قياس النشاط الأنزيمي اللاكتاز في مختبر التدريس

Summary

النشاط الأنزيمي من اللاكتاز الضروري لتجهيز تقويضي اللاكتوز ديساكهارايد. هنا، هو جزيئي نشاط اللاكتاز الموجودة في المكملات الغذائية مقايسة اللونية باستخدام. وهذا يوفر للطلاب مع منصة تجريبية لفهم نشاط اللاكتاز وإنزيم حركية.

Abstract

فهم كيفية عمل الإنزيمات، وتتصل هذه الأمثلة على الحياة الحقيقية، حاسمة بالنسبة لمجموعة واسعة من درجة البكالوريوس في العلوم البيولوجية والطبية الحيوية. هذا من السهل متابعة بروتوكول تم تطويره لطلاب الصيدلة الجامعية السنة الأولى ويوفر مقدمة المبتدئين لأنزيم ردود الفعل والإجراءات التحليلية لتحليل الإنزيم. الإنزيم للاختيار هو اللاكتاز، كما يمثل هذا مثال إنزيم المتاحة تجارياً ذات صلة بالممارسات البشرية المرض/الصيدلانية. اللاكتاز يستخرج من أقراص مكملة للوجبات الغذائية، وتقييم باستخدام مقايسة اللونية استناداً إلى التحلل من الركيزة الاصطناعية اللاكتاز (اورثو-نيتروفينول-د-بيتا-جالاكتوبيرانوسيدي، أونبج). إطلاق سراح اورثو-نيتروفينول عقب انشقاق هيدروليكي من ONPG اللاكتاز يقاس بإجراء تغيير في امتصاص في 420 نانومتر، وتأثير درجة الحرارة على رد فعل الانزيمية يتم تقييمه بالقيام برد فعل على الجليد، في درجة حرارة الغرفة وفي 37 درجة مئوية. التحليل الأكثر تقدما يمكن تنفيذها باستخدام هذا البروتوكول بتقييم نشاط إنزيم تحت ظروف مختلفة واستخدام كواشف مختلفة.

Introduction

الإنزيمات هي نوع متخصصة من البروتينات التي تعمل كمحفزات بيولوجية للتفاعلات الكيميائية في معيشة الكائنات الحية¹. عمل الإنزيمات أمر بالغ الأهمية للحياة، وتوفير الطاقة، والتخلص من النفايات والسماح للكائنات الحية العمل. عليه، فهم الإنزيمات ذات أهمية حاسمة لفهم كامل للحياة. هذه المعرفة أمر أساسي لمجموعة متنوعة من برامج درجة مستوى الجامعة، بدءاً من العلوم الطبية لعلم الأحياء. بينما يمكن أن توفر خلفية مفصلة بدءاً من مبادئ الحفز للنماذج النظرية لنشاط إنزيم للطلاب باستخدام المحاضرات ومواد للقراءة، خصائص الإنزيم ردود الفعل هي أفضل استوعب أيدي على الخبرة العملية من كما سبق أثبت الإنزيمات في الإجراء². يوفر هذا البروتوكول بسيطة اتباع نموذج تجريبي لقياس نشاط الإنزيم تحت ظروف المختبر، استخدام اللاكتاز كمثال لأنزيم مع نشاط ذات صلة بالتغذية البشرية والصحة.

اللاكتاز glycosidic هيدرولاز (المفوضية الأوروبية 3.2.1.23/26) إنزيم الأهمية الغذائية للثدييات³. نشاط اللاكتاز هو المحافظة عليها درجة عالية من خلال تطور، ومستمد من عائلة الإنزيمات بيتا-جالاكتوسيداسي-عائلة الحالية من الإشريكيّة القولونية عن طريق الإنسان العاقل (الشكل 1، PDB 1JZ8)⁴. الأهمية الحاسمة اللاكتاز في وضع تغذية بشرية تنبع من دورها في السماح بانهيار اللاكتوز إلى مكونات أحادي التأسيسية، التي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لتوليد الطاقة في الجسم. اللاكتاز يحفز التحلل المائي للسندات glycosidic في اللاكتوز ديساكهارايد، الإفراج عن اللبن والسكر (الشكل 2)⁵. ثم يتم استخدام هذه السكريات الأحادية أساسا لتوليد الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق دورة حمض الستريك والفسفره⁶. خلال الوليد والرضع التنمية، أعرب اللاكتاز هو عاليا في الجهاز الهضمي البشري، تحطيم اللاكتوز الواردة من حليب الثدي من اللاكتوز الذي هو عنصر أساسي من الكربوهيدرات، وواحدا من المصادر الرئيسية للتغذية خلال السنوات الأولى ⁷-هو إبراز أهمية طبية اللاكتاز بعوز اللاكتاز الخلقي (CLD)، حالة نادرة في جسمية مقهورة الناجم عن الطفرات في جين اللاكتاز (LCT) الترميز ل إنزيم اللاكتاز⁸. معرض حديثي مع مركز نشاط اللاكتاز القليل جداً، وبالتالي لا يمكن أن يتم تغذيتها على لبن الأم، أي نوع آخر من الحليب، أو الصيغة التي تحتوي على اللاكتوز.

خلال مرحلة الطفولة، ينخفض عادة التعبير اللاكتاز؛ ومع ذلك، يختلف هذا الحد بعد الفطام جغرافيا، مع حوالي 35 في المائة من البالغين في جميع أنحاء العالم تواصل التعبير عن إنزيم⁹. التعبير المطرد من اللاكتاز، المعروف باستمرار اللاكتاز، يسمح للأفراد أن يواصل هضم الحليب ومنتجات الألبان من مجموعة من المصادر. على العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي فقدان التعبير اللاكتاز إلى اللاكتوز، المعروف أيضا بالغ من نوع هيبولاكتاسيا (ATH)، الناتجة عن عدم قدرة على كسر اللاكتوز في الأمعاء. اته تتميز ببنية أعلى من اللاكتوز في القولون بعد تناول المنتجات الغذائية التي تحتوي على اللاكتوز. في القولون، هو المخمرة اللاكتوز المتراكمة بالقناة الهضمية الحيوانات الميكروبية، إطلاق الغازات، بما في ذلك الهيدروجين والميثان وثاني أكسيد الكربون. تشجيع إنتاج هذه الغازات في الأفراد المصابين بنقص إنزيم اللاكتاز الإنتفاخ البطن وزيادة انتفاخ البطن والألم، والغثيان و borborygmi (المعدة الهادر)⁷. زيادة مستويات اللاكتوز في الجهاز الهضمي يمكن أن يؤدي أيضا إلى البراز فضفاضة.

يتم التحكم في التعبير الجيني LCT عن طريق مجمع الأشكال المتعددة الموجودة في introns الجينات MCM6 القريبة التضمين. حمل الأفراد مع التعبير المطرد من اللاكتاز مجمع الأشكال المتعددة التي تعمل معززات القاصي قوية للتعبير الجيني LCT ، وبالتالي التعويض العادي إلى أسفل لائحة نسخ LCT أثناء الفطام، ونتيجة لذلك الحفاظ على التعبير اللاكتاز في مرحلة البلوغ³. قد اقترح محسن مجمع الأشكال المتعددة اختير إيجابيا بعد تدجين الماشية والجمال في الشرق الأوسط منذ ما يزيد على خمسة آلاف سنة^9،10.

يمكن إدارة الأعراض الناتجة عن البعث بتقليل كمية اللاكتوز، على سبيل المثال عن طريق إزالة منتجات الألبان من النظام الغذائي. وثمة نهج بديل للبعث، والنهج المفضل لمركز التنمية المحلية، هو استخدام مكملات اللاكتاز، متاحة على نطاق واسع من الصيدليات. وتوفر هذه الملاحق اللاكتاز معزولة من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك الخميرة والبكتيريا، في شكل سائل أو القائم على حبوب منع الحمل التي يمكن اتخاذها مع أو إضافتها إلى اللاكتوز التي تحتوي على الأغذية. وسوف يتحلل الملحق نسبة من اللاكتوز الموجودة في الطعام إلى منتجات السكر واللبن، ومن ثم تسمح امتصاص ومنع تراكم الركيزة اللاكتوز عسر الهضم في الأمعاء.

استناداً إلى استخدام مكملات اللاكتاز المعونة غذائية، قمنا بتطوير تجربة مختبر علم الإنزيمات بسيطة مناسبة لطلاب السنة الأولى الطب الحيوي والعلوم أو الصيدلة. هذه التجربة المعملية يستفيد من مكملات اللاكتاز المتاحة تجارياً، واستخدامات اورثو-نيتروفينول-بيتا-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) توفير نقطة نهاية اللونية لقياس الانقسام وسندات glycosidic من اللاكتاز ( الشكل 3)¹¹. أونبج الأعمال الركيزة اصطناعية اللاكتاز، التي عندما تتعرض للتحلل من هذا الإنزيم ينتج د-اللبن واورثو-نيتروفينول. المنتج الأخير بلون أصفر، امتصاص الضوء عند طول موجي 420 نانومتر. بالتحديد الكمي لأي تغييرات في امتصاص 420 نانومتر بعد تعرض أونبج إلى اللاكتاز، فمن الممكن لتقدير نشاط هذا الإنزيم. ويقدم هذه التجربة المعملية مظاهرة للنشاط الأنزيمي هيدرولاز. بناء في replicates إضافية والقيام بفحوصات في ظروف مختلفة، فمن الممكن لإدراج تحليلات أكثر تطورا من حركية إنزيم، توفير مثال قيمة الحياة الحقيقية للإنزيمات في العمل ذات الصلة بصحة الإنسان.

Protocol

ملاحظة: وضعت البروتوكول أدناه التي ستعقد على مدى ساعتين (بما في ذلك الانتهاء من أوراق العمل في الفئة) في مختبر لتدريس بنيت لهذا الغرض. الخطوات التجريبية التي كانت عن عمد وضع معا لاستبعاد تحليل أكثر تفصيلاً لحركية إنزيم (نفذت في سياق هذا بالطبع استخدام نموذج البيانات)؛ ومع ذلك-كما لوحظ في المناقشة – ينص البروتوكول على قالب تحليلات متقدمة أكثر اعتماداً على مستوى تحقيق الطالب والوقت والتسهيلات.

سلامة: هذه العملية ينبغي أن يتم وفقا للقواعد لحسن الكيميائية المختبرية الممارسة (جكلب) – ينبغي أن ترتديه معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك معطف المختبر يثبت والمتاح القفازات ونظارات السلامة في جميع الأوقات في المختبر .

1-استخراج الإنزيم

1. سحق قرص اللاكتاز واحد، تحتوي على 200 ملغ إنزيم، إلى مسحوق حتى استخدام مدافع الهاون والمدقة.
2. ضع مسحوق الناتجة في أنبوب 15 مل المسمى "تعليق" وريسوسبيند في 10 مل من 100 ملم الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
3. دوامة لمدة 1 دقيقة لتعظيم استخراج الإنزيم.
4. نقل 1 مل من التعليق إلى 1.5 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 10,000 س ز للرواسب الجسيمات الصلبة.
5. نقل 500 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب نظيف 1.5 مل المسمى "استخراج اللاكتاز".

2-مراقبة رد فعل اللونية

1. ميليلتر مكان 390 ملم 100 برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل المسمى "برد الفعل".
2. إضافة 100 ميليلتر لحل أونبج 5 مم ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج.
   تنبيه: هذه العملية يستخدم اورثو-نيتروفينول-بيتا-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) كبديل اللاكتوز. منذ أونبج مركب الفينولية، فإنه يجب التعامل مع توخي الحذر. في حالة ملامسة الجلد أونبج، يجب غسلها الجلد فورا. يجب أن تمحى أي انسكابات فورا مع مناشف ورقية التخلص منها في مجرى النفايات المناسبة.
3. إضافة 10 ميليلتر لاستخراج إلى رد الفعل بالانبوب ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج.
4. مراقبة رد فعل الخليط لمدة 5 دقائق وملاحظة أية تغييرات اللونية للحل.

3-قياس نشاط الإنزيم

1. إعداد أنبوبين 1.5 مل: واحدة تسمى رد فعل "B"، المسمى "عنصر تحكم واحد".
2. إضافة ميليلتر 390 ملم 100 برنامج تلفزيوني لرد فعل ب أنبوب، 400 ميليلتر من 100 ملم برنامج تلفزيوني لأنبوب التحكم ثم قم بإضافة 100 ميليلتر من 5 مم أونبج لكل أنبوبة.
3. خلط المحتويات من فورتيكسينج.
4. إضافة 10 ميليلتر لاستخراج اللاكتاز إلى الأنبوب ب رد فعل، ومزيج من فورتيكسينج والسماح برد فعل على المضي قدما لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. بمجرد انقضاء المدة 1 دقيقة إضافة 500 ميليلتر من كربونات الصوديوم 1 م لكل الأنابيب لكبح إنزيم اللاكتاز بزيادة درجة الحموضة، وبالتالي إنهاء رد فعل.
6. نقل 500 ميليلتر من كل أنبوبة في الترعة نظيف جهاز المطياف الضوئي وقياس امتصاص في 420 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي في.
7. ملاحظة امتصاص رد فعل ب وعينات مراقبة ومن ثم طرح قيمة عنصر التحكم من قيمة رد الفعل لاشتقاق التغيير في امتصاص سبب التحلل أونبج حضور نشاط إنزيم.

4-تأثير درجة الحرارة على نشاط الإنزيم

1. إعداد التحكم ثلاثة أنابيب وأنابيب رد فعل ثلاثة كما هو موضح في القسم 3 وتسمية هذه "4 درجات مئوية"، "غرفة Temp"، و "37 درجة مئوية".
2. وبعد إضافة الإنزيم استخراج، احتضان أنبوب واحد على الجليد، وواحدة في درجة حرارة الغرفة، وواحد في 37 درجة مئوية (في حمام مائي ساخن مسبقاً).
3. السماح لردود الفعل على المضي قدما لمدة 1 دقيقة وثم إنهاء رد فعل بإضافة 500 ميليلتر من كربونات الصوديوم 1 م لكل أنبوبة.
4. قياس امتصاص في 420 نانومتر لكل أنبوبة كما هو موضح في القسم 3. تسجيل القيم، طرح قيمة عنصر التحكم من قيمة رد الفعل في كل حالة على حدة.

النتائج

ويبين الشكل 4Aنتائج تمثيلية للقسم 2 من البروتوكول. مراقبة رد فعل، في غياب إنزيم اللاكتاز، لا يزال واضحا حين حل رد فعل، تتضمن مقتطفات من قرص اللاكتاز، يتحول إلى اللون الأصفر كما هو تحلل ONPG الإفراج اورثو-نيتروفينول. ويبين الشكل 4 باء الكمي باستخدام وحدات التعسفي من القسم 4 من البروتوكول، وتحليل العينات باستخدام جهاز المطياف الضوئي التالي. إنتاج اورثو-نيتروفينول أدنى عند رد فعل المحتضنة على الجليد، وأعلى عندما يتم الاضطلاع رد فعل على 37 درجة مئوية.

الشكل 1 : كولاي بيتا-جالاكتوسيداسي- (أ) هيكل الكريستال من بيتا-جالاكتوسيداسي من الإشريكيّة القولونية، يبين هيكل النشط تيتراميريك المعقدة. (ب) اللولكتس (يظهر باللون الأحمر) منضمة إلى موقع نشط لبيتا-جالاكتوسيداسي. الصور التي تم إنشاؤها من PDB 1JZ8⁴. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : العمل الأنزيمي من اللاكتاز- التحلل لاكتوز من اللاكتاز لإنتاج اللبن-د-بيتا وبيتا-د-الجلوكوز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : التحلل من اورثو-نيتروفينول- بيتا جالاكتوبيرانوسيدي-د. التحلل المائي أونبج اللاكتاز لإنتاج بيتا-د-اللبن واورثو-نيتروفينول (وصفراء اللون)، مما يتيح تقدير نشاط اللاكتاز بقياس امتصاص في 420 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الشكل 4 : التحلل المائي أونبج. عرض مراقبة ورد فعل أنابيب (A) وبيانات تمثيلية من المادة 4 من البروتوكول سجلت نتائج التحلل ONPG الممثل، على أوراق العمل في الفئة، تظهر امتصاص الخام في وحدات التعسفي في 420 نانومتر، تصحيح للخلفية و في ثلاث درجات حرارة مختلفة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حالة تجريبية	المتغيرات التجريبية
درجة الحرارة	0 درجة مئوية، 10 درجة مئوية، 20 درجة مئوية، 30 درجة مئوية، 50 درجة مئوية
تركيز الركيزة	0 مم، 1 مم، 5 مم، 10 مم أونبج
تثبيط المنافسة	5 مم اللاكتوز ONPG زائد 0 ملم أو 1 ملم، 5 ملم أو 10 ملم
الاعتماد على الوقت	0 s، 15 ق، ق 30، 1 دقيقة، 5 دقائق، 10 دقيقة، 20 دقيقة
تمسخ الحرارة	استخراج اللاكتاز تسخينها إلى 100 درجة مئوية للاعتداء قبل 10 دقيقة

الجدول 1: احتمال تمديد حالة تجريبية. واقترح تجارب موسعة، الاضطلاع بها في ثلاث نسخ، التحقيق في جوانب محددة من اللاكتاز علم الأحياء.

Discussion

على معرفة مفصلة وفهم الإنزيمات، التفاعلات الانزيمية وحركية إنزيم مطلوب لمجموعة واسعة من المواضيع التي تغطي مجالات البيولوجيا والطب الحيوي والصيدلة. يستخدم البروتوكول المذكورة أعلاه اللاكتاز كمثال لأنزيم ذات الصلة بصحة الإنسان لما أبدته من التفاعلات الانزيمية، توفير المهارات الأساسية التي يمكن استخدامها في التجارب المستندة إلى مختبر أكثر تقدما.

قد صمم هذا البروتوكول عمدا أن تكون قوية كالطلاب تجربة مختبر مبللة قليلاً أو لا ممكن، مما يسمح لنتائج التفسير في فترة قصيرة من الزمن. في العام الدراسي 2014/2015 في كلية الصيدلة جامعة ريدينغ، نفذت مجموعة طلاب 144، نظمت مجموعات من 3، التجربة "قياس اللاكتاز"، مع كافة المجموعات قادرة على الكشف عن مستوى معين من النشاط الأنزيمي من الكمبيوتر اللوحي اللاكتاز مقتطفات.

وهناك عدد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولاً، من الضروري أن الاستخراج الأولى كفاءة، والسماح سولوبيليزاتيون كافية إنزيم نشط للتحاليل اللاحقة. في تجربتنا، السنة الأولى الطلاب الجامعيين يمكن تحقيق ذلك باتباع البروتوكول كما هو مبين؛ لكن بعض التوجيهات من المتظاهرين مختبر كان المطلوب في هذه المرحلة. على الرغم من أن يبدو أن نقطة بديهية، عاملاً أساسيا في نجاح هذا البروتوكول هو القدرة على بدقة قياس وحدات التخزين، بشكل صحيح تسمية أنابيب واتبع الإرشادات. بينما يمكن افتراض مستوى معين من الكفاءة للعديد من الطلاب، والرصد الدقيق وطلب واضح للطلاب إلى طلب المساعدة في حالة ما إذا كانوا غير متأكدين من ما يجب فعله التالية توفر احتمال أكبر مقايسة ناجحة.

ويمكن إجراء تقييم الطالب في فئة ورقة العمل (متاحة كمواد تكميلية)، يسأل الطلاب ملاحظة البيانات من التجارب، التعليق على النتائج ووصلة إلى خلفية المعلومات/القراءة من المواد محاضرة، أو أكثر مفصلة، من تقييم الدرجة مع نموذج البيانات المقدمة والسماح للتحاليل الحركية وحاول وتقييمها.

البروتوكول المعروضة هنا مثال بسيط للمقايسة نشاط اللاكتاز تحت الظروف المختبرية التدريس، وهناك فرصة كبيرة لزيادة تعقيد التجربة للسماح بإجراء تحليلات أكثر تقدما. على وجه الخصوص، البروتوكول قدم مدخلاً إلى مفهوم حركية إنزيم، لكنه لا يسمح بتحليل البيانات التجريبية الحركية. على هذا النحو، أننا نوصي بعرض البروتوكول وصف كقالب أولية للطبقات، مع تفاصيل دقيقة تكييفها لتتناسب مع أهداف محددة ومواهب الطالب الفوج القيام بالتجارب. ويمكن أن تشمل الأمثلة من تجارب موسعة: تكرار القياسات في درجات حرارة مختلفة، باستخدام تركيزات مختلفة الركيزة للسماح للتحليل الإحصائي وتحليل الحركية للبيانات (مناسبة لطلاب الكيمياء الحيوية/الكبرى)، بدءاً من عدة أقراص مختلفة والسماح للطلاب لتقييم مختلف نشاط إنزيم في كل (بالإضافة إلى أقراص التحكم، مناسبة لطلاب العلم الشرعي/التخصصات) تقييم تأثير الحرارة تمسخ أو الاضطلاع بالمنافسة التجارب بالإضافة اللاكتوز أو مثبطات اللاكتاز (الجدول 1). بروتوكول مفصل لتحليل الحركية من اللاكتاز قد سبق نشر¹².

قوة هامة لهذا البروتوكول أنه يجمع بين مقدمة أساسية لعلم الإنزيمات وإنزيم حركية مع دراسة حالة واقع الحياة لعلم الإنزيمات في الطب. وهذا ما يجعل هذا المختبر التجربة من أهمية خاصة بالنسبة لطلاب الطب والصيدلة، والعلوم الطبية الحيوية والمواضيع ذات الصلة. الأهم من ذلك، حقيقة أن هناك حالة طبية خطيرة وقضية غذائية أكثر انتشارا المرتبطة بتقويض اللاكتوز يوفر الفرصة لجمع طائفة واسعة من المسائل الطبية والأخلاقية مع الطلاب. هذا ويمكن أن تشمل المسائل المحيطة بالاختبارات الجينية للظروف الطبية، وترتبط المناقشات المتصلة بالعلاج الجيني والمشورة الوراثية، وكذلك استخدام وبيع المكملات الدوائية. قيد رئيسي واحد أن البروتوكول لا تسمح بتقدير دقيق لتركيز الإنزيم، بسبب انطلاق المواد المستخدمة للاستخراج. ومع ذلك، تعديل لمراعاة هذا، سيكون استخدام إنزيم الصف كاشف للفحص. الأهم من ذلك، سيسمح أيضا لحساب أدق لحركية لأنزيم اللاكتاز.

في الختام، المعايرة النشاط اللاكتاز في مختبر تدريس البيئة يوفر مقدمة قوية وجذابة ومثيرة للاهتمام في الميدان البيولوجيا إنزيم لمرحلة مبكرة طلاب الجامعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactase tablet	Lamberts	8511-60
Phosphate buffered saline (powdered)	Sigma	P3813	Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate	Sigma	451614	Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water	NA	NA
Pestle and mortar	VWR
Spectrophotometer	Jenway 6315
Pipettes	Gilson
15 mL tubes	VWR
1.5 mL tubes	Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes	Jenway
Vortex	Vortex genie 2
Centrifuge	Beckman
Ice bucket	VWR
Water bath	Thermo-Scientific
Weighing scales	Thermo-Scientific