实验教学中乳糖酶活性的测定

摘要

乳糖酶活性对双糖乳糖的分解加工至关重要。在这里, 在膳食补充剂中发现的乳糖酶活性是用比色法测定的。这为学生提供了一个实验平台, 以了解乳糖酶的活性和酵素动力学。

摘要

了解酶是如何工作的, 并与现实生活中的例子有关, 对于生物和生物医学科学中广泛的本科生学位是至关重要的。这种易于遵循的协议是为第一年的本科生药学生制定的, 并提供了酶反应的入门级介绍和酶分析的分析程序。选择的酵素是乳糖酶, 因为这代表了与人类疾病/药学实践相关的商业上可用的酶的例子。乳糖酶从膳食补充片中提取, 并使用一种基于人工基质水解乳糖酶 (邻硝基酚-galactopyranoside, ONPG) 的色度测定法进行评估。用乳糖酶水解裂解法测定 ONPG 的邻硝基酚释放量, 用 420 nm 的吸光度变化来测量, 并通过对冰、室温和37的反应来评估温度对反应的影响。°C.通过评估不同条件下的酶活性和使用不同的试剂, 可以实现更先进的分析。

引言

酶是一种特殊类型的蛋白质, 作为生物催化剂的化学反应在生物体¹。酶的作用对生命至关重要, 提供能量, 处理废物, 让生物体发挥作用。因此, 理解酶是对生命的充分理解至关重要的。这种知识对于各种各样的大学级学位课程来说是必不可少的, 从医学科学到生物学。虽然从催化原理到酶活性理论模型的详细背景可以提供给学生使用讲座和阅读材料, 但酶反应的性质最好掌握在实践经验酶在行动如前所示²。该协议为在实验室条件下测量酶活性提供了一个简单的实验范式, 用乳糖酶作为一个与人类营养和健康相关的活动的酵素的例子。

糖苷水解酶 (EC 3.2. 1.23/26) 是哺乳动物的中心营养重要的酵素³。乳糖酶的活性通过进化得到高度的保护, 并来源于乳糖酶家族的酵素--从大肠杆菌到智人的家族 (图 1, PDB 1JZ8)⁴。乳糖酶在人类营养环境中的重要作用在于它在允许乳糖分解为其组成单糖成分中的角色, 然后可以用来在体内产生能量。乳糖酶催化双糖乳糖中糖苷键的水解, 释放半乳糖和葡萄糖 (图 2)⁵。这些单糖然后主要用于生成三磷酸腺苷 (ATP)通过柠檬酸循环和氧化磷酸化⁶。在新生儿和婴儿发育过程中, 乳糖酶在人类消化系统中表现得很高, 从母乳中分解乳糖, 其中乳糖是主要的碳水化合物成分, 是早期^{营养的重要来源之一。7}. 乳糖酶的重要作用是先天性乳糖缺乏症 (CLD), 一种罕见的常染色体隐性情况, 由乳糖蛋白基因 (LCT) 的突变所引起, 为乳糖酵素⁸的编码。新生儿与 CLD 的乳糖酶活性很小, 因此不能喂养母乳, 任何其他类型的牛奶, 或含有乳糖的配方。

在儿童期, 乳糖酶的表达通常减少;然而, 断奶后的减少在地理上有所不同, 大约35% 的成年人继续表达酶⁹。乳糖酶的持续表达, 被称为乳糖酶的持久性, 允许个人继续从一系列来源消化牛奶和乳制品。反之, 乳糖酶表达的丧失可能导致乳糖不耐受, 也称为成人型 hypolactasia (复兴), 这是由于无法分解肠道中的乳糖造成的。复兴的特点是在结肠中的乳糖的积累后, 摄取乳糖含有食品。在结肠中, 积累的乳糖由肠道微生物区系发酵, 释放包括氢气、甲烷和二氧化碳在内的气体。在乳糖酶缺乏的个体中生产这些气体会促进腹部腹胀, 增加气胀, 疼痛, 恶心和 borborygmi (胃隆隆声)⁷。消化道中乳糖含量的增加也会导致大便松动。

LCT基因表达的控制是由位于邻近MCM6基因内含子的多态性调制而成。具有持续表达乳糖酶的个体携带多态性, 其功能为LCT基因表达的强远端促进剂, 从而补偿断奶时LCT转录的正常向下调节, 从而在成年³中维持乳糖酶的表达。在5000年前^9,10, 在中东的牛和骆驼驯化之后, 增强多态性被认为是积极选择的。

通过减少乳糖摄入, 例如通过从饮食中去除乳制品, 可以管理由复兴引起的症状。对复兴的另一种方法, 以及为 CLD 选择的方法, 是使用乳糖酶补充剂, 广泛提供药房。这些补充剂提供了乳糖酶从各种来源, 包括酵母和细菌, 以液体或药丸为基础的形式, 可以采取或添加到乳糖含有食物。该补充剂将水解在食品中的乳糖的一部分, 葡萄糖和半乳糖产品, 从而允许他们的吸收和防止未消化的乳糖基质在肠道积累。

根据使用乳糖酶补充剂作为膳食援助, 我们开发了一个简单的酶学实验室实验, 适合第一年的生物医学或药学的学生。这一实验利用了市面上可用的乳糖酶补充剂, 并使用邻硝基酚β-galactopyranoside (ONPG) 提供了一个色度终点, 用于测量乳糖酶糖苷键的裂解 (图 3)¹¹。ONPG 作用于乳糖酶的人工基质, 当被这种酵素水解时产生 d-半乳糖和邻硝基酚。后者的产品有一个黄色的颜色, 吸收光波长为 420 nm。通过量化在 ONPG 到乳糖酶暴露后 420 nm 的吸收量的变化, 可以估计这种酵素的活性。本实验室实验提供了酶解活性的证明。通过在不同的条件下建立更多的复制和进行化验, 有可能纳入更复杂的酶动力学分析, 提供了一个宝贵的现实生活中的酶的例子, 有关人类健康的行动。

研究方案

注: 下面的议定书是为了在一个专门建设的教学实验室里, 在两个小时 (包括完成课堂工作表) 的过程中举行的。实验步骤被刻意地放在一起, 以排除更详细的分析酶动力学 (在本课程的背景下使用模型数据);但是, 正如讨论中指出的那样, 《议定书》为更先进的分析提供了一个模板, 取决于时间、设施和学生的素养水平。

安全: 这一实践应根据良好的化学实验室实践 (GCLP) 的规则-个人防护设备, 包括固定的实验室大衣, 一次性手套和安全眼镜应在任何时候都穿在实验室里。.

1. 提取酶

1. 用灰浆和杵粉碎一个乳糖酶片, 其中含有200毫克的酵素, 甚至粉末。
2. 将产生的粉末放入15毫升管标签为 "悬浮" 和并用重悬10毫升100毫米磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。
3. 漩涡1分钟, 以最大限度地提取酶。
4. 将1毫升从悬浮液中转移到1.5 毫升离心管和离心机中, 在 1万 x g处向沉积固体颗粒输送1分钟。
5. 将上清的500µL 转移到一个干净的1.5 毫升管标签为 "乳糖酶提取物"。

2. 观察比色反应

1. 放置390µL 100 毫米 PBS 成1.5 毫升管标签为 "反应 a"。
2. 添加100µL 5 毫米 ONPG 溶液, 并混合良好的涡流。
   注意: 这种实用的方法是用邻硝基酚βD-galactopyranoside (ONPG) 代替乳糖。由于 ONPG 是一种酚醛化合物, 所以应谨慎处理。如果皮肤接触 ONPG, 暴露的皮肤应立即清洗。任何溢漏应立即清除, 用纸巾处理成适当的废物流。
3. 将萃取液中的10µL 加入到反应管内, 涡流混合均匀。
4. 观察反应混合物5分钟, 并注意任何比色变化的溶液。

3. 测定酶活性

1. 设置两个1.5 毫升管: 一个标记为 "反应 B", 一个标记为 "控制"。
2. 添加390µL 100 毫米 pbs 的反应 B 管, 400 µL 100 毫米 pbs 到控制管, 然后添加100µL 5 毫米 ONPG 每管。
3. 通过涡流混合内容。
4. 在反应 B 管中加入10µL 乳糖酶提取物, 混合涡流, 使反应在室温下进行1分钟。
5. 一旦1分钟过去了, 增加500µL 1 米碳酸钠的两个管, 以抑制乳糖酶的 pH 值, 从而终止反应。
6. 将500µL 从每管转移到干净的分光光度计小试管, 用光谱仪测量 420 nm 的吸光度。
7. 注意反应 B 的吸光度和控制样品, 然后从反应值中减去控制值, 从而在活性酶存在的情况下, ONPG 水解产生的吸光度变化。

4. 温度对酶活性的影响

1. 设置三控制管和三反应管如第3节所述, 并标签这些 "4 °c", "房间温度" 和 "37 °c"。
2. 以下加法酵素提取物, 孵化一管在冰, 一个在室温, 并且一个在37°c (在预先加热的水浴)。
3. 允许反应进行1分钟, 然后终止反应通过增加500µL 1 米碳酸钠对每管。
4. 测量每管的吸光度为 420 nm, 如第3节所述。记录值, 从每个案例中的反应值中减去控制值。

结果

图 4A显示了协议2节的代表性结果。控制反应, 在没有乳糖酶的情况下, 仍然清楚, 而反应解决方案, 含有提取物乳糖片, 变成黄色的 ONPG 水解释放邻硝基酚。图 4B显示了使用分光光度计对样品进行分析后, 利用该协议4部分中的任意单位进行量化。当反应在冰上孵化时, 邻硝基酚的产量最低, 当反应达到37摄氏度时最高。

图 1:大肠杆菌 β-乳糖酶.(A)大肠杆菌乳糖酶的晶体结构, 显示活性络合物的 tetrameric 结构。(B) Allolactose (以红色显示) 绑定到 beta 乳糖酶的活动站点。从 PDB 1JZ8⁴生成的图像。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2:乳糖酶作用.乳糖由乳糖酶水解产生β-半乳糖和β d-葡萄糖。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 邻硝基酚的水解betad-galactopyranoside.ONPG 水解乳糖酶生产β-半乳糖和邻硝基酚 (这是黄色的颜色), 通过测量吸收率在420毫微米, 允许估计乳糖活性。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4:ONPG 水解.ONPG 水解的代表性结果, 显示控制和反应管 (A) 和代表性数据从议定书4条记录在类工作表, 显示原始吸光度在任意单位在420毫微米, 改正为背景和在三不同的温度 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

实验条件	实验变量
温度	0°c, 10 °c, 20 °c, 30 °c, 50 °c
衬底浓度	0毫米, 1 毫米, 5 毫米, 10 毫米 ONPG
竞争抑制	5毫米 ONPG 加0毫米, 1 毫米, 5 毫米, 或10毫米乳糖
时间依赖性	0 s, 十五年代, 三十年代, 1 分钟, 5 分钟, 10 分钟, 20 分钟
热变性	乳糖酶提取物加热到100°c 10 分钟之前化验

表 1: 潜在的延长实验条件。建议的延长实验, 将进行三个, 调查乳糖酶生物学的具体方面。

讨论

关于生物、生物医学和药理学的广泛课题, 需要对酶、酶反应和酶动力学的详细了解和理解。上文所述的协议使用乳糖酶作为一个例子, 与人类健康相关的酵素反应, 提供关键技能, 可用于更先进的实验室实验。

这项协议被刻意设计为尽可能健壮, 让几乎没有湿实验室经验的学生在短时间内产生解释结果。在2014/2015 学年的药学阅读学院, 共144名学生, 组织成小组 3, 进行了 "测量乳糖酶" 实验, 所有的小组能够检测到某种水平的酵素活性从乳糖片提取 物。

此协议中有许多关键步骤。首先, 重要的是, 最初的提取是有效的, 允许溶出足够的活性酶的后续分析。根据我们的经验, 第一年的本科生可以按照《议定书》的规定实现这一目标;然而在这一点上需要实验室示威者的一些指导。虽然这似乎是不言而喻的一点, 但这项议定书成功的一个关键因素是能够仔细测量体积, 正确地标注管子并遵循指令。虽然对于许多学生来说, 一定程度的精通能力, 仔细的监测和明确的要求, 如果他们不确定下一步该做什么, 这将是一个成功的化验的最大可能性的学生要求帮助。

学生评价可以由课堂上的工作表 (可作为补充材料) 进行, 要求学生注意实验数据, 评论他们的结果, 并链接到背景信息/阅读讲座材料, 或通过更多详细, 在类评估与模型数据提供允许的动力学分析尝试和评估。

本文提出的协议是一个简单的例子, 在教学实验室条件下的乳糖酶活性检测, 并有充分的机会增加实验的复杂性, 以允许更先进的分析。特别是, 所提出的协议提供了酶动力学概念的介绍, 但不允许对实验数据进行动力学分析。因此, 我们建议将所描述的协议看作是类的初始模板, 并以适合于进行实验的学生队列的特定目标和人才为准的精确细节。扩展实验的例子可以包括: 在不同温度下重复测量, 使用不同的基质浓度, 允许统计分析, 数据的动力学分析 (适合生物化学学生/专业), 从不同的片剂和允许学生评估不同的酶活性在每个 (与控制片剂的加法, 适合法医科学学生或专业), 评估热变性的影响, 或进行竞争添加乳糖或乳糖酶抑制剂的实验 (表 1)。乳糖酶动力学分析的详细的协议以前被出版了¹²。

这个协议的一个重要的力量是它结合了基本的酶学和酵素动力学的介绍与医学上的生物力学的实际案例研究。这使得实验室实验与医学、药学、生物医学科学和相关学科的学生特别相关。重要的是, 有一个严重的医疗条件和更广泛的饮食问题, 与乳糖分解代谢提供了机会, 以提高广泛的医疗和道德问题, 与学生。这可能包括有关医疗条件的基因检测的问题, 以及有关基因治疗和遗传咨询的相关讨论, 以及使用和销售药物补充剂。一个主要的限制是, 该协议不允许精确估计的酶浓度, 由于用于提取的起始材料。然而, 对此的修改将是使用试剂级酶进行化验。重要的是, 这也将允许更精确地计算乳糖酶的动力学。

最后, 在教学实验室环境中对乳糖酶活性的测定, 为早期大学生的酵素生物学领域提供了有力的、引人入胜的、有趣的介绍。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lactase tablet	Lamberts	8511-60
Phosphate buffered saline (powdered)	Sigma	P3813	Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate	Sigma	451614	Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water	NA	NA
Pestle and mortar	VWR
Spectrophotometer	Jenway 6315
Pipettes	Gilson
15 mL tubes	VWR
1.5 mL tubes	Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes	Jenway
Vortex	Vortex genie 2
Centrifuge	Beckman
Ice bucket	VWR
Water bath	Thermo-Scientific
Weighing scales	Thermo-Scientific