'interno di ogni esperimento, scegliete la percentuale superiore di isolati di passare alla schermata secondaria. In questo esempio, il 20% dei ceppi sono scelti per passare attraverso (cioè, 30 di 150 testato).

12. In una schermata secondaria, confrontare Top Performers schermo primario su più idrolizzati completa (> 100 g / l Zuccheri misti) per rivelare più alto Funzionamento ceppi robusti

1. Confronto performer PSGHL top il 6% glucano CSH AFEX e SGH modificata con due livelli di azoto, SGH-N1 e N2 SGH-(composiziones come nella Tabella 1) per la classifica finale. Schermo 30 isolati che sono stati i top performer nella schermata ben piatto fondo primario di PSGHL (punti 10 e 11) e le due controlli (ceppo NRRL Y-7124 e isolare AFEX CSH-tolerant (analogo a Colony 5, Figura 1 Esempio ).
2. Iniziare coltivazioni scegliendo una goccia di cellule da striature glicerolo duplicare pozzi profondi da 1 ml ODM + 50 g / l xilosio come prima e incubare 48 ore nel profondo sistema di pozzetti (passo 10.2). Poi il trasferimento 50 ml di precultures ODM al 50% culture sfida SGH, e incubare al sistema ben piatto fondo per 72 ore per ottenere un ₆₂₀ a ~ 10). Preparare la SGH 50% mescolando SGH 1: 1 con sugarless ODM + 50 g / L xilosio (pH 5,6).
3. Per ciascuno degli isolati, inoculare una aliquota di SGH-N1-N2 o SGH 16 ml con il pellet cellulare (15 min, 2.711 xg) da tre pozzetti di coltura sfida per produrre cultura prova iniziale A ₆₂₀ ~ 2,0. Incubare colture di prova a 25 & #176;. C, 180 giri al minuto (1 "orbita) in palloni da 25 ml con chiusure spugna silicone fiaschi campione quotidiane e analizzare per lo schermo PSGHL.
4. Analogamente, schermo isolati come nei passaggi 12.2 e 12.3, ma questa volta sostituto SGH-N1 e N2 SGH-con 6% glucano CSH AFEX a pH 5,2 per l'uso nella preparazione del terreno di coltura sfida medio e coltura di prova. Per i 50% culture sfida la forza, usare il 6% AFEX CSH diluito 1: 1 con acqua in quanto è sufficiente l'azoto senza emendamenti.
5. Ripetere i passaggi 12,1-12,4 per duplicare i risultati.

13. Classifica le performance degli isolati nella schermata secondario con RPI _complessivo per votare utilizzo di più idrolizzati Complete

1. Calcolare indici di performance relativi (RPI) al fine di rango ciascuno dei top 20% degli isolati (~ 30 su 150) dalla schermata principale che sono stati testati nella schermata secondaria sul enzima saccarificato formulazioni idrolizzato di varia ricchezza nutrizionale.
2. Punteggio ogniisolare testato nella schermata secondaria sulla base di velocità di assorbimento xilosio e resa di etanolo eseguita su tre formulazioni idrolizzato da enzimi saccarificato pretrattata eseguito in duplicato, compreso AFEX CSH (i = 1 e 2), SGH-N1 (i = 3 e 4) e SGH -n2 (i = 5 e 6).
3. Calcolare il RPI _complessiva per ogni isolato, e applicare questo parametro classifica a vagliare ulteriormente l'elenco degli isolati superiori: RPI _complessivo = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, dove n = 6 .
   NOTA: Dimostrare cinetica di isolati superiori a idrolizzati SGH-N2 in culture pallone seguendo le procedure descritte in Slininger et al ^18.

Risultati

S. stipitis stata evoluto utilizzando combinazioni di tre culture di selezione, che comprendeva AFEX CSH, PSGHL e xilosio-fed coltura continua etanolo-sfidato. Figura 1 mostra lo schema degli esperimenti evoluzione eseguiti insieme gli isolati pensa sia per eseguire più efficacemente complesso, o più efficacemente su una delle testate idrolizzati. Tabella 3 mostra i numeri NRRL adesione di questi isolati superiori e riassume le sollecitazioni applicate adattamento nel process...

Discussione

Diversi passaggi sono stati fondamentali per il successo del processo di evoluzione. Innanzitutto, è fondamentale scegliere adeguate pressioni selettive a guidare l'evoluzione della popolazione verso i fenotipi desiderati che sono necessari per una corretta applicazione. I seguenti sollecitazioni selettivi sono stati scelti per S. stipitis sviluppo e applicata in tempi opportuni per guidare arricchimento per i fenotipi desiderati: crescente forza del 12% glucano AFEX CSH (che costringe la crescita e la fer...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com