Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу

Резюме

Адаптивные методы эволюции и изоляции описаны и продемонстрированы с получением производных Scheffersomyces stipitis штамма NRRL Y-7124, которые способны быстро потреблять гексозы и пентозы смешанных сахаров в фермента осахаривают undetoxified гидролизатов и аккумулировать более 40 г / л этанола.

Аннотация

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Введение

По оценкам , ежегодные 1,3 млрд сухих тонн биомассы лигноцеллюлозы может поддержать производство этанола и позволит США сократить потребление нефти на 30%. ¹ Хотя биомасса растений урожайность гидролиза сахара смеси , богатые глюкозы и ксилозы, ингибиторы брожения генерируются предварительной химической обработки , необходимой чтобы сломать гемицеллюлозы и подвергать целлюлозу ферментной атаке. Уксусная кислота, фурфурол и оксиметилфурфурола (HMF), как полагают, являются ключевыми компонентами среди многих ингибиторов, которые формируют во время предварительной обработки. Для того чтобы переместить лигноцеллюлозного производство этанола вперед, исследования и процедуры, чтобы позволить эволюцию штаммов дрожжей, способные выживать и эффективно функционировать использовать как гексозы и пентозы, в присутствии таких соединений, ингибирующих необходимы. Существенным дополнительным недостатком традиционных промышленных штаммов дрожжей, таких как Saccharomyces CEREVISIAE, является невозможность эффективного fermenт ксилозы имеющихся в гидролизатов биомассы растений.

Pichia stipitis штамма NRRL Y-7124 (CBS 5773), который недавно был переименован Scheffersomyces stipitis, является уроженцем пентозы брожения дрожжей , который хорошо известен брожение ксилозы в этанол. ^2,3 Эволюция штамма NRRL Y-7124 преследовалась здесь , потому что было документально имеют наибольший потенциал нативных штаммов дрожжей для накопления экономически извлекаемые этанола более 40 г / л с небольшим количеством ксилита побочного продукта. ^4,5,6 в оптимальном средах, С. stipitis штамм NRRL Y-7124 производит 70 г / л этанола в 40 ч (1,75 г / л / ч) с выходом 0,41 ± 0,06 г / г в культурах с высокой плотностью клеток (6 г / л клеток). ^7,8 Сопротивление для ингибиторов ферментации этанол, фурфурол и HMF также сообщалось, ⁹ и С. stipitis занимает первое место среди наиболее перспективных родных пентозы брожения дрожжей , доступных для промышленного масштаба этанола костюмноп от лигноцеллюлозы. ¹⁰ Наша цель заключалась в применении разнообразных undetoxified лигноцеллюлозных гидролизатов и давления отбора этанола , чтобы заставить эволюцию к более надежной производной штамма NRRL Y-7124 , пригодного для промышленного применения. Ключевое место среди усовершенствованных функций искомых были более высокие скорости сахара поглощение в концентрированных гидролизатов, снижение diauxy для более эффективного использования смешанного сахара, а также более высокие допуски этанола и ингибиторов. Применение S. stipitis к undetoxified гидролизатов был одним из ключевых направлений исследований , чтобы исключить дополнительные операционные расходы , связанные с гидролизата процессов детоксикации, такие как overliming.

Две промышленно перспективных гидролизатов были применены к силе эволюции:. Фермента осахаривают аммиака волокна расширения предварительно обработанных гидролизат кукурузы Стовер (AFEX CSH) и разбавленной кислотой предварительно обработанный проса гидролизат ликер (PSGHL) ^11,12 технология предварительной обработки AFEX разрабатывается с цельюсвести к минимуму образование ингибиторов ферментации, в то время как предварительная обработка разбавленная кислота, представляет текущую низкую стоимость технологии наиболее часто практикуется подвергать целлюлозной биомассы для ферментативного осахаривания. PSGHL отделима от целлюлозы, оставшегося после предварительной обработки и характерно богатая ксилозы из гидролизованного гемицеллюлозы, но с низким содержанием глюкозы. AFEX CSH и PSGHL композиции отличаются друг от друга в ключевых аспектах, которые эксплуатировались для управления процессом эволюции. AFEX CSH ниже в фурановых альдегидов и ингибиторы уксусной кислоты , но выше , в аминокислоты и источники азота , аммиака , по сравнению с PSGHL (таблица 1). PSGHL представляет дополнительную проблему ксилозы будучи преобладающим сахаром доступны. Таким образом, PSGHL целесообразно специально обогащают для повышения эффективности использования ксилозы в гидролизатов, слабость, предотвращающий коммерческое использование имеющихся дрожжей. Даже среди родных пентозы бродильных дрожжей, опора на неоптимальной сахара XyloSE для поддержки роста клеток и ремонт становится еще более сложной в гидролизатов из - за целого ряда причин:. недостаток питательных веществ, ингибиторов , вызывающих массовые повреждения клеток структурной целостности, а также нарушения в обмене веществ за счет окислительно - восстановительных дисбалансов ⁹ добавок азота, особенно в форме аминокислоты, могут представлять собой значительный эксплуатационные расходы для брожений. Влияние добавок азота на изолята скрининга и ранжирования был исследован с просо гидролизатов.

Улучшенные особи были обогащены в развивающейся популяции с использованием нескольких давления отбора зависит от естественного генетического разнообразия S. населения и мутации stipitis , индуцированный воздействием двух различных гидролизатов, этанол или УФ - излучения. Давление отбора были применены параллельно и последовательно исследовать ход эволюции в S. stipitis к желаемых производных , способных расти и брожение эффективно в гидролизатов(Рисунок 1). Повторяющиеся культивирование функциональных групп населения в более сложных гидролизатов было достигнуто в микропланшетах с использованием серии разведений либо 12% глюкан AFEX CSH или иначе PGSHL получают при 20% загрузки твердой фазы. Применение этанола роста заражали на ксилозы в непрерывной культуре дополнительно улучшена Afex CSH адаптированный населения путем обогащения для фенотипов, демонстрирующих меньшую восприимчивость к этанолу репрессию утилизации ксилозы. Последняя особенность недавно было показано , проблематично пентозы использования штаммом NRRL Y-7124 следуя ферментации глюкозы. ⁸ Обогащение на PSGHL была следующая изучить , чтобы расширить функциональные возможности гидролизата.

Предположительные улучшенные производные S. stipitis NRRL Y-7124 были выделены из каждой фазы процесса эволюции с использованием целевого обогащения в условиях стресса и разбавления покрытия , чтобы выбрать колонии из наиболее распространенных групп населения. безразмерная относительнаяПоказатели эффективности (RPIs) были использованы для ранжирования штаммов на основе общей производительности, где кинетическое поведение было оценено на различных типах гидролизата и пищевых добавок, применяемых. Хотя успехи различных процедур адаптации в целях улучшения функциональности S. stipitis в лигноцеллюлозных гидролизатов были ранее документированы, штаммы , демонстрирующих экономичного производства этанола на undetoxified гидролизатов не сообщалось ранее. ^13-17 С использованием процедур эволюции визуализировать здесь более подробно, Slininger и др. ¹⁸ разработали штаммы, которые значительно улучшены по сравнению родительский штамм NRRL Y-7124 и способны производить> 40 г / л этанола в AFEX CSH и фермента осахаривают гидролизат проса (SGH) соответственно с добавлением источников азота. Эти новые штаммы представляют интерес для будущего развивающегося лигноцеллюлозы в этанол промышленности и в качестве субъектов дополнительных исследований в области геномики строительствана тех , кто ранее секвенировали штамма NRRL Y-11545. ^19. геномика исследование верхних штаммов , полученных на различных этапах эволюции схематически на рисунке 1 бы пролить свет на историю генетических изменений , которые произошли в процессе развития в качестве прелюдии для дальнейших исследований по улучшению деформации.

протокол

1. Подготовка исходных материалов и оборудования для Assays

1. Подготовка гидролизатов с использованием 18 до 20% исходной биомассы сухого веса в реакции предварительной обработки для использования в процессе эволюции, изоляции и процедур ранжирования. См Slininger и др. 2015 ¹⁸ для детальных методов подготовки Afex CSH, PSGHL и SGH с азотными добавками N1 или N2 , используемых в процессе эволюции, выделения или ранжирования. Таблицу 1 для композиции каждого гидролизата типа.
   Примечание: Азотные Укрепления SGH были назначены в качестве SGH-N1 или SGH-N2 определяется следующим образом: SGH-N1 = SGH укреплен до 42: 1 молярном углерода к азоту (C: N) с источниками азота, включая мочевины, витамин свободных аминокислот кислоты из казеина, D, L-триптофан, L-цистеин и витамины из определенных источников (таких, что ~ 15% от молярного азота N первична аминоазот (ПАН) и ~ 85% N от мочевины); SGH-N2 = SGH укреплен до 37: 1 C: N с мочевиной и соевой муки, как самая низкая стоимость коммерческого источника OF аминокислоты и витамины, обеспечивая ~ 12% N от PAN и 88% в виде мочевины.
2. Приобретать лиофилизированного культуры родительского штамма, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) от АРС Culture Collection (Национальный центр сельскохозяйственного использования результатов исследований, Пеория, штат Иллинойс), а также подготовить запаса глицерина культур в соответствии с указаниями. Поддержание маточных культур родительского дрожжей и его производных в 10% глицерине при -80 ° С.
   1. запасы подряд глицериновые дрожжам солод пептон декстроза (YM) Чашки с агаром (3 г / л дрожжевого экстракта, 3 г / л солодового экстракта, 5 г / л пептона, 10 г / л декстрозы, 20 г / л агара) и инкубировать 48- 72 ч при 25 ° C. ⁸ развитых пластин может храниться до недели при температуре 4 ° с до использования в качестве жидкой предварительной культуры инокулята.
3. Подготовка Оптимальное определенной среде (ODM), синтетической среде , совместимые с промышленными способами формулирования ²⁰ , который был ранее разработанный для оптимального превращения ксилозы в этанол материнской улайн Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ⁷ Используйте определенной среде во всех предварительных культивирований и культур для биопроб производительности ферментации , а также для производства этанола оспорено, эволюция непрерывной культуры ксилозы кормили. Состав ODM указана для справки в таблице 2.
4. Как было описано ранее, ¹⁸ анализа биомассы клеток с использованием cuvette- или микроплиты спектрофотометр чтения, в случае необходимости, для измерения культуры оптической плотности при длине волны 620 нм (A _620). Сахара, количественно оценить этанол, фурфурол, оксиметилфурфурола (HMF) и уксусную кислоту в образцах культур с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или роботизированного ферментативного определения глюкозы и ксилозы для более высокой пропускной способности.

2. Пополните Прочные производных во время последовательной передачи на AFEX CSH

1. Инокулирования предкультуральной штамма NRRL Y-7124. Передача клетки от YM агара до 75 мл ODM + 150 г / л ксилозы, чтобы поддерживать способность расти при Osmotic стресс. Выдержите Предкультуры в 125 мл колбах с закрытыми кремниевого губки штекеры 24 час при 25 ° С с перемешиванием (150 оборотов в минуту, 1 "орбита).
2. Размораживайте аликвоты 6-12% глюкан AFEX CSH в холодной воде для использования. Доведения рН до 5, если это необходимо, и фильтр стерилизуют перед подготовкой серии разведений в 96-луночных микропланшетов.
3. Заполните микропланшет с 50 мкл на лунку и 8 лунок на гидролизата разведения, а затем прививают с несколькими микролитров предкультурой на лунку , чтобы обеспечить начальную оптическую плотность (620 нм) ₆₂₀ ≥0.1. Инкубируйте пластины статически 24-48 ч при 25 ° С в пластиковой коробке с влажным бумажным полотенцем для влажности.
4. Использование наиболее Концентрированный гидролизат разбавления , который заметно вырос до _620> 1, передача 1-5 мкл в каждую лунку нового гидролизат серии разведений для достижения первоначальный ₆₂₀ ≥ 0,1.
5. Монитор культуры роста ₆₂₀ в микропланшетах с помощью спектрофотометра. Неинокулированной серии разведений серVES в качестве контроля и пустым. Пластина крышки оставлены во время мониторинга в целях предотвращения загрязнения, а также показания соответствующим образом скорректированы.
6. Подготовка запасов глицерина адаптации культур на регулярной основе для последующего выделения улучшенных штаммов или для использования в reinoculating сохраняющуюся гидролизат серии разведений. Для подготовки запасов, бассейн четыре скважины (200 мкл) наибольшей концентрации гидролизата колонизирована. Смешайте 1: 1 с 20% стерильного глицерина в криопробирок, чтобы заморозить клетки в 10% глицерине при -80 ° С.
7. Повторите шаги 2,3-2,6 до роста в 12% глюкан AFEX CSH не постоянно видна через 24 часа.

3. Изолировать одноклеточ- толерантные производные после обогащения на AFEX CSH

1. Streak выбраны запасы глицерина адаптации культур к YM агар, а также использовать полосы для инокуляции 50 мкл 3% или 6% глюкан AFEX CSH (рН 5) в каждом из трех стрипы (начальная ₆₂₀ ~ 0,1). Инкубируйте микропланшеты 24 ч, как и в шаге 2.3. бассейн репликите колонизировали скважины на самом высоком гидролизата прочности с сильным ростом и разбавления пластины YM или 6% глюкан AFEX CSH агар. Готовят последний как 1: 1 смесь стерилизовать через фильтр 12% глюкан Afex CSH с теплым раствором автоклавного / л агара 30 г.
2. Pick 5 отдельных колоний с самого высокого роста показывая разбавление пластины после 24-48 ч инкубации при 25 ° C, чтобы заморозить, как глицерин маточных культур. Streak каждая колония на YM пластины. Выдержите 24 ч. С помощью стерильной петли, передавать развитую полосу клеток в небольшом объеме 10% глицерина, перемешать, чтобы приостановить клетки, и распределить на 2-3 криопробирок для замораживания при температуре -80 ° С.

4. Оценка Выполнение AFEX CSH толерантного производных По сравнению с Родителя

1. Тестирование изолятов в простых 6% глюкан AFEX CSH Batch культур.
   1. Передача клетки от 48 ч пластин прожилками от запасов глицерина до рН 7 фосфатный буфер калия (0,4 мм) с получением суспензии клеток с ₆₂₀ = 10. Используйте 1 мклкаждая подвеска для инокуляции каждого из четырех лунок 50 мкл 3% глюкан гидролизата первоначального ₆₂₀ = 0,2. Инкубируйте микропланшеты 24 ч, как и в шаге 2.3. Подготовьте 3% глюкан Afex CSH при рН 5 путем разбавления 12% глюкан Afex CSH 1: 3 стерильной водой.
   2. Передача двух 24 часа в сутки стрипы для инокуляции 25 мл Предкультуры с рН 5 12% глюкан AFEX CSH, используемые при 50% от полной силы. Выдержите Предкультуры в 50 мл колбах с кремнием губки затворов в течение 24 ч при 25 ° С, ~ 150 оборотов в минуту (1 "орбита) Подготовьте вполсилы 12% глюкан AFEX CSH путем разбавления гидролизате 1: 1. Стерильной водой.
   3. Используйте вполсилы гидролизата Предкультуры для инокуляции аналогичные 25 мл культуры роста к исходному A ₆₂₀ = 0,1. Инкубируйте культур роста, как указано выше (4.1.2) и образец в день (0,2 мл). Монитор скопления биомассы (A ₆₂₀₎ и концентрации сахаров и продуктов ферментации (ВЭЖХ).
2. В качестве альтернативы, repitch (т.е., урожай и гEuSe) популяции 6% глюкана AFEX CSH выращенных дрожжей для тестирования в 8% глюкана гидролизата периодических культурах, как описано ранее. ¹⁸
3. В качестве альтернативы, дополнительное испытание популяции repitched 6% глюкана CSH культур Afex путем кормления с 12% глюкана гидролизата, как было описано ранее. ¹⁸
4. Тест diauxic отставание изолятов в пакетном культурах ODM со смешанными сахара.
   1. Привить Предкультуры 75 мл ODM с 150 г / л ксилозы в 125 мл колбы с силиконовой губки закрытия путем переноса петли из YM глицерина прожилками. Выдержите 24 ч, как и в шаге 2.1.
   2. Используйте Предкультуры для инокуляции аналогичные 75 мл тест-культур с ODM, содержащий 75 г / л глюкозы и 75 г / л ксилозы при рН 6,5. Колбах при 25 & deg; С, 150 оборотов в минуту. Образец ежедневно.
   3. В качестве альтернативы, проверить влияние 0-15 г / л уксусной кислоты на diauxy в процессе ферментации глюкозы и ксилозы с использованием аналогичного протокола, за исключением того, исходный уровень рН устанавливается на уровне 6,0 ± 0,2 в тест-культур для поддержания рН 6-7 дюкольцо потребление уксусной кислоты, как описано ранее. ¹⁸

5. Применение непрерывной культуры выбрать для Ethanol-вызов Ксилоза утилизации

1. Подготовка ODM в качестве непрерывной подачи культуральной среды 60-100 г / л ксилозы, 20-50 г / л этанола при рН 6,3 ± 0,2. Выбор комбинации ксилозы и этанола , чтобы имитировать частичную ферментацию 150 г / л ксилозы, предполагая , потенциальный выход ~ 0,5 г этанола / г ксилозы, и для размещения потенциал 50-70 г / л этанола , чтобы иметь место. ⁸
2. Для приготовления непрерывной культуре посевного материала , передача представителя AFEX CSH-толерантный колонии (аналогично Colony 5 в примере, на рисунке 1) с помощью петли из YM пластины 48 ч до 75 мл этанола , свободных от ODM (100 г / л ксилозы, в данном случае) в 125 мл колбах. Инкубируют при 25 ° С, 150 оборотов в минуту (1 "орбиты) в течение 24 ч. Выбор концентрации ODM ксилозы предкультурой совпадающее исходной непрерывной культуры холдинг объема.
3. Инокуляции непрерывной культуры , держащей объем ODM при рН 6,3 ± 0,2 , имеющий 100 г / л ксилозы + 20 г / л этанола с ~ 5-10 мл предкультуральной концентрат AFEX CSH-толерантного изолята (аналогично Colony 5, на фиг.1 ) , чтобы получить 100 мл при начальной ₆₂₀ ~ 0,5. Поддержание культуры проведение объема (V _R), при 25 ° С в 100 мл с рубашкой , вращающуюся колбу при перемешивании со скоростью 200 оборотов в минуту и снабжен оборудованием стерилизуемым рН - электродом, регулятор рН и температуры контролируемой водяной бане , циркулирующей.
4. Первоначально, так как рост клеток будет медленным из-за воздействия этанола, установить питательной среды для дозирования с использованием рН-активируемые насос. Установите насос для питания рН-6,3 ODM с 100 г / л ксилозы и 50 г / л этанола при ферментации культуры падает рН до 5,4, тем самым останавливая дальнейшее снижение рН. Поддержание объема в 100 мл с вытекающего насос непрерывно скользя поверхность культуры. Следовательно, концентрация этанола повышается при продолжении обмена веществ и питания.
5. Измерить сточные воды и берут образцы (1-2 мл) из непрерывных культур каждый 48-72 ч для анализа жизнеспособных концентрации клеток, продуктов и субстратов, как описано ранее. ¹⁸ , чтобы найти жизнеспособное концентрации клеток, делают серийные разведения 1:10 образцов в буфер (смотрите раздел 4.1.1) и распространение пластины разведения на YM агар (см 1.2.1). На основе сбора сточных вод скоростей (Q), вычислить степень разбавления (D) (Q / V _R), а также , в примере S. stipitis, она колебалась от 0 до 0,01 ч ^-1.
6. Сохранить запасы глицерина регулярно путем выделения из жизнеспособности пластин буферизованных разбавлений образца формирования 30-100 колоний, представляющих наиболее распространенные устойчивые колонистов в то время в обогащении. Flood пластины с ~ 5 мл 10% -ного глицерина, чтобы обеспечить получение дубликатов криопробирок. Для поддержания или передышки, остановить непрерывную культуру и перезапустить при необходимости, используя самую последнюю (устойчив) глицерине (ов).
7. Для повторного запуска, Штриховатост в глицерине (ы) наиболееУстойчивые популяции Ю.М. агар и передавать 24-48 HR клетки с помощью петли для предварительной культуры без этанола ODM для инкубации, как указано выше. Инокуляции 100 мл , удерживающие объем ODM первоначального ₆₂₀ 0.5 с использованием концентрата из предварительно культивируют дрожжей, и позволяют выращивать культуру порционно к стационарной фазе , прежде чем поток подачи среды перезапущен.
8. Если культуры могут устойчиво расти при> 0,01 ч ^-1 на ксилозы в присутствии> 25 г / л этанола, начать непрерывную подачу культуры (ODM + 60 г / л ксилозы + этанол в интервале от 30 до 50 г / л) при низкой Степень разбавления ~ 0,01 ч ^-1 до 100 мл , занимающих объем (первоначально ODM + 60 г / л ксилозы + 20 г / л этанола). В течение долгого времени, повышают этанол в подаваемом в направлении 50 г / л. Захват передовых популяций в запасах глицерина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание низкой скорости разбавления позволяет сформировать достаточно высокой концентрации клеток, чтобы снизить доступность кислорода и поддержки брожения.
9. Необязательно применять ультрафиолетовое (УФ) irradiatиона ежемесячно запаса глицерина популяций, используемых для reinoculate непрерывных культур.
   1. Ресуспендируют колонии из запаса глицерина прожилок в 10 мл ODM (как в предварительных культивирований) с 60 г / л ксилозы, а также объединить все запасы в одной колбе. Стерильном Нанести Отстоявшийся клеточную суспензию при ~ 5 × 10 ⁸ жизнеспособных клеток / мл , чтобы только покрыть днища 4-5 чашки Петри с 6 мл / пластины. Для получения 6 мл покрытия стандартного одноразового использования чашку Петри, обойтись 15 мл, чтобы преодолеть поверхностное натяжение, а затем удалить 9 мл.
   2. Expose каждую открытую культуру пластину УФ от источника света в кабинете биологической безопасности. Отрегулируйте время воздействия УФ-излучения или расстояния, чтобы получить желаемую скорость убийств> 90%. Здесь, выставить в течение 45 мин при температуре около 56 см от источника.
   3. Развести пластины клеточные суспензии до и после облучения. Скорость убийств Оценка на основе колониеобразующих единиц. Для S. stipitis пример, скорость убийств составляет ~ 97%.
   4. Передача УФ-воздействию культур (24-30 мл) к фольге-соуERed колбу на 50 мл, и инкубируют при 25 ° С и 150 оборотах в минуту в течение 24 часов , чтобы позволить небольшой процент жизнеспособных клеток заселить до ~ 1 × 10 ⁸ жизнеспособных S. stipitis клеток / мл. Предотвращая фото реактивации, крышка из фольги сохраняет мутации в то время как культуры инкубируют.
   5. Используйте заселен мутагенеза культуру для инокуляции непрерывных культур до ~ 1 × 10 ⁷ жизнеспособных клеток / мл. Перезапустите этанол обогащенный ODM + 60 г / л корма ксилозы среды для продолжения процесса выбора.

6. Оценка глицерине групп населения и выявления лиц, с улучшенной Ксилоза ферментация в присутствии этанола

1. Streak выбран глицерине культуры Ю.М. агар в качестве первого шага на экране для лучшего роста и ферментации ксилозы в присутствии этанола.
2. Передача каждого выделяющегося население быть подвергнуты скринингу с агаровых прожилок 75 мл в предварительных культивирований ODM с 150 г / л глюкозы, и инкубируют в 125 мл колбы 96ч до применения в качестве посевного материала для тест-культур. Крупные глюкоза выращенных популяции потребует индукцию ферментов утилизации ксилозы.
   1. Для тестирования индукции, собирать каждую культуру, приостановить клетки до 30 мл, парафировать ₆₂₀ 40 в ODM + 60 г / л ксилозы + 30-45 г / л этанола, и инкубировали при 25 ° С, 150 оборотов в минуту (1 "орбита) в 50 мл колбы с кремниевыми затворами губки. Нарисуйте образцы дважды в день для мониторинга поглощения ксилозы методом ВЭЖХ.
3. В качестве альтернативы, как описано в разделе Slininger и др., ¹⁸ с целью оценки роста на ксилозы в присутствии этанола, готовят Предкультуры каждого эволюционировала населения путем переноса петли до 75 мл ODM с 150 г / л ксилозы в 125 мл колбах, и инкубировать 96 ч при 25 ° с, 150 оборотов в минуту (1 "орбиты). Инокулируйте тест - культур с низкой начальной ₆₂₀ 0.1 в 25 мл ОДМ + 60 г / л ксилозы + 30-45 г / л этанола в 125 мл колбах. Инкубируйте колбы при 25 ° C, 300 оборотов в минуту, 1 "орбиты и образца.

7. Изолировать одноклеточные Колонии, которые используют ксилозы в PSGHL Когда Этанол присутствует

1. На основании результатов шага 6, выберите глицерине популяции, показывающие превосходную способность к росту на брожение и ксилозы в присутствии этанола. Используйте их для стрик пластин. Полоса пластины используются для подготовки плотных, буферные суспензий ячейки ₆₂₀ = 5. Затем клеточные суспензии используют для инокуляции Предкультуры в 96-луночных глубоких до ₆₂₀ = 0,5. Инокулируйте 1 мл Предкультуры на PSGHL смешанный 1: 1 с ОДМ + 50 г / л ксилозы (без этанола). Выдержите Предкультуры в 96-луночные, глубокие луночные планшеты с вентилируемым низкой испаряемости охватывает в течение 48 ч при 25 ° С, 400 оборотов в минуту, 1 "орбиты. Отдельные различных запаса глицерина населения пустые лунки.
2. Используя каждый предкультуральной, прививают шестнадцать 1 мл реплицировать культуры первоначального ₆₂₀ ~ 0,5 в 1: 1 PSGHL: ODM + 50 г / л ксилозы с 20, 30 или 40 г / л этанола обогащать толерантных колонистов. Выдержите обогащения cultuрес аналогично предварительных культивирований.
3. Для каждого отдельного глицерина запаса, урожай культуры скважин с самой высокой концентрацией этанола позволяет использовать роста и ксилозы. Пластинчатые каждую линию клеток к YM агар для получения распространенных единичных колоний для сохранения в глицерине. Возьмите десять колоний на линии и полосы каждой ячейки к агаром YM для подготовки запаса глицерина.

8. далее обогащать Robust Evolved Штаммы во время последовательной передачи на PSGHL, как и для AFEX CSH

1. Подготовка предварительных культур NRRL Y-7124 (родителю), AFEX CSH толерантных эволюционировали изолируют, и непрерывной культуры эволюционировали населения с повышенной способностью использовать ксилозу в присутствии этанола. Инокулируйте 75 мл ОДМ + 150 г / л ксилозы по петле из глицерине прожилками, как описано выше (этап 2.1) для процесса гидролизат адаптации AFEX CSH.
2. Развести PSGHL с водой, чтобы обеспечить ряд возрастающих концентраций. Готовят 96-луночного микроплиты для каждой из трех клеточных линий, используя каждыйPSGHL разбавления для заполнения 8 лунок с 50 мкл. Используйте предкультуральной для инокуляции 50 мкл каждого микро-культуры серии разведения парафировать ₆₂₀ ~ 0,1-0,5.
   1. Продолжить развитие дрожжей в увеличении преимущества PSGHL с использованием той же процедуры , как AFEX CSH гидролизата адаптации подробно описано выше (стадия 2) до тех пор , культуры не могут расти в полной гидролизата Предел прочности при стабильном 14-й среднее соотношение ΔA ₆₂₀ на Δtime как последовательные переводы продолжались еще четыре месяца.

9. Изолировать Колонии Одноклеточные Использование PSGHL Градиенты с или без Этанол Вызова

1. Получить одноклеточного изолирует непосредственно от полной крепости PSGHL конечных адаптации пластин путем разбавления покрытия на YM агар. Возьмите десять больших колоний для каждой из трех клеточных линий и бар серию до YM пластин для подготовки запасов глицерина, как описано выше (шаг 3.2).
2. При желании, изучить более ранние моменты времени вПроцесс эволюции путем выделения из хранимых запасов глицерина трех клеточных линий.
   1. Инокуляции предкультурой для каждой клеточной линии путем петли из глицерине прожилок и инкубировать 24 ч по 30 мл ODM + 50 г / л ксилозы (50 мл колб, 25 ° C, 150 оборотов в минуту).
   2. Вызов клетки из предварительных культивирований к росту в гидролизата путем инокуляции 50 мкл 50% PSGHL в стрипы к исходному A ₆₂₀ ~ 0,2 и инкубирования статически 48 часов.
   3. Spread 0,1 мл каждой культуры на обогащенной PSGHL градиентных чашках с агаром в пределах гидролизат прочности от 0 до 50% (доставляющие ~ 300-400 жизнеспособных клеток на пластину), и выбрать 10 отдельных колоний на одну клеточную линию от максимально возможной площади гидролизат концентрации градиента . ²¹ подряд выбрал колонии YM для подготовки запаса глицерина , как в шаге 3.2.
   4. В качестве альтернативы к этапу 9.2.3, вместо инокуляции агара градиента, прививают лунки 96-луночных микро-пластин первоначального ₆₂₀ ~ 0,2, WheRe скважины предназначены для размещения ряда гидролизатов концентраций от 50 до 100% -ного этанола и от 10 до 40 г / л. В этом случае, разработка микро-пластин 72-96 ч и иным образом, как на стадии 2.3. Изолировать десять одиночных колоний из лунок самых сложных комбинаций гидролизат-этанола, свидетельствующие о росте с помощью разбавления покрытия, а также подготовить запасы глицерина, как в шаге 3.2.

10. В первичном скрининге, ликвидировать Inferior изолирует путем сравнения и ранжирования выступлений на PSGHL на двух питательными условиями

1. Нанести высокую пропускную способность глубоко луночного планшета экран производительности PSGHL на экран пять наборов тридцати изолирует наряду с NRRL Y-7124 родителем и AFEX CSH-толерантного изолята (аналог колонии 5 эволюции примера Рисунок 1) в качестве средства управления , чтобы выбрать шесть лучших штаммов (20%) из каждого набора, чтобы перейти на второй ступени отбора (этап 12).
2. Проводят экран в глубоких луночных заполненных 1 мл на лунку и покрыты Wiй крышки из нержавеющей стали с черным силиконовым низким испарительных уплотнений. Крепление всех видов пластин на борту инкубатор / шейкере и работают при температуре 25 ° C и 400 оборотов в минуту (1 "шейкер орбиты). Конструированию все глубоко луночный планшет заполнения шаблонов, чтобы обеспечить разделение различных изолятов с помощью открытых скважин.
3. Для начала культивации выбрать шарик клеток из глицерина прожилками, приготовленных из 30 культур, полученные, как описано выше (в шагах 3, 7 и 9), чтобы дублировать скважин ОДМ + 50 г / л ксилозы и инкубировать 48 ч.
4. В качестве среды для вызова preculturing изоляты, готовят 50% PSGHL путем смешивания PSGHL 1: 1 с ODM + 10 г / л глюкозы + 50 г / л ксилозы. Для скрининга 30 изолятов и два контрольных штаммов, 2 пластины с 2-х скважин в каждой из 16 изолятов заполнены, оставляя пустые лунки между различными изолятов.
5. Для CHALLENGE культур, передачи, объемом 50 мкл ODM предварительных культур (А ₆₂₀ ~ 10) к каждому из двух 50% PSGHL вызов культуральных лунок для каждого из изолятов и контролирует , чтобы получить INITIАль ₆₂₀ ~ 0,5 и инкубировать 72 ч.
6. Используйте два тестовых сред разной питательной богатства для скрининга изолятов: 60% PSGHL + ODM питательных веществ; и 75% PSGHL + ODM + YM питательные вещества. Добавить ODM питательные вещества (за исключением сахара) в половине силы в качестве стандарта для ODM использования с 50 г / л сахара (шаг 1.3). Как назначенный, добавьте YM питательных веществ (кроме сахара) в половину стандартной прочности 3 г / л дрожжевого экстракта, 3 г / л экстракта солода, 5 г / л пептона.
7. Привить тест - культур путем переноса 50 мкл 72 ч 50% PSGHL бросить вызов предварительных культур для инокуляции 1000 мкл для первоначального ₆₂₀ ~ 0,5 в пяти глубоких скважин для каждого из двух тестовых сред.
8. Образец каждого изолята ежедневно. Пипетировать содержимое хорошо микроцентрифуге трубки и центрифуге (5533 XG, 15 мин), чтобы получить надосадочную жидкость для этанола, глюкозы и ксилозы анализов с высокой пропускной способностью. Мера биомассы в качестве ₆₂₀ в 96-луночных микро- планшетах (200 мкл / лунку) с помощью спектрофотометра.
9. В каждый набор 30olates испытания (5 комплектов для S. stipitis NRRL Y-7124 развивались штаммы), рассчитать относительные показатели эффективности (RPI) , как описано в пункте 11 ниже , и использовать для ранжирования каждого штамма на основе выхода этанола (максимум этанола накопленной за первоначального сахара входит в комплект) и скорость поглощения ксилозы (концентрация ксилозы, потребленной на начальной 96 часов) на обоих испытательных средах.

11. Ранг изолятов первичного скрининга PSGHL Использование индекса относительной производительности (RPI)

1. После первичного скрининга, вычислить безразмерные относительные показатели эффективности (RPI) для того , чтобы ранжировать 30 изолятов в каждом из пяти различных экспериментов на экран изолирует на PSGHL с двух различных композиций питательных на эксперимент, то есть 60% PSGHL и 75% PSGHL.
2. Вычислить статистический параметр F для использования в рейтинге изолята производительности в группе изолятов в данном эксперименте: F = (XX _ср) / с. Здесь X является параметр рабочей характеристики, такие как выход (Y)или скорости (R), наблюдается для каждого изолята, в то время как X и _{СРЕДНЕМ} s являются среднее и стандартное отклонение, соответственно, Х наблюдается для всех изолятов в пределах данного эксперимента. Для нормальных распределений, -2
3. Для каждого изолята в эксперименте, рассчитать относительную производительность на основе скорости, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, а так же рассчитать относительную эффективность на основе доходности, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 , Значение RPI находится в пределах от 0 до ~ 100 процентили (низшего к высшему). Затем вычислить RPI средние значения для каждого изолята в пределах данного гидролизата эксперимента следующим образом : RPI = _ср (RPI _Y + RPI _R) / 2, где выход и скорость взносов имеют равный вес в данном приложении.
   Следует отметить, что в целом, выход и скорости параметры могут быть взвешены, если считать неравное по значимости.
4. Рассчитайте RPI в _целом по п типов гидролизатов тестируемых: RPI в _целом = Σ _{= 1, п} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _я / п. Рассмотрим каждый изолируют в экспериментальном наборе 30 изолятов и 2 управления. Во время первичного рейтинге ~ 150 одиночной колонии изолятов адаптирована к ксилозу богатой PSGHL, ИРЦ в _целом рассчитывается по ставкам и доходности в рамках двух составов PSGHL , применяемых на экране, то есть, 60% PSGHL и 75% PSGHL, где п = 2.
5. На основе RPI в _целом в пределах каждого эксперимента, выбрать верхний процент изолятов , чтобы перейти к вторичному экрану. В этом примере верхний 20% штаммов выбираются так, чтобы проходить через (то есть 30 из 150 проверенных).

12. В дополнительном экране, сравнение лучших исполнителей основного экрана на несколько полных гидролизатов (> 100 г / л Смешанные сахара), чтобы Reveal Высочайшие функционирующая Прочные Штаммы

1. Сравнить топ исполнителей PSGHL на 6% глюкан Afex CSH и SGH исправленный с двумя уровнями азота, SGH-N1 и SGH-N2 (составs , как в таблице 1) для окончательного ранжирования. Сите 30 изолятов , которые были главными исполнителями в первичной глубокой луночного планшета экран PSGHL (шаги 10 и 11) и два элемента управления (родительского штамма NRRL Y-7124 и AFEX CSH-толерантного изолят ( по аналогии с Colony 5, рис 1 пример ).
2. Начало посадки культурных, выбирая бусинку клеток из глицерина прожилками продублировать глубоких скважин 1 мл ОДМ + 50 г / л ксилозы, как до, так и инкубировать 48 ч в глубокой системе луночного планшета (шаг 10,2). Затем перенесите 50 мкл ODM предварительных культивирований до 50% SGH бросить вызов культур, и инкубировать в глубокой системе луночного планшета в течение 72 ч , чтобы получить ₆₂₀ в ~ 10). Приготовьте 50% SGH путем смешивания SGH 1: 1 с сахарина ODM + 50 г / л ксилозы (рН 5,6).
3. Для каждого из изолятов, инокуляции 16 мл аликвоты SGH-N1 или N2 SGH-с клеточного осадка (15 мин, 2711 XG) из трех лунках вызов культуры , чтобы получить первоначальный тест - культуры А ₆₂₀ ~ 2,0. Выдержите тест-культур на 25 & #176;. С, 180 оборотов в минуту (1 "орбита) в 25 мл колбы с оболочкой из силиконовой губки закрытий Примеры колб ежедневно и анализируют на экране PSGHL.
4. Кроме того, экран изолирует, как в шагах 12.2 и 12.3, но на этот раз заменой SGH-N1 и SGH-N2 с 6% глюкан AFEX CSH при рН 5,2 для использования при получении вызов культуральной среды и испытания культуральной среды. Для 50% -ного условного предела CHALLENGE культур, используют 6% Afex CSH, разведенным 1: 1 с водой, так как оно представляет собой азот достаточно, без поправок.
5. Повторите шаги 12.1-12.4, чтобы дублировать результаты.

13. Ранг по исполнениям изолятов на вторичном экране с помощью RPI в _целом для Голосовать за использования несколько полных гидролизатов

1. Расчет относительных показателей эффективности (RPI) для того, чтобы ранжировать каждый из верхних 20% изолятов (~ 30 из 150) от основного экрана, которые были испытаны на вторичном экране на фермента осахаривают гидролизата композиций различной питательной богатства.
2. оценка каждогоизолят испытания на вторичном экране на основе скорости поглощения ксилозы и выхода этанола осуществляется на трех ферментных-осахаривают предварительно обработанные гидролизатов композиций в дубликате, включая AFEX CSH (I = 1 и 2), SGH-N1 (I = 3 и 4) и SGH -N2 (I = 5 и 6).
3. Вычислить RPI в _целом для каждого изолята, и применить этот ранжирования параметр , чтобы дополнительно веять список высших изолятов: RPI в _целом = Σ _{= 1, п} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _я / п, где п = 6 ,
   Примечание: Продемонстрировать кинетика превосходящими изолятов в SGH-N2 гидролизатов в колбах культуры, следуя процедурам , описанным в Slininger ¹⁸ и др.

Результаты

С. stipitis выработалось с использованием комбинаций трех культур отбора, которые включали Afex CSH, PSGHL и этанол-вызов ксилозы офсетные непрерывную культуру. На рисунке 1 показана принципиальная схема экспериментов эволюции , выполненных вместе с изолятов найти либо выполнить н...

Обсуждение

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха процесса эволюции. Во-первых, она является ключом, чтобы выбрать соответствующие давления отбора, чтобы вести эволюцию населения в сторону желаемых фенотипов, которые необходимы для успешного применения. Следующие селективные напря?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com