Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ

Summary

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Abstract

تخضع العمليات الخلوية مثل الانقسام وتمايز الخلايا عن طريق التغييرات في شكل الخلية التي تعتمد إلى حد كبير على إعادة السليم للهياكل الخلية هيكل الخلية. وهذا ينطوي على التجميع تفكيك العليا الهياكل الجزيئات في وقت معين، والمكان، وهي عملية حساسة بشكل خاص للاضطرابات الناجمة عن overexpression من البروتينات. الأساليب التي يمكن الحفاظ على توازن بروتين والحفاظ على القصير وطبيعي التشكل الخلوي هي مرغوب فيه للغاية لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتين من الفائدة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. عابرة التجارب استنزاف الانقاذ بناء على تدخل الحمض النووي الريبي هي نهج قوية لتحليل وظائف البروتين والمتطلبات الهيكلية. ومع ذلك، إعادة إدخال البروتين الهدف مع الحد الأدنى من الانحراف عن مستواه الفسيولوجية هو التحدي الحقيقي. نحن هنا وصف طريقة تسميته adenofection التي وضعت لدراسة دور الجزيئات المصاحبة لشركاء التطوير في التشغيل العادي للتقسيم الخلايا والعلاقة مع إعادة الأكتين. تم استنفاد خلايا هيلا من BAG3 مع الدوبلكس سيرنا تستهدف المنطقة 3'UTR. ويعيد البروتينات BAG3 الموسومة GFP في وقت واحد في> 75٪ من الخلايا باستخدام الفيروسات الغدية المؤتلف بالإضافة إلى الكواشف ترنسفكأيشن. Adenofection سكريبت لتتمكن من التعبير عن البروتينات BAG3-GFP في المستويات الفسيولوجية تقريبا في خلايا هيلا المنضب من BAG3، في ظل عدم وجود استجابة التوتر. لم يلاحظ أي تأثير على مستويات مرافقين بروتين الصدمة الحرارية الذاتية، المنظمين من الإجهاد محرض الرئيسية للتوازن البروتين. وعلاوة على ذلك، وذلك بإضافة baculoviruses القيادة التعبير عن علامات الفلورسنت في وقت خلية التنبيغ ترنسفكأيشن، يمكننا أن تشريح ديناميات الخلايا الإنقسامية التي كتبها المجهرية الوقت الفاصل بين يحلل مع الحد الأدنى من اضطراب التقدم الإنقسامية العادي. Adenofection ينطبق أيضا على خلايا فأر التي يصعب تصيب، ومناسبة للتحليلات وظيفية فرق بالخلايا العضلية الجذعيةerentiation إلى myotubes. وهكذا يوفر adenofection طريقة تنوعا لأداء هيكل الوظائف تحلل البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحساسة التي تعتمد على العليا ديناميات هيكل الخلية.

Introduction

تعطيل وظيفي في التعبير الجيني في خلايا الثدييات هو معيار الذهب لتشريح وظائف البروتين. وضعت حديثا تقنيات التحرير الجينوم على أساس استخدام nucleases مواقع محددة مثل nucleases الزنك الاصبع وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / CAS9 تسمح الآن جيل من خطوط الخلايا مع حذف الجينات المستهدفة وطفرة ^1،2. وينبغي لهذه المناهج الجديدة ثورة في الطريقة التي ندرسها وظيفة البروتين وفهمنا لعلم الوراثة من الأمراض التي تصيب الإنسان. في بعض الحالات، ومع ذلك، على المدى الطويل أو بالضربة القاضية جين كامل غير مرغوب فيه وربما يثير آليات التعويض خلية الثانوية. جيل من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا ويمكن أيضا أن يكون الحد عند التعامل مع الثقافات الخلية الأولية مع قدرة انتشار محدودة، أو عندما يطلب فحص مجموعة كبيرة من الطفرات في مختلف أنواع الخلايا. وغالبا ما تطلب الأمر ذلك لتحديد تبعية خلية بعملية iological على متطلبات الهيكلية للبروتين. تحقيقا لهذه الغاية، ضربة قاضية عكسها عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي التي تمكن التجارب استنزاف الانقاذ عابرة في مختلف الخلفيات الخلوية لا تزال مقاربة بسيطة وقوية لأداء هيكل الوظائف تحلل بروتين من الفائدة ^3. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا النهج هو صعوبة لتحقيق إسكات كفاءة ولإعادة البروتين من الفائدة أو مشتقاته في مستويات الفسيولوجية تقريبا في غالبية السكان الخلية. هذا أمر بالغ الأهمية لتمكين الدراسات الشاملة التي تحاول ربط آثار وظيفية ينظر على مستوى الخلايا واحد (النمط الظاهري hypomorphic) مع تلك التي ظهرت في المقايسات القائمة على السكان الخلية، على سبيل المثال على تفاعلات البروتين البروتين.

باستخدام أساليب ترنسفكأيشن الكلاسيكية، يمكن للمرء أن من الصعب تحقيق التعبير متجانسة وانخفاض البروتينات الخارجية في عدد كبير من الخلايا. تنبيغ من الخلايا التي تحتوي على فيروسات المؤتلفمثل الفيروسات الغدية في كثير من الأحيان يمكن التعبير أكثر طبيعية من البروتينات الخارجية. ومع ذلك فإن امتصاص اتش محدودة من قبل مستقبلات CAR، الذي هو غائب في خلايا غير بشرية أو فقط أعرب ضعيف في بعض أنواع الخلايا البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن دخول الخلوي من الفيروسات الغدية ينشط مسارات الإشارات التي تنظم شكل الخلية والتصاق ^4-6. ومن الواضح أن هذا غير مرغوب فيه عند دراسة الآليات التنظيمية morphodynamics الخلية. كنا في مواجهة هذه الإشكالية عندما قمنا بها تحليلات وظيفية مجمع كوصي، BAG3-HSPB8، في انقسام الخلايا وديناميات الأكتين. وكان العمل الرائد وصفت دور لهذا المجمع كوصي في مراقبة الجودة البروتين والالتهام الذاتي أثناء الإجهاد ^7،8. معظم هذه الدراسات، ومع ذلك، تعتمد على overexpression البروتين، على افتراض أن المحرمين وupregulated عادة أثناء الإجهاد. وقد ترك هذا الباب مفتوحا أمام مسألة ما إذا كان BAG3، في مجمع مع HSPB8، يمكن أن تسهم في التشغيل العادي للتقسيم الخلايا معربا عن عشرمرافقين جنوب شرقي مثل العديد من أنواع الخلايا السرطانية ^9. على وجه الخصوص، ما إذا كان مجمع كوصي يساهم في إعادة بناء الهياكل القائمة على الأكتين التي تتحكم في تطور الإنقسامية كانت ذات أهمية كبيرة، نظرا للصلات الناشئة بين المحرمين HSPB وديناميات هيكل الخلية ^10. لمعالجة هذه المسألة، كنا نسعى إلى تطوير وسيلة فعالة للتجارب استنفاد الإنقاذ التي لن تتداخل مع تطور الإنقسامية أو التشكل الخلوي، والتي من شأنها الحفاظ على توازن البروتين لتجنب اضطراب ثانوي لديناميات المجمعات الجزيئات تنظيم التغييرات خلية الشكل . وبالتالي من الناحية المثالية، يجب أن يتم تنفيذ استنفاد إضافة الخلفي من الجينات في المصالح في وقت واحد.

وقد وصفت استخدام المجمعات من اتش مع البوليمر الموجبة أو الدهون لتعزيز نقل الجينات في المختبر والمجراة ^11،12. على سبيل المثال، يظهر فوسفات الكالسيوم (التعريب) لتشكيل يعجل معاتش التي تعزز فيروس ملزم دخول عبر مستقلة CAR المسار ^13. في الواقع، وجدنا أن الجمع بين القائم اتش تنبيغ الخلية وترنسفكأيشن مع المركبات الموجبة يمكن أن تعزز كفاءة التجارب استنزاف الانقاذ. وهذا ما سمح لنا لخفض كميات الفيروس عن طريق 3- إلى 20 أضعاف، اعتمادا على خط الخلية والجينات في المصالح، والاستفادة من نافذة أوسع من أجل ضبط التعبير عن البروتينات الخارجية في المستويات الخفية تقريبا في غالبية من سكان الخلية في المصالح مع الحد الأدنى من التأثير على التشكل الخلوي. في ظل هذه الظروف، يمكننا أيضا تحقيق درجة عالية من الكفاءة ضربة قاضية للتعبير البروتين الذاتية (> 75٪). وصفنا بهذا الخطوة طريقة خطوة، وتقديم أدلة على أن توازن البروتين ليست منزعجة بشكل كبير وفقا لتقييم مستويات دون تغيير من المحرمين التوتر الناجم عن الأسرة البروتين الحرارة صدمة، مما يجعل طريقة مناسبة للتحليلات وظيفية رو الفسيولوجيةلو من الجزيئات المصاحبة التي كتبها الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو. البروتوكول هو قابل للإجراءات تزامن انقسام الخلية واستخدام baculoviruses المتاحة تجاريا للمشاركة في التعبير عن مستويات منخفضة من علامات الفلورسنت، مع الحد الأدنى من التدخل في ديناميات القائم على الأكتين والمغزل العادية خلال التقدم الإنقسامية. وتبين لنا كذلك براعة الأسلوب، والتي تنطبق على "من الصعب تنبيغ" خلايا C2C12 الماوس، مع عدم وجود تأثير كبير على التمايز بالخلايا العضلية الجذعية في myotubes في المختبر.

Protocol

1. إعداد المتوسطة وحلول (كل العقيمة التي تمت تصفيتها)

1. C2C12 خلايا العضلات الماوس (دراسات التمايز)
   1. إعداد 500 مل من النمو المتوسطة لC2C12 صيانة زراعة الخلايا: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 10٪ FBS و2mm و L-الجلوتامين.
   2. إعداد 100 مل متوسطة التمايز (DM) للتمايز C2C12: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 2٪ الحصان المصل.
2. خلايا هيلا (دراسات في الخلايا الإنقسامية)
   1. إعداد 500 مل αMEM لهيلا طلب تقديم العروض، H2B صيانة زراعة الخلايا والتجارب: αMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 2 مم L-الجلوتامين (αMEM ^10٪).
   2. إعداد 500 مل αMEM ناقص (بدون deoxyribonucleosides / ribonucleosides) لمزامنة خلية طلب تقديم العروض، H2B هيلا: αMEM ناقص تستكمل مع FBS 10٪ و 2 مم L-الجلوتامين (αMEM-ناقص ^10٪).
   3. إعداد 20 مل αMEM دون الفينول الأحمر لهيلا-RFP-H2B لإيف خلية الاستحواذ: αMEM دون الفينول الأحمر تستكمل مع FBS 10٪ و 2 مم L-الجلوتامين.
   4. إعداد 100 ملي الثيميدين: حل 24.2 ملغ في 1 مل H ₂ O عند 37 درجة مئوية قبل vortexing. فلتر تعقيم والحفاظ على 4 درجات مئوية.
3. حلول مشتركة
   1. إعداد 0.05٪ التربسين / EDTA: 0.05٪ التربسين، 0.625 ملي EDTA في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). فلتر تعقيم وقسامات مخزن في -20 درجة مئوية. إذابة مرة واحدة، والحفاظ على قسامة في 4 درجات مئوية.
   2. إعداد HBS2x: 280 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي HEPES، 1.5 ملي نا ₂ هبو _4. ضبط درجة الحموضة تماما بين 7،01-7،05 مع 10 N هيدروكسيد الصوديوم. تصفية العقيمة والحفاظ على 4 درجات مئوية.

2. طلاء لوحات ثقافة الخليوي مع [فيبرونكتين وطلاء من خلايا هيلا-RFP-H2B

ملاحظة: قبل التجربة، يجب على كل متلاعب اقامة الظروف خلية الطلاء المثلى لتحقيق الكثافة المناسبة الخلايا منذ الاختلافات قد OCالوغد بين كل متلاعب وكل سطر مختلفة من الخلايا.

1. قبل يوم من التجربة، وتوسيع خلايا هيلا-RFP-H2B للتأكد من أنها ضمن المرحلة الأسي النمو في يوم من الطلاء. جعل 2 المتعاقبة 1/3 التخفيفات في 10 سم لوحات تبدأ من 80٪ متموجة 1X10 سم لوحة.
   ملاحظة: خطط عدد من لوحات للتجربة. حساب كل حالة كما التكرارات، واحدة للتصوير الخلايا الحية على المدى القصير واحد من البروتين مقتطفات لتحديد مدى فعالية من ضربة قاضية وبروتين تعبير خارجي عن طريق تحليل لطخة غربية. تخطيط لوحة إضافية واحدة لتحديد عدد الخلايا قبل تنبيغ الفيروس.
2. قبل الخلية والطلاء، ومعطف الزجاج أطباق أسفل مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين. إضافة 1 مل من 1: 100 التخفيف من 1 ملغ / مل فبرونيكتين (المخفف في العقيمة برنامج تلفزيوني 1X) لكل 35 مم طبق لتغطية جيدا السطح كله واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
3. أثناء الحضانة، على أن تستكمل αMEM قبل الحارة وايال 10٪ FBS (αMEM ^10٪) و 0.05٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية.
4. بعد 45 دقيقة من الحضانة، والبدء في التحضير حل الخلية. في غطاء العقيمة، نضح المتوسطة من لوحة 10 سم، وشطف بلطف مرتين مع 1.5 مل 0.05٪ التربسين / EDTA، وترك 0.5 مل من التربسين / EDTA في التطلع الماضي.
5. احتضان الخلايا لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. من خلال استغلال بلطف لوحة والمراقبة تحت المجهر، تحقق من أن كل الخلايا تم فصل. إضافة 10 مل من αMEM ^10٪ وماصة بلطف عدة مرات لفصل الخلايا. عدد عينة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام عداد خلايا الدم.
6. نضح الحل فبرونيكتين من الأطباق أسفل الزجاج. لا تسمح الفيبرونكتين لتجف قبل الطلاء الخلية.
7. لوحة 1.5x10 ⁵ خلايا لكل 35 طبق مم في 2 مل αMEM ^10٪ واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. تحقق بعد 30-45 دقيقة تحت المجهر أن الخلايا هي سيبا جيدمصنفة، لأن لديهم الميل إلى تراكم في وسط اللوحة.
8. إذا لزم الأمر، تستنهض الهمم لوحات بلطف عبر الحكيمة لإعادة توزيع الخلايا. لوحة واحدة لوحة 35 ملم إضافية لعدد من الشروط من أجل إحصاء عدد الخلايا قبل تنبيغ الفيروس.
9. تنمو الخلايا حتى اليوم التالي لتحقيق كثافة الخلية لا يقل عن 50٪. وكثافة الخلايا أقل من 50٪ النتائج إلى انخفاض كبير في كفاءة تنبيغ فيروس، زادت الاختلافات في التعبير البروتين في الخلايا، وزيادة سمية الخلية.
   ملاحظة: طلاء من أطباق الزجاج مع فبرونيكتين يحسن نمو الخلايا والتشكل ويعزز التقدم السليم للخلايا من خلال الانقسام. ويمكن بشكل عام أن تحل محلها الجيلاتين المتاحة تجاريا التي هي أرخص.

3. اتش تنبيغ والبروتين الذاتية ضربة قاضية من قبل سيرنا ترنسفكأيشن في خلايا هيلا-RFP-H2B عن طريق كابي رواسب

الحذر! العملجي مع الفيروسات يتطلب احتياطات خاصة والتخلص السليم من جميع المواد التي كانت في تماس مع الفيروس.

الحذر! في أيدينا، كابي يترسب في كثير من الأحيان يكون لها آثار غير مرغوب فيها أكثر، على سبيل المثال على العمليات الحيوية المتعلقة بالاتجار الحويصلة (على سبيل المثال، الالتهام الذاتي). وفقا لذلك فمن المستحسن استخدام الموجبة الدهون كاشف ترنسفكأيشن (انظر أدناه)، والانتظار على الأقل 48 ساعة قبل التحليل.

ملاحظة: اتش السيطرة يحمل الجين لا علاقة لها (أي LacZ) أو أي الجينات يستخدم للوصول إلى وزارة الداخلية الحد الأدنى في جميع Adenofections (10-20 PFU / خلية) باستخدام أقل كمية من اتش المؤتلف يحمل الجين.

ملاحظة: وقد تبين أن هذا الإجراء للمساعدة في التعبير تطبيع لكل خلية في عدد السكان خلية كبيرة.

1. بعد يوم واحد من الطلاء خلية، والاعتماد على عدد من الخلايا من الطبق مطلي إضافية. نضح المتوسطة وشطف مرة واحدة مع 1 مل 0.05٪ التربسين / EDTA. إضافة مرة أخرى 1 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ حتى يكون فصل كل الخلايا. فصل الخلايا جيدا باستخدام ماصة 1ML وحساب عدد الخلايا لكل مل باستخدام عداد خلايا الدم.
2. تحديد كمية الفيروس اللازمة لتنبيغ الخلايا في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من وحدات 2-تشكيل لوحة (PFU) من البروتين ذات الاهتمام (POI) في كل خلية و 18 PFU في كل خلية من ناقلات فارغة (على سبيل المثال، LacZ) لدينا ما مجموعه 20 PFU لكل خلية. في نفس الوقت تنبيغ 4 PFU من كل الفيروسة العصوية (الأكتين وαTubulin، GFP و على التوالي الموسومة RFP). تنبيغ الخلايا باستخدام بروتوكول adenofection التالية. واستخدمت الفيروسات كما هو موضح في فوكس وآخرون ^(14).
3. إعداد في غطاء العقيمة أنبوب بلاستيكي 1.5 مل لكل حالة وإضافة 400 ميكرولتر من αMEM ناقص دافىء ^10٪.
4. ذوبان الجليد قسامة من الفيروسات ببطء على الجليد، وإذا لزم الأمر، وتمييع رانه الأسهم الفيروس من أجل الماصة حجم أكبر من 1 ميكرولتر للحد من الأخطاء pipetting ل.
5. إضافة كمية الفيروس محسوبة في حالة أن كل أنبوب من البلاستيك 1.5 مل تحتوي على 400 αMEM ناقص ميكرولتر ^10٪ وتخلط بلطف قبل pipetting. وضع الأسهم فيروس العودة فورا في -80 درجة مئوية للحفاظ على نشاطها.
6. نضح المتوسطة من الخلايا وماصة بلطف مزيج فيروس قطرة من الحكمة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ وتستنهض الهمم لوحات بعناية تحت غطاء العقيمة كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة لتغطية جيدا الخلايا مع فيروس. باستخدام كمية صغيرة من متوسطة يسهل الاتصال من الفيروس مع الخلايا.
7. بعد الحضانة، ماصة بلطف 1.6 مل αMEM-ناقص ^10٪ على كل لوحة للحصول على الحجم الكلي لل2 مل، بدء المزامنة خلية بإضافة 2 مم الثيميدين واحتضان الخلايا لمدة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ .
8. وفي الوقت نفسه، وإعداد سيرنا followi مزيج ترنسفكأيشننانوغرام طريقة ترنسفكأيشن كابي (انظر الشكل 1). إذا لا سيرنا هو ضروري، واستبدال كمية من سيرنا من الماء المعقم لإجراء ترنسفكأيشن فارغة.
9. حساب 200 مزيج ميكرولتر لكل حالة، مما أدى في 400 ميكرولتر في مكررة. يتم إعطاء المثال التالي لتركيز سيرنا النهائي من 50 نانومتر على أن تكون تكييفها مع كل بروتين من الفائدة. في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل، ماصة 50 ميكرولتر 1 م CaCl ₂ و 11 ميكرولتر 20 ميكرومتر سيرنا إلى 139 ميكرولتر H ₂ O معقمة ومزيج من قبل vortexing. بعد دوران سريع، إضافة بعناية قطرة من الحكمة 200 ميكرولتر HBS2x (280 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي HEPES، 1.5 ملي نا ₂ هبو _4، ودرجة الحموضة 7،01-7،05).
   ملاحظة: أصغر قطرات أصغر هي رواسب، مما يؤدي إلى تحسين كفاءة ترنسفكأيشن. المزيج بلطف ثلاث مرات عن طريق الحقن الهواء باستخدام 200 ميكرولتر ماصة.
10. احتضان هذا المزيج لمدة 30 دقيقة في RT. إضافة قطرة من الحكمة ببطء 200 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى كل لوحة وتستنهض الهمم عبر الحكمة. نقل لوحات عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 16 ساعة.
11. في اليوم التالي، شطف الخلايا مرتين مع 2 مل HEPES الدافئة (6.7 ملي بوكل، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3) وإضافة 2 مل αMEM-ناقص ^10٪. لا تمضي مع أكثر من أربعة ألواح الخلايا في وقت حيث أن اختلاف درجة الحرارة تؤثر على طول دورة الخلية.
12. تصور كفاءة العدوى تحت مجهر فلوري مقلوب في التكبير من 20-40x (الهواء) والحصول على ثلاث صور تمثيلية في حالة في كل القنوات الفلورسنت ونقل عن الوثائق. بعد سبع ساعات، إضافة 2 ملي الثيميدين واحتضان لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
13. في اليوم التالي، 48 ساعة بعد سيرنا ترنسفكأيشن وعدوى فيروس، شطف الخلايا مرتين مع 2 مل الدافئة المالحة العازلة الفوسفات (PBS) والافراج عن 7 ساعات في 2 مل αMEM ^10٪ ث / س الفينول الأحمر لتصوير الخلايا الحية أو مع الفينول الأحمر لاستخراج البروتين.
14. حصاد الخلايا لكل حالة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن لإعداد مستخلصات البروتين وتحليل لطخة غربية لتحديد كفاءة ضربة قاضية والتعبير عن بروتين الذاتية ^(15).
    ملاحظة: استخدام أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة وكذلك الأجسام المضادة المناسبة بمثابة الضوابط التحميل. وينبغي أن تحدد كفاءة ضربة قاضية عن طريق تحميل كميات متناقصة من خلية مراقبة لست] (transfected مع تحكم سيرنا)، لتوفير منحنى المعايرة (أي 1، ½، ¼، ⅛).

4. اتش تنبيغ والبروتين الذاتية ضربة قاضية من قبل سيرنا ترنسفكأيشن في خلايا هيلا باستخدام الموجبة الدهن ترنسفكأيشن الكاشف

ملاحظة: هنا نقدم البروتوكول الذي تم تكييفها للتجارب التي لا تنطوي على تزامن انقسام الخلية و / أو عند سيرنا ترنسفكأيشن لا يمكن أن يقوم بها طريقة التعريب، على سبيل المثال لتجنب الآثار السامة غير مرغوب فيها في بعض الخلايا لينوفاق. ويشمل هذا البروتوكول أيضا خطوة خلية replating بعد adenofection من أجل العمل في مناطق ذات كثافة الخلية المناسبة. لقد اختبرنا فقط الموجبة الدهون كاشف ترنسفكأيشن.

الحذر! التعامل مع الفيروسات يتطلب احتياطات خاصة والتخلص السليم من جميع المواد التي كانت في تماس مع الفيروس.

1. لوحة 1.75 × 10 ⁵ خلايا في طبق 35 ملم في 2.5 مل αMEM ^10٪ واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. لوحة واحدة لوحة 35 ملم إضافية لعدد من الشروط من أجل إحصاء عدد الخلايا قبل تنبيغ الفيروس.
2. تنمو الخلايا حتى اليوم التالي لتحقيق كثافة الخلية لا يقل عن 50٪. وكثافة الخلايا أقل من 50٪ النتائج إلى انخفاض كبير في كفاءة تنبيغ فيروس، زادت الاختلافات في التعبير البروتين في الخلايا، وزيادة سمية الخلية.
3. بعد يوم واحد من الطلاء خلية، والاعتماد على عدد من الخلايا من الطبق مطلي إضافية. نضحعلى المدى المتوسط ​​وشطف مرة واحدة مع 1 مل 0.05٪ التربسين / EDTA. إضافة مرة أخرى 1 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ حتى يكون فصل كل الخلايا. خلايا منفصلة جيدا باستخدام ماصة 1 مل وحساب عدد الخلايا لكل مل.
4. تحديد كمية الفيروس اللازمة لتنبيغ وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 20-40 وحدة تشكيل اللويحات (PFU) من البروتين ذات الاهتمام (POI) في كل خلية و0-20 PFU في كل خلية من ناقلات فارغة (على سبيل المثال، LacZ) لدينا ما مجموعه 40 PFU لكل خلية.
5. إعداد في غطاء العقيمة أنبوب بلاستيكي 1.5 مل لكل حالة وإضافة 400 ميكرولتر من αMEM دافىء ^10٪.
6. ذوبان الجليد قسامة من الفيروسات ببطء على الجليد، وإذا لزم الأمر، يخفف من الأسهم الفيروس من أجل الماصة حجم أكبر من 1 ميكرولتر للحد من الأخطاء pipetting ل.
7. إضافة كمية الفيروس يحسب لكل حالة لكل 1.5 مل أنبوب بلاستيكي يحتوي على 400 ميكرولتر αMEM ^10٪ وتخلط بلطف قبل pipetting. المركز الرابعالبريد الأسهم فيروس العودة فورا في -80 درجة مئوية للحفاظ على نشاطها.
8. نضح المتوسطة من الخلايا وماصة بلطف مزيج فيروس قطرة من الحكمة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ وتستنهض الهمم لوحات بعناية تحت غطاء العقيمة كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة لتغطية جيدا الخلايا مع تخفيف الفيروس. باستخدام كمية صغيرة من متوسطة يسهل الاتصال من الفيروس مع الخلايا.
9. وفي الوقت نفسه، وإعداد مزيج ترنسفكأيشن سيرنا وفقا للطريقة ترنسفكأيشن. إذا لا سيرنا هو ضروري، واستبدال كمية من سيرنا بواسطة وسيط وبدون المصل لإجراء ترنسفكأيشن فارغة.
   1. يتم إعطاء المثال التالي لتركيز سيرنا النهائي من 50 نانومتر على أن تكون تكييفها مع كل بروتين من الفائدة. لكل adenofection، وإعداد واحد 1.5 مل أنبوب بلاستيكي يحتوي على 416 نانومتر سيرنا في 150 المتوسطة ميكرولتر من دون المصل (على سبيل المثال، 6.25 ميكرولتر 20 ميكرومتر سيرنا + 144 المتوسطة ميكرولتر من دون المصل) واحد 1.5 مل أنبوب بلاستيكي containiنانوغرام 6.25 ميكرولتر الموجبة الدهون ترنسفكأيشن الكاشف + 144 المتوسطة ميكرولتر من دون المصل.
   2. خلط محتويات كل أنبوب بلاستيكي قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات مع ماصة 200 ميكرولتر. الجمع بين المحتوى من كلا الأنابيب ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات مع ماصة 200 ميكرولتر. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
10. بعد الحضانة مع الفيروس، ماصة بلطف 1.8 مل αMEM ^10٪ على كل لوحة للحصول على الحجم الكلي 2.2 مل وعلى الفور إضافة ببطء إسقاط الحكيم مزيج ترنسفكأيشن سيرنا إلى كل لوحة وتستنهض الهمم عبر الحكمة. نقل لوحات عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة.
11. في اليوم التالي، إعادة لوحة الخلايا من كل لوحة 35 ملم إلى أربع لوحات 35MM الجديدة في 2.5 مل αMEM ^10٪ لكل منهما، واحتضان ل24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
12. في اليوم التالي، 48 ساعة بعد سيرنا ترنسفكأيشن وعدوى فيروس، خلايا الحصاد من لوحة واحدة لكل حالة لإعدادمقتطفات من البروتين وتحليل لطخة غربية لتحديد كفاءة ضربة قاضية والتعبير عن بروتين الذاتية ^(15).
    ملاحظة: مع لوحات المتبقية، والمضي قدما مع تثبيت الخلية، وذلك باستخدام بروتوكول الاختيار وإخضاع العينات للتحليل المناعي مع الأجسام المضادة من الفائدة ^14.

5. يعيش التصوير خلية من خلايا الميتوزى وتحليل البيانات

1. إجراء تجارب التصوير الخلية الحية على المدى القصير على الخلايا الإنقسامية مع مجهر مقلوب مجهزة مرطب / 5٪ CO ₂ / غرفة التنظيم الحراري.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر القرص الغزل مبائر (40X، 0.75 NA)، مجهزة EMCCD تبريد الكاميرا إلى جانب المسؤول في -50 درجة مئوية.
2. قبل الشراء، تأكد من أن الغرفة قد وصلت درجة الحرارة المناسبة من 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذا قد يستغرق عدة ساعات اعتمادا على نظام المجهري.
3. ضع الأطباق الثقافة في ميكرغرفة oscope 1 ساعة قبل شراء لتمكين التوازن السليم على المدى المتوسط ​​وتجنب التركيز الانجراف بسبب التغيرات في درجات الحرارة. مراقبة حالة الإنقسامية من الخلايا. عند هذه النقطة، يجب أن يكون 10-15٪ من الخلايا في المراحل المبكرة من الانقسام (الطور-طليعة الطور التالي).
4. خلال فترة موازنة، إعداد المعلمات الاستحواذ على النحو الذي تحدده في التجارب السابقة. عادة، ومدة التعرض لكل من القنوات (488 و 594) من 0،2-3 ثانية مع كثافة الليزر من 100٪ وحساسية 121-130 معلمات مناسبة في أيدينا.
   ينبغي أن يكون أول اختبارات لتحديد الحد الأدنى للكثافة الليزر واكتساب الوقت / الفاصل الزمني الذي يؤدي إلى الحل المناسب مع الحد الأدنى photobleaching من أن يسبب الأضرار الخلية ويشوش التقدم الإنقسامية: ملاحظة.
5. اختيار عدة حقول في حالة الحصول على عدد كبير من الخلايا لتحليلها دون تجاوز فترة التملك. باستخدام نظام متحد البؤر القرص الغزل، سوف إعداد نموذجي فيواستعمل أربعة شروط مختلفة، 7 الحقول في لوحة و 2 قنوات اللون (488 و 594) مع فاصل زمني 1.5-2 دقيقة على مين فترة 75.
6. اختيار الخلايا التي هي في دخول الإنقسامية، إعادة تعيين التركيز وقد تم اختيار مرة واحدة كل المجالات والبدء في عملية الاستحواذ في أسرع وقت ممكن.
7. مراقبة استقرار النظام لا يقل عن ثلاث نقاط الوقت وإعادة ضبط التركيز إذا لزم الأمر.
8. بعد أول تصوير الخلايا الحية على المدى القصير من 75 دقيقة، ويمكن اختيار مجالات جديدة للخلايا الإنقسامية للحصول على المجموعة الثانية من الأفلام لزيادة عدد الخلايا التي يجري تحليلها.
9. تحديد معايير واضحة المعالم لتحليل الظواهر الإنقسامية من الخلايا، والتي سوف تعتمد على علامات الفلورسنت المستخدمة. عيوب في الانقسام قد تشمل الوقت الذي يقضيه في الانقسام لفترات طويلة (من انهيار النووي حتى طور الصعود)، اختلال الكروموسومات، هزاز المغزل، والقشرة blebbing ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 اتش تنبيغ في Differentiatinز C2C12 Myoblasts ماوس

ملاحظة: بروتوكول adenofection ينطبق أيضا على myoblasts الماوس C2C12 التي يصعب تصيب تمر التمايز.

1. لوحة 2 × 10 ⁵ C2C12 الخلايا في أطباق ثقافة 35 ملم في المتوسط ​​النمو على البلاستيك أو على ركيزة من الاختيار.
   تم تحسين تمايز الخلايا على أطباق gelatine- أو Matrigel المغلفة: ملاحظة. تخطيط لوحة إضافية واحدة لتحديد عدد الخلايا قبل تنبيغ الفيروس.
2. في اليوم التالي، كان ينبغي أن بلغ الخلايا 80٪ من confluency. حمل بالخلايا العضلية الجذعية التمايز عن طريق غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الدافئ وإضافة 2 مل من المتوسط ​​التمايز (DM).
3. في اليوم التالي، وصفت بأنها يوم 1 (D1) من التمايز، تنبيغ myocytes مع اتش LifeAct-TagGFP2 لتصور الهيكل الخلوي الأكتين في الخلايا الحية. حساب عدد الخلايا من لوحة إضافية كما هو موضح تحت 3.2. احسب 5 PFU / خلية من اتش LifeAct-TagGFP2 و 45 PFU AdLacZ / خلية بعد الامتحانوصف سبيل في الجدول 1. وتبلغ كمية الفيروس هو 50 PFU / الخلية. واستخدمت الفيروسات كما هو موضح ¹⁴
4. إعداد في غطاء العقيمة أنبوب بلاستيكي 1.5 مل لكل حالة وإضافة 400 ميكرولتر من DM الدافئ.
5. ذوبان الجليد قسامة من الفيروسات ببطء على الجليد، وإذا لزم الأمر، يخفف من الأسهم الفيروس من أجل الماصة حجم أكبر من 1 ميكرولتر للحد من الأخطاء pipetting ل.
6. إضافة كمية مناسبة من جزيئات الفيروس في حالة أن كل أنبوب من البلاستيك 1.5 مل تحتوي على 400 ميكرولتر DM وتخلط بلطف قبل pipetting. وضع الأسهم فيروس العودة فورا في -80 درجة مئوية للحفاظ على نشاطها.
7. نضح في المتوسط ​​من أطباق وماصة بلطف مزيج فيروس قطرة من الحكمة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ وتستنهض الهمم لوحات بعناية تحت غطاء العقيمة كل 15 دقيقة ليصبح المجموع 1 ساعة لتغطية جيدا الخلايا مع فيروس.
8. بعد الحضانة، ماصة بلطف 1.6 مل DM على كل لوحة ومواصلة طncubation ل2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
9. وفي الوقت نفسه، وإعداد مزيج ترنسفكأيشن فارغة وفقا للطريقة ترنسفكأيشن كابي. حساب 200 مزيج ميكرولتر لكل حالة. استخدام المثال التالي لإجمالي حجم 400 مزيج ميكرولتر.
   1. في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل، ماصة 50 ميكرولتر 1 م CaCl ₂ إلى 150 ميكرولتر العقيمة H ₂ O ومزيج من قبل vortexing. بعد دوران سريع، إضافة بعناية قطرة من الحكمة 200 ميكرولتر HBS2x (280 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي HEPES، 1.5 ملي نا ₂ هبو _4، ودرجة الحموضة 7،01-7،05). المزيج بلطف عن طريق الحقن الهواء ثلاث مرات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
10. احتضان هذا المزيج لمدة 30 دقيقة في RT. إضافة ببطء قطرة من الحكمة 200 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى كل لوحة وتستنهض الهمم عبر الحكمة. نقل لوحات عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 16 ساعة.
11. في اليوم التالي، شطف الخلايا مرتين مع 2 مل HEPES الدافئة (6.7 ملي بوكل، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3) وإضافة 2 مل مارك ألماني. تصور infeكفاءة ction تحت مجهر فلوري مقلوب في التكبير من 20-40X (الهواء) والحصول على ثلاث صور تمثيلية في حالة في كل القنوات الفلورسنت ونقل عن الوثائق.
12. وفقا لإعداد التجربة المطلوبة، اتبع التمايز في myotubes لعدة أيام. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة وتعرض بعد ذلك إلى تحليل المناعي أو دراسات التصوير الخلية الحية لا يمكن أن يؤديها.

النتائج

وارتبط ترنسفكأيشن البلازميد الحمض النووي BAG3-GFP باستخدام الدهون الموجبة مع التعبير غير متجانسة في خلايا هيلا، بعض الخلايا التي تبين مستويات يصعب رصدها بسهولة من البروتين وغيرها تحمل مستويات عالية جدا من BAG3 (الشكل 2A). في هذه الخلايا، ودل ?...

Discussion

هنا، وصفنا طريقة تمكين التجارب استنزاف الانقاذ التي يتعين القيام بها، والتي تنطبق على تحليلات وظيفية عمليات الخلية البيولوجية التي هي حساسة بشكل خاص للoverexpression من البروتينات التي تؤثر على العناصر المتفاعلة وديناميات البروتين المجمعات والمنشآت الجزيئات. انقسام الخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046