Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

Resumo

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Resumo

Os processos celulares tais como a mitose e diferenciação das células são regulados por mudanças na forma das células que largamente dependem da remodelação adequada das estruturas do citoesqueleto celular. Isto envolve a montagem-desmontagem de estruturas macromoleculares de ordem superior num dado momento e localização, um processo que é particularmente sensível a perturbações provocadas pela expressão excessiva de proteínas. Métodos que podem preservar a homeostase da proteína e manter a morfologia celular perto-para-normal, são altamente desejáveis ​​para determinar a contribuição funcional de uma proteína de interesse em uma ampla gama de processos celulares. Transitórios experimentos depleção de resgate com base na interferência de RNA são abordagens poderosa para analisar as funções das proteínas e requisitos estruturais. No entanto, a reintrodução da proteína alvo com desvio mínimo a partir do seu nível fisiológico é um verdadeiro desafio. Descrevemos aqui um método denominado adenofection que foi desenvolvido para estudar o papel de um chaperonas molecularesparceiros d no funcionamento normal das células em divisão e a relação com a remodelação da actina. As células HeLa foram esgotados de BAG3 com duplex de siRNA segmentação região 3'UTR. BAG3 proteínas GFP foram reintroduzidos simultaneamente em> 75% das células utilizando adenovírus recombinantes acoplados a reagentes de transfecção. Adenofection activado para expressar proteínas BAG3-GFP em níveis fisiológicos próximos em células HeLa depletados de BAG3, na ausência de uma resposta de stress. Não se observou qualquer efeito sobre os níveis de proteína de choque térmico chaperonas endógenos, os principais reguladores de stress-indutível da proteína homeostase. Além disso, por adição de baculovirus conduz a expressão de marcadores fluorescentes no momento da transdução de células-transfecção, que poderia dissecar dinâmica de células mitóticas por microscopia de lapso de tempo analisa com perturbação mínima de progressão mitótica normal. Adenofection é aplicável também para células de difícil infectar rato, e adequado para análises funcionais de diff mioblastoserentiation em miotubos. Assim adenofection proporciona um método versátil para efectuar análises de estrutura-função de proteínas envolvidas em processos biológicos sensíveis que dependem da dinâmica do citoesqueleto de ordem superior.

Introdução

inactivação funcional da expressão do gene em células de mamífero é o padrão de ouro para dissecar as funções das proteínas. Recém-desenvolvidas tecnologias de edição genoma com base no uso de nucleases específicas do local, tais como nucleases de dedos de zinco e agrupados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CAS9 agora permitem a geração de linhagens celulares com deleção do gene alvejado e mutação ^1,2. Estas novas abordagens devem revolucionar a forma como estamos a estudar a função da proteína e da nossa compreensão da genética de doenças humanas. Em alguns casos, no entanto, a longo prazo ou nocaute do gene completo não é desejável e pode provocar mecanismos de compensação de células secundárias. A geração de linhas de células geneticamente modificadas, podem também ser limitante quando se lida com as culturas de células primárias com capacidade de proliferação limitada, ou quando o rastreio de um grande conjunto de mutações em vários tipos de células é procurado. Este é muitas vezes necessária para determinar a dependência de uma célula bprocesso iological sobre os requisitos estruturais de uma proteína. Para o efeito, knockdown reversíveis por interferência de RNA que permite experiências de depleção de resgate transitórios em várias origens celulares continua a ser uma abordagem simples e poderoso para efectuar análises de estrutura-função de uma proteína de interesse ^3. No entanto, uma grande desvantagem com esta abordagem é a dificuldade de atingir e silenciamento eficiente para reintroduzir a proteína de interesse ou suas variantes em níveis fisiológicos próximos na maioria da população de células. Este aspecto é crucial para permitir estudos exaustivos que tentativa de correlacionar os efeitos funcionais observadas no nível de células individuais (fenótipo hipomórfico) com aqueles observados em ensaios baseados em população de células, por exemplo, em interacções proteína-proteína.

Usando métodos de transfecção clássicos, dificilmente se pode conseguir a expressão homogênea e baixa de proteínas exógenas em uma grande população de células. A transdução de células com vírus recombinantescomo adenovírus muitas vezes permite a expressão mais normalizado de proteínas exógenas. No entanto, a absorção de adenovírus é limitado pelo receptor de carro, que está ausente em células não-humanos ou apenas fracamente expresso em alguns tipos de células humanas. Além disso, a entrada celular de adenovírus activa as vias que regulam a forma da célula e adesão ^4-6 sinalização. Isso obviamente não é desejável quando se estuda mecanismos reguladores da morfodinâmica celulares. Nós voltado para esta problemática quando realizamos análises funcionais de um complexo acompanhante, BAG3-HSPB8, na divisão celular e da dinâmica de actina. Trabalho pioneiro havia descrito um papel para este complexo acompanhante no controle de qualidade de proteínas e autofagia durante o estresse ^7,8. A maioria destes estudos, no entanto, a sobre-expressão da proteína invocado, assumindo que as chaperonas são normalmente regulada positivamente durante o stress. Isso deixou em aberto a questão de saber se BAG3, em complexo com HSPB8, pode contribuir para o normal funcionamento das células em divisão expressando thchaperones ese como muitos tipos de células cancerígenas ^9. Em particular, se o complexo acompanhante contribui para a remodelação das estruturas de actina que controlam a progressão mitótico foi de grande interesse, dadas as conexões emergentes entre chaperones HSPB e dinâmica do citoesqueleto ^10. Para abordar esta questão, estávamos buscando desenvolver um método eficiente para experimentos depleção de resgate que não iria interferir com a progressão da mitose ou morfologia celular, e que preservar a homeostase da proteína para evitar a perturbação secundária da dinâmica dos complexos macromoleculares regulação celular em forma de mudanças . Assim, idealmente, a depleção de complemento de trás do gene de interesse sejam realizadas simultaneamente.

O uso de complexos de adenovírus com um polímero catiónico ou lípidos tem sido descrito para promover a transferência de genes in vitro e in vivo ^11,12. Por exemplo, fosfato de cálcio (CAPI) aparece para formar um precipitado comadenovírus que melhoram a ligação do vírus-entrada através de uma via independente de CAR ^13. Com efeito, verificou-se que a combinação de transdução de células com base em adenovírus e transfecção com compostos catiónicos podem melhorar a eficiência dos experimentos depleção de salvamento. Isto permitiu-nos reduzir as quantidades de vírus por de 3 a 20 vezes, dependendo da linha de células e o gene de interesse, e beneficiar de uma janela mais larga de modo a ajustar a expressão de proteínas exógenas com níveis próximos endógenas na maioria de uma população de células de interesse com o mínimo impacto sobre a morfologia celular. Sob tais condições, que também pode alcançar uma elevada eficiência de knockdown da expressão da proteína endógena (> 75%). Pela presente, descrevem o método de passo a passo e fornecem evidências de que a homeostase da proteína não é significativamente perturbados como avaliado pelos níveis inalterados de chaperonas induzidas pelo stress da família de proteínas de choque de calor, tornando o método apropriado para análises funcionais do ro fisiológicole de chaperones moleculares por microscopia de lapso de tempo vídeo. O protocolo é passível de procedimentos de sincronização de células e para a utilização de baculovírus disponíveis comercialmente para a co-expressão de baixos níveis de marcadores fluorescentes, com uma interferência mínima com a dinâmica de actina e do fuso mitótico durante a progressão normais. Mostramos ainda mais a versatilidade do método, que é aplicável a "duro" para transduzir células C2C12 de rato, sem qualquer impacto significativo sobre a diferenciação de mioblastos em miotubos in vitro.

Protocolo

1. Preparação de meios e soluções (todas esterilizada por filtração)

1. Células de músculo de rato C2C12 (estudos de diferenciação)
   1. Preparar 500 ml de Meio de Crescimento para manutenção de cultura de células C2C12: Glicose alta DMEM suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-Glutamina.
   2. Preparação de 100 ml de Diferenciação médio (DM) para a diferenciação C2C12: Glicose alta DMEM suplementado com 2% de Soro de Cavalo.
2. Células HeLa (estudos em células mitóticas)
   1. Preparar 500 ml de aMEM HeLa RFP-H2B manutenção de cultura de células e experimentos: aMEM suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina (aMEM ^10%).
   2. Preparar 500 ml aMEM-menos (sem Desoxirribonucleosídeos / ribonucleósidos) para a sincronização de células HeLa RFP-H2B: aMEM-minus suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-glutamina (aMEM-menos ^10%).
   3. Prepare 20 ml aMEM sem vermelho de fenol para HeLa-RFP-H2B laquisição de células ive: aMEM sem vermelho de fenol suplementado com 10% de FBS e 2 mM de L-Glutamina.
   4. Prepare timidina 100 mM: dissolver 24,2 mg em 1 ml _{de H2O} a 37 ° C por agitação em vórtex. Filtro de esterilizar e manter a 4 ° C.
3. soluções comuns
   1. Prepare a 0,05% de tripsina / EDTA: 0,05% de tripsina, EDTA a 0,625 mM em solução salina de fosfato tamponada 1x (PBS). Filtro de esterilizar e alíquotas armazenar a -20 ° C. Uma vez descongelado, manter a alíquota a 4 ° C.
   2. Prepare HBS2x: NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4. Ajustar o pH exactamente entre 7,01-7,05 com NaOH 10 N. Filtrar em condições estéreis e manter a 4 ° C.

2. Revestimento de placas de cultura celular com fibronectina e chapeamento de células HeLa-RFP-H2B

NOTA: Antes do experimento, cada manipulador deve definir-se as condições óptimas de revestimento de células para atingir uma densidade de células adequada desde variações podem oCcur entre cada manipulador e cada linha celular diferente.

1. O dia antes da experiência, expandir as células de HeLa-RFP-H2B para se certificar de que eles estão dentro da fase exponencial de crescimento no dia de plaqueamento. Faça 2 sucessivas diluições de 1/3 em placas de 10 cm a partir de um confluente 1x10 cm placa de 80%.
   NOTA: Planejar o número de placas para o experimento. Calcular cada condição como duplicados, um para processamento de imagem de células vivas de curto prazo e um para a proteína extrai para determinar a eficácia de knockdown e expressão de proteína exógena por análise de Western blot. Planejar uma placa adicional para determinar o número de células antes da transdução de vírus.
2. Antes da célula de galvanização, revestimento de vidro de fundo pratos com 10 ug / ml de fibronectina. Adicionar 1 ml de uma diluição 1: 100 de 1 mg / mL de fibronectina (estéril diluído em PBS 1x) por 35 milímetros prato para assim cobrir toda a superfície e incuba-se durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Durante a incubação, aMEM pré-quente suplementado with 10% de FBS (aMEM ^10%) e 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C.
4. Após 45 min de incubação, começar a preparação da solução de células. Na capa estéril, aspirar o meio a partir de uma placa de 10 cm, lavar cuidadosamente duas vezes com 1,5 ml de 0,05% de tripsina / EDTA, e deixar 0,5 ml de tripsina / EDTA a última aspiração.
5. Incubam-se as células durante 2-3 minutos a 37 ° C, 5% de CO _2. Ao tocar suavemente a placa e observação ao microscópio, verifique se todas as células foram removidas. Adicionar 10 ml de aMEM ^10% e pipeta suavemente várias vezes para separar as células. Contagem de uma amostra de 10 uL da suspensão de células utilizando um hemocitómetro.
6. solução de fibronectina aspirado dos pratos com fundo de vidro. Não permita que a fibronectina para secar antes do plaqueamento celular.
7. Placa ⁵ 1,5x10 células por placa de 35 mm em 2 ml de aMEM ^10% e incubar a 37 ° C, 5% de CO _2. Verifique após 30-45 min ao microscópio as células que são bem SEPAnominal, uma vez que têm a tendência a acumular-se no centro da placa.
8. Se necessário, agitar as placas suavemente transversalmente para redistribuir as células. Placa de uma placa 35 milímetros adicional para o número de condições, a fim de contar o número de células antes da transdução de vírus.
9. Crescer as células até ao dia seguinte para alcançar uma densidade celular de pelo menos 50%. Uma densidade celular inferior a 50% resulta em uma diminuição significativa da eficiência de transdução de vírus, aumentou variações de expressão da proteína por célula, e um aumento da toxicidade celular.
   NOTA: Revestimento de pratos de vidro com fibronectina melhora o crescimento e morfologia celular e promove a progressão adequada de células através de mitose. Geralmente pode ser substituído por gelatina disponíveis comercialmente que é mais barato.

3. Adenovirus Transdução e proteína endógena Knockdown por siRNA transfecção em células HeLa-RFP-H2B Usando Capi precipitados

Cuidado! Trabalhoing com vírus exige precauções especiais e uma eliminação adequada de todo o material que tem estado em contacto com o vírus.

Cuidado! Em nossas mãos, Capi precipita muitas vezes têm mais efeitos indesejáveis, por exemplo, em processos biológicos que envolvem tráfico de vesículas (por exemplo, a autofagia). Por conseguinte, recomenda-se usar um reagente de transfecção lípido catiónico (ver abaixo) e para esperar, pelo menos, 48 ​​horas antes das análises.

NOTA: Um adenovirus de controlo que transporta um gene relacionado (ou seja, LacZ) ou nenhum gene é usado para chegar a uma MOI mínima em todas as Adenofections (10-20 pfu / célula) usando a menor quantidade de adenovírus recombinante que transporta o gene de interesse.

NOTA: Este procedimento tem sido mostrado para ajudar a expressão normalizando por célula em uma população de grandes células.

1. Um dia após o plaqueamento de células, contar o número de células a partir do prato plaqueadas adicional. Aspirar o meio elavar uma vez com 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. Adicionar novamente 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C, 5% de _CO2 até que todas as células têm destacado. Separaram-se as células de poços utilizando uma pipeta de 1 ml e contar o número de células por ml, utilizando um hemocitómetro.
2. Determinar a quantidade de vírus necessária para transduzir as células com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 2 unidades formadoras de placas (PFU) de a proteína de interesse (POI) por célula e 18 PFU por célula de um vector vazio (por exemplo, LacZ) para ter um total de 20 PFU por célula. Ao mesmo tempo transduzir 4 UFP de cada baculovírus (actina e αTubulin, respectivamente GFP e marcaram-RFP). Transduzir as células utilizando o seguinte protocolo adenofection. Os vírus foram utilizados como descrito em Fuchs et al ^14.
3. Prepare em uma capa estéril um tubo de plástico de 1,5 ml para cada condição e adicionar 400 mL de aMEM-menos quente ^{de 10%.}
4. Descongelar uma aliquota dos vírus lentamente sobre gelo e, se necessário, diluir tEle estoque de vírus, a fim de pipetar um volume superior a 1 ml para minimizar erros de pipetagem.
5. Adicionar a quantidade calculada de vírus por condição a cada tubo de plástico de 1,5 ml contendo 400 aMEM-minus ul ^10% e misture delicadamente por pipetagem. Colocar o stock de virus imediatamente de volta a -80 ° C para manter a sua actividade.
6. Aspirar o meio das células e gentilmente pipeta a mistura gota a gota ao vírus. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ e agita-se cuidadosamente as placas sob o capô estéril a cada 15 minutos durante 1 hora para assim cobrir as células com o vírus. Utilizando uma pequena quantidade de meio facilita o contacto do vírus com as células.
7. Após a incubação, gentilmente pipeta 1,6 ml de aMEM-menos ^10% para cada uma das placas para obter um volume total de 2 mL, iniciar a sincronização de células por adição de timidina de 2 mM e incuba-se as células durante mais 2 h a 37 ° C, 5% de CO ₂ .
8. Enquanto isso, prepare as followi transfecção mistura siRNAng o método de transfecção Capi (veja a Figura 1). Se não siARN é necessário, substituir a quantidade de ARNsi por água esterilizada para executar uma transfecção vazio.
9. Calcular 200 ul de mistura para cada condição, resultando em 400 ul por duplicado. O exemplo seguinte é dado para uma concentração final de 50 siARN nM e tem de ser adaptada a cada uma das proteínas de interesse. Em um tubo de plástico de 1,5 ml, pipeta de 50 mL 1 M CaCl ₂ e 11 ul 20 mM siRNA em 139 mL H ₂ O estéril e misturar em vortex. Depois de um giro rápido, adicione cuidadosamente gota a gota 200 mL HBS2x (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05).
   NOTA: Quanto menor as gotas do mais pequenos são os precipitados, resultando em melhor eficiência de transfecção. Misture suavemente três vezes por injeção de ar usando um ul-pipeta 200.
10. Incubar a mistura durante 30 min à TA. Lentamente, adicionar gota a gota 200 mL de mistura de transfecção a cada placa eagite cross-wise. Transferir as placas a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 16 horas.
11. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com 2 ml de HEPES quentes (KCl 6,7 mM, NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) e adiciona-se 2 ml de aMEM-menos ^10%. Não prossiga com mais de quatro placas da célula de cada vez porque as variações na temperatura afectar a duração do ciclo celular.
12. Visualize a eficiência de infecção sob um microscópio de fluorescência invertido com uma ampliação de 20-40x (ar) e adquirir três imagens representativas por condição em ambos os canais fluorescentes e transmissão de documentação. Sete horas depois, adicionar timidina 2 mM e incuba-se durante mais 16 h a 37 ° C, 5% de CO _2.
13. No dia seguinte, 48 h após siARN transfecção e infecção por vírus, lavar as células duas vezes com 2 ml quente solução salina de tampão fosfato (PBS) e solte durante 7 horas em 2 ml de aMEM ^10% w / o Vermelho de Fenol para imagens de células vivas ou com fenol vermelho para extração de proteínas.
14. Células colheita para cada condição de 48 horas pós-transfecção para a preparação de extractos de proteína e a análise de transferência de Western para determinar a eficiência de knockdown e a expressão da proteína endógena ^15.
    NOTA: Use anticorpos contra a proteína de interesse, bem como anticorpos apropriados que servem como controle de carga. A eficiência de knockdown deve ser determinada pelo carregamento de quantidades decrescentes de lisados ​​de células de controlo (transfectadas com ARNsi de controlo), para proporcionar uma curva de titulação (ou seja, 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transdução e proteína endógena Knockdown por siRNA transfecção em células HeLa Usando um catiônico Lipid Transfection Reagent

NOTA: Aqui nós apresentamos um protocolo que foi adaptado para experiências que não envolvem a sincronização das células e / ou quando o siARN transfecção não pode ser realizada pelo método Capi, por exemplo, para evitar efeitos tóxicos indesejáveis ​​em algumas células Lines. Este protocolo também inclui um passo replating celular após adenofection a fim de trabalhar com uma densidade celular adequada. Nós só ter testado o reagente de transfecção lipídica catiônica.

Cuidado! Trabalhando com vírus exige precauções especiais e uma eliminação adequada de todo o material que tem estado em contacto com o vírus.

1. Placa de 1,75 x 10 ⁵ células por 35 milímetros prato em 2,5 ml de aMEM ^10% e incubar a 37 ° C, 5% de CO _2. Placa de uma placa 35 milímetros adicional para o número de condições, a fim de contar o número de células antes da transdução de vírus.
2. Crescer as células até ao dia seguinte para alcançar uma densidade celular de pelo menos 50%. Uma densidade celular de menos do que 50% resulta em uma diminuição significativa da eficiência de transdução de vírus, aumentou variações de expressão da proteína por célula, e um aumento da toxicidade celular.
3. Um dia após o plaqueamento de células, contar o número de células a partir do prato plaqueadas adicional. Aspirara forma e lavar uma vez com 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA. Adicionar novamente 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C, 5% de _CO2 até que todas as células têm destacado. células separadas poço utilizando uma pipeta de 1 ml e contar o número de células por ml.
4. Determinar a quantidade de vírus necessária para transduzir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20-40 unidades formadoras de placas (PFU) de a proteína de interesse (POI) por célula e 0-20 pfu por célula de um vector vazio (por exemplo, LacZ) para ter um total de 40 PFU por célula.
5. Prepare em uma capa estéril um tubo de plástico de 1,5 ml para cada condição e adicionar 400 mL de aMEM quente ^{de 10%.}
6. Descongelar uma aliquota dos vírus lentamente sobre gelo e, se necessário, diluir a reserva de vírus, de modo a pipetar um volume maior do que 1 ml para minimizar erros de pipetagem.
7. Adicionar a quantidade de vírus calculada por condição a cada tubo de plástico de 1,5 ml contendo 400 ul aMEM ^10% e misture delicadamente por pipetagem. º lugare vírus da imediatamente de volta a -80 ° C para manter a sua actividade.
8. Aspirar o meio das células e gentilmente pipeta a mistura gota a gota ao vírus. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ e agita-se cuidadosamente as placas sob o capô estéril a cada 15 minutos durante 1 hora para assim cobrir as células com a diluição do vírus. Utilizando uma pequena quantidade de meio facilita o contacto do vírus com as células.
9. Ao mesmo tempo, preparar a mistura de transfecção siRNA seguindo o método de transfecção. Se não siARN é necessário, substituir a quantidade de ARNsi por meio sem soro para executar uma transfecção vazio.
   1. O exemplo seguinte é dado para uma concentração final de 50 siARN nM e tem de ser adaptada a cada uma das proteínas de interesse. Para cada adenofection, preparar um tubo de plástico de 1,5 ml contendo 416 nM de ARNsi em 150 ul de meio sem soro (por exemplo, 6,25 mL de 20 um siRNA + 144 ul de meio sem soro) e um tubo de 1,5 ml containi plástico6,25 ng ul reagente de transfecção catiónico lípido + 144 ul de meio sem soro.
   2. Misturar o conteúdo de cada tubo de plástico por pipetagem para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 200 uL. Combine o conteúdo de ambos os tubos e misture pipetando cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 200 mL. Incubar durante 5 min à TA.
10. Após a incubação com o virus, gentilmente pipeta 1,8 ml de aMEM ^10% a cada placa para obter um volume total de 2,2 ml e imediatamente adicionar lentamente gota a gota, a mistura de transfecção a cada placa de siRNA e agita-se transversalmente. Transferir as placas a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 24 horas.
11. No dia seguinte, re-placa das células de cada placa de 35 milímetros em quatro novas placas de 35 mm em 2,5 ml de aMEM ^10% cada um e incubar durante 24 horas adicionais a 37 ° C, 5% de CO _2.
12. No dia seguinte, 48 h após a transfecção siRNA e infecção por vírus, células de colheita a partir de uma placa para cada uma das condições para a preparação deextractos de proteína e a análise de transferência de Western para determinar a eficiência de knockdown e a expressão da proteína endógena ^15.
    NOTA: Com as placas restantes, continue com a fixação das células, utilizando o protocolo de escolha e submeter as amostras para análise de imunofluorescência com os anticorpos de interesse ^14.

5. Imagens de células vivas das células mitóticas e Análise de Dados

1. Realizar experimentos com imagens de células vivas de curto prazo sobre células mitóticas com um microscópio invertido equipado com uma câmara úmida / 5% de CO ₂ / regulada por termo.
   Nota: Neste estudo, foi utilizado um microscópio confocal de disco giratório (40X, 0,75 NA), equipado com um EMCCD arrefecida câmara de carga acoplada à temperatura de -50 ° C.
2. Antes da aquisição, verificar que a câmara tenha atingido a temperatura apropriada de 37 ° C.
   NOTA: Este processo pode demorar várias horas, dependendo do sistema microscópico.
3. Coloque as placas de cultura no micrcâmara oscope 1 h antes de aquisição para permitir o equilíbrio adequado do meio e evitar deriva foco devido a mudanças de temperatura. Monitorizar o estado mitótico das células. Neste ponto, 10-15% das células devem ser nas fases iniciais da mitose (profase-prometáfase).
4. Durante o tempo de equilíbrio, configurar os parâmetros de aquisição, conforme determinado em experiências anteriores. Tipicamente, um tempo de exposição para os dois canais (488 e 594) de 0,2-3 seg com uma intensidade do laser de 100% e uma sensibilidade de 121-130 são parâmetros apropriados nas nossas mãos.
   NOTA: primeiros testes devem ser feitos para determinar a mínima intensidade do laser e na aquisição de tempo / intervalo que resultam em uma resolução apropriada com fotobranqueamento mínimo que provoca danos celulares e perturba a progressão mitótico.
5. Escolha vários campos por condição para obter um número significativo de células a analisar, sem exceder o intervalo de aquisição. Usando um sistema confocal disco giratório, uma configuração típica será nocluir quatro condições diferentes, 7 campos por placa e 2 canais de cor (488 e 594) com um intervalo de 1,5-2 min durante um min-período 75.
6. Escolha as células que estão na entrada mitótico, re-definir o foco de uma vez todos os campos foram escolhidos e começar a aquisição o mais rápido possível.
7. Monitorar a estabilidade do sistema para, pelo menos, três pontos de tempo e re-ajustou-se o foco se necessário.
8. Após a primeira imagem de células vivas de curto prazo de 75 min, os novos campos de células mitóticas pode ser escolhido para adquirir um segundo conjunto de filmes para aumentar o número de células a ser analisadas.
9. Determinar critérios bem definidos para analisar os fenótipos de células mitóticas, o que dependerá dos marcadores fluorescentes sendo usado. Defeitos na mitose podem incluir o tempo gasto na mitose prolongada (de colapso nuclear até anaphase), o desalinhamento cromossomo, balanço do eixo, e no córtex formação de bolhas ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus Transdução em Differentiating C2C12 mouse mioblastos

NOTA: O protocolo adenofection também é aplicável a mioblastos de rato C2C12 difíceis de infectar submetidos a diferenciação.

1. Placa de 2 x 10 ⁵ células C2C12 em placas de cultura de 35 mm em meio de crescimento sobre plástico ou sobre um substrato de escolha.
   NOTA: a diferenciação celular é melhorada em pratos gelatine- ou revestidos por Matrigel. Planejar uma placa adicional para determinar o número de células antes da transdução de vírus.
2. No dia seguinte, as células atingiram 80% de confluência. Induzir a diferenciação de mioblastos de lavagem das células duas vezes com PBS morno e adição de 2 ml de meio de diferenciação (DM).
3. No dia seguinte, marcado como o dia 1 (D1) da diferenciação, transduzir miócitos com adenovírus LifeAct-TagGFP2 para visualizar o citoesqueleto de actina em células vivas. Contar o número de células a partir da placa adicional, tal como descrito em 3.2. Calcular 5 UFP / célula de adenovirus LifeAct-TagGFP2 AdLacZ e / célula 45 PFU após o examePLE descrito na Tabela 1. A quantidade de vírus total é de 50 UFP / célula. Os vírus foram utilizados como descrito ¹⁴
4. Prepare em uma capa estéril um tubo de plástico de 1,5 ml para cada condição e adicionar 400 mL de DM quente.
5. Descongelar uma aliquota dos vírus lentamente sobre gelo e, se necessário, diluir a reserva de vírus, de modo a pipetar um volume maior do que 1 ml para minimizar erros de pipetagem.
6. Adicionar a quantidade apropriada de partículas de vírus por condição a cada tubo de plástico de 1,5 mL contendo 400 uL de DM e misturar suavemente por pipetagem. Colocar o stock de virus imediatamente de volta a -80 ° C para manter a sua actividade.
7. Aspirar o meio dos pratos e gentilmente pipeta a mistura de vírus gota a gota. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ e agita-se cuidadosamente as placas sob o capô estéril a cada 15 min durante um total de 1 h, para assim cobrir as células com o vírus.
8. Após a incubação, gentilmente pipeta 1,6 ml de DM em cada prato e continuar a incubation durante mais 2 horas adicionais a 37 ° C, 5% de CO _2.
9. Enquanto isso, prepare uma mistura de transfecção vazio seguindo o método de transfecção Capi. Calcular 200 uL de mistura para cada condição. Utilizar o seguinte exemplo, para um volume total de 400 uL de mistura.
   1. Em um tubo de plástico de 1,5 ml, pipeta de 50 mL 1 M _{de CaCl2} em 150 ml de H ₂ O estéril e misturar em vortex. Depois de um giro rápido, adicione cuidadosamente gota a gota 200 mL HBS2x (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05). Misture delicadamente por injeção de ar três vezes com uma pipeta de 200 mL.
10. Incubar a mistura durante 30 min à TA. Adicione lentamente gota a gota 200 ul da mistura de transfecção a cada placa e agite cross-wise. Transferir as placas a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 16 horas.
11. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com 2 ml de HEPES quentes (KCl 6,7 mM, NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) e adiciona-se 2 mL de DM. Visualize a INFEeficiência ction sob um microscópio de fluorescência invertido com uma ampliação de 20-40X (ar) e adquirir três imagens representativas por condição em ambos os canais fluorescentes e transmissão de documentação.
12. Dependendo da configuração da experiência desejada, siga diferenciação em miotubos por vários dias. As células podem ser fixadas e, posteriormente, submetidos a uma análise de imunofluorescência ou estudos de imagem de células vivas pode ser realizada.

Resultados

A transfecção de ADN do plasmídeo BAG3-GFP usando lípidos catiónicos foi associado com expressão heterogénea em células HeLa, células que apresentam alguns níveis quase indetectáveis ​​da proteína e outras com níveis muito elevados BAG3 (Figura 2A). Nestas células, a perda da homeostase proteína foi evidenciado pela acumulação de BAG3-GFP em agregados perinuclear (Figura 2A, setas). Em contraste, a transdução de células com adenov...

Discussão

Aqui, foi descrito um método que permite técnicas de depleção de resgate a ser executada, o que é aplicável para análises funcionais dos processos celulares biológicas que são particularmente sensíveis à sobre-expressão de proteínas que afectam a estequiometria e a dinâmica de complexos de proteínas e estruturas macromoleculares. divisão celular mitótico é um exemplo extremo de morfodinâmica celulares afinado que envolve os mais dramáticos e espetaculares mudanças na estrutura global de uma célula....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046