Adenofection: eine Methode zur Untersuchung der Rolle von molekularen Chaperonen in Cellular Morphodynamik von Depletion-Rettungs-Experimente

Zusammenfassung

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Zusammenfassung

Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Mitose und Zelldifferenzierung werden durch Änderungen in der Zellform bestimmt, die auf die richtige Remodellierung der Zell Zytoskelettstrukturen weitgehend verlassen. Dabei wird die Montage-Demontage von höherer Ordnung makromolekulare Strukturen zu einem bestimmten Zeitpunkt und Ort, ein Vorgang, der besonders empfindlich gegenüber Störungen durch die Überexpression von Proteinen verursacht wird. Methoden, die Protein-Homöostase und aufrechtzuerhalten in der Nähe zu normalen Zellmorphologie sind höchst wünschenswert, um zu bestimmen die funktionelle Beitrag eines Proteins von Interesse in einer Vielzahl von zellulären Prozessen erhalten kann. Transient Verarmungsrettungsversuche auf Basis von RNA-Interferenz sind leistungsfähige Ansätze Proteinfunktionen und strukturellen Anforderungen zu analysieren. Allerdings Wiedereinführung des Zielproteins mit minimalen Abweichung von seiner physiologischen Ebene ist eine echte Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode genannt adenofection das entwickelt wurde, um die Rolle von molekularen Chaperonen zu studieren eind Partner in dem normalen Betrieb von sich teilenden Zellen und die Beziehung mit Aktin-Umbildung. HeLa-Zellen wurden von BAG3 verarmt mit siRNA-Duplexe die 3'UTR Region abzielt. unter Verwendung von rekombinanten Adenoviren gekoppelt Transfektionsreagenzien GFP-markierten BAG3 Proteine ​​wurden gleichzeitig in> 75% der Zellen wieder eingeführt. Adenofection aktiviert BAG3-GFP-Proteine ​​bei nahezu physiologischen Konzentrationen in HeLa-Zellen verarmt BAG3, in Abwesenheit eines Stressreaktion auszudrücken. Es wurde keine Wirkung auf den Ebenen der endogenen Heat Shock Protein Chaperone beobachtet, den Stress-induzierbaren Regulatoren der Protein-Homöostase. Weiterhin kann durch Baculoviren Antreiben der Expression von fluoreszierenden Markern zum Zeitpunkt der Zell Transduktion-Transfektion Zugabe konnten wir mitotischen Zelldynamik durch Zeitraffer mikroskopische Analysen sezieren mit minimaler Störung der normalen mitotischen Progression. Adenofection ist auch auf schwer zu Infect Mauszellen, und geeignet für die funktionelle Analyse von Myoblasten differenzierung in Myotuben. So bietet adenofection eine vielseitige Methode Struktur-Funktion in sensiblen biologischen Prozessen beteiligten Proteine ​​Analysen durchzuführen, die auf höherer Ordnung Dynamik des Zytoskeletts verlassen.

Einleitung

Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugerzellen ist der Goldstandard Proteinfunktionen zu sezieren. Neu entwickelte Technologien der Genom Bearbeitung ^1,2 kurz über die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen wie Zink-Finger - Nukleasen und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS9 erlauben nun die Generierung von Zelllinien mit gezielten Gen - Deletion und Mutation basiert. Diese neuen Ansätze sollten revolutionieren die Art, wie wir die Proteinfunktion und unser Verständnis der Genetik von Krankheiten beim Menschen studieren. In einigen Fällen ist nicht wünschenswert, langfristige oder vollständige Gen-Knockout jedoch und kann Sekundärzelle Kompensationsmechanismen hervorrufen. Die Erzeugung von gentechnisch veränderten Zelllinien können auch Begrenzungs sein, wenn sie mit primären Zellkulturen mit begrenzter Proliferationskapazität handelt, oder wenn Screening einer großen Gruppe von Mutationen in verschiedenen Zelltypen gesucht wird. Dies wird oft zur Bestimmung der Abhängigkeit einer Zelle b erforderlicheiologische Prozess auf strukturellen Anforderungen eines Proteins. Zu diesem Zweck reversible Knockdown durch RNA - Interferenz , die noch transiente Depletion-Rettungsversuchen in verschiedenen zellulären Hintergründen ermöglicht weiterhin eine einfache und leistungsstarke Ansatz zur Durchführung Struktur-Funktion eines Proteins von Interesse ³ analysiert. Allerdings ist ein großer Nachteil bei diesem Ansatz die Schwierigkeit, effiziente Silencing zu erreichen, und das Protein von Interesse oder seine Varianten in der Nähe von physiologischen Konzentrationen in einer Mehrheit der Zellpopulation wieder einführen. Dies ist entscheidend, umfassende Studien zu ermöglichen, die funktionelle Effekte auf der Ebene einzelner Zellen (hypomorphen Phänotyp) mit denen in populationsbasierten Zellassays gesehen zu korrelieren versuchen, zum Beispiel auf Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Mit klassischen Transfektionsverfahren, kann man kaum erreichen homogene und niedrige Expression von exogenen Proteinen in einer großen Population von Zellen. Transduktion von Zellen mit rekombinanten Virenwie Adenoviren können oft mehr normalisierte Expression von exogenen Proteinen. Doch Adenovirus Aufnahme wird durch den CAR-Rezeptor begrenzt, die in nicht-menschlichen Zellen fehlt oder nur schwach in einigen menschlichen Zelltypen exprimiert. Darüber hinaus aktiviert die Zelleintritt von Adenoviren Signalwege , die Zellform und Haftung ^4-6 regulieren. Dies ist natürlich nicht wünschenswert, wenn regulatorische Mechanismen der Zell Morphodynamik studieren. Wir waren mit Blick auf diese Problematik, wenn wir funktionelle Analysen eines Chaperon-Komplex unternahm, BAG3-HSPB8, bei der Zellteilung und Aktindynamik. Pionierarbeit hatte eine Rolle für dieses Chaperon - Komplex in der Proteinqualitätskontrolle und Autophagie bei Stress ^7,8 beschrieben. Die meisten dieser Studien stützte sich jedoch auf die Proteinexpression unter der Annahme, dass die Chaperone normalerweise während Stress aufreguliert werden. Dies hat die Frage offen gelassen, ob BAG3, im Komplex mit HSPB8 kann zum normalen Betrieb von sich teilenden Zellen beitragen th exprimierendenese Chaperone wie ⁹ viele Krebszelltypen. Insbesondere ob trägt das Chaperon - Komplex auf den Umbau des Aktin-basierten Strukturen , die mitotischen Progression von großem Interesse war kontrollieren, ¹⁰ die Schwellen Verbindungen zwischen HspB Chaperone und Zytoskelett Dynamik gegeben. Um dieses Problem zu beheben, suchten wir ein effizientes Verfahren zur Depletion-Rettungsversuche zu entwickeln, die nicht mit mitotischen Progression oder zelluläre Morphologie stören würde, und das würde Proteinhomöostase erhalten zur sekundären Störung der Dynamik makromolekularer Komplexe Regelzellformänderungen vermeiden . So ideal, Depletion-Add-Rückseite des Gens von Interesse sollte gleichzeitig ausgeführt werden.

Die Verwendung von Komplexen von Adenovirus mit einem kationischen Polymer oder Lipiden beschrieben wurde Gentransfer in vitro zu fördern , und in vivo ^11,12. Beispielsweise Calciumphosphat (CaPi) erscheint, um einen Niederschlag zu bilden, mitAdenovirus , die Virusbindung-Eingabe über eine CAR-unabhängigen Weg ¹³ zu verbessern. Tatsächlich fanden wir, dass Adenovirus-basierten Kombination Zell Transduktion und Transfektion mit kationischen Verbindungen könnte die Effizienz der Verarmungsrettungsexperimente verbessern. Dies ermöglichte es uns, die Mengen an Virus durch 3- bis 20-fach niedriger, abhängig von der Zelllinie und dem Gen von Interesse, und profitieren von einem breiteren Fenster, um die Expression von exogenen Proteinen in der Nähe von endogenen Konzentrationen in den meisten einzustellen einer Zellpopulation von Interesse mit minimalen Auswirkungen auf die Zellmorphologie. Unter diesen Bedingungen konnten wir auch hohe Effizienz Knockdown endogener Proteinexpression (> 75%) erzielen. Wir beschreiben hiermit das Verfahren Schritt für Schritt und belegen , dass Proteinhomöostase nicht signifikant , wie durch den unveränderten Stress-induzierten Chaperone des Hitzeschockproteinfamilie beurteilt gestört wird, wodurch das Verfahren geeignet für die funktionelle Analyse des physiologischen role von molekularen Chaperonen durch Zeitraffervideomikroskopie. Das Protokoll ist zugänglich Zellensynchronisationsverfahren und die Verwendung von handelsüblichen Baculoviren für die Coexpression von geringen Mengen an Fluoreszenzmarkern, mit minimaler Beeinträchtigung der normalen Aktin-basierten und Spindeldynamik während der mitotischen Progression. Wir zeigen die Vielseitigkeit des Verfahrens, die anwendbar ist , Maus C2C12 - Zellen "schwer zu transduzieren", ohne erhebliche Auswirkungen auf die Myoblastendifferenzierung in Myotuben in vitro.

Protokoll

1. Herstellung von Medium und Lösungen (alle steril filtriert)

1. C2C12 Maus Muskelzellen (Differenzierung Studien)
   1. Bereiten Sie 500 ml Wachstumsmedium für C2C12 Zellkulturpflege: DMEM Hohe Glucose, ergänzt mit 10% FBS und 2 mM L-Glutamin.
   2. Bereiten Sie 100 ml Differenzierungsmedium (DM) für C2C12 Differenzierung: DMEM mit hohem Glucose ergänzt mit 2% Pferdeserum.
2. HeLa - Zellen (Studien in mitotischen Zellen)
   1. Bereiten 500 ml & agr; MEM für HeLa RFP-H2B Zellkulturerhaltungs und Experimente: & agr; MEM mit 10% FBS ergänzt und 2 mM L-Glutamin (& agr; MEM ^10%).
   2. Bereiten Sie 500 ml & agr; MEM-Minus (ohne Desoxyribonukleoside / Ribonukleosiden) für HeLa - RFP-H2B Zellsynchronisation: & agr; MEM-Minus mit 10% FBS und 2 mM L-Glutamin (& agr; MEM-minus ^10%).
   3. Es werden 20 ml & agr; MEM ohne Phenolrot für HeLa-RFP-H2B live Zelle Erwerb: & agr; MEM ohne Phenolrot mit 10% FBS und 2 mM L-Glutamin ergänzt.
   4. Herstellung von 100 mM Thymidin: Man löst 24,2 mg in 1 ml H ₂ O bei 37 ° C durch Vortexen. Filter sterilisieren und halten bei 4 ° C.
3. Gemeinsame Lösungen
   1. Bereiten 0,05% Trypsin / EDTA: 0,05% Trypsin, 0,625 mM EDTA in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Filter zu sterilisieren und zu speichern Aliquots bei -20 ° C. Nach dem Auftauen halten aliquoten bei 4 ° C.
   2. Bereiten HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4. Der pH-Wert genau zwischen 7,01-7,05 mit 10 N NaOH. Filter steril und halten bei 4 ° C.

2. Beschichtung von Zellkulturplatten mit Fibronektin und Plating von HeLa-RFP-H2B Zellen

HINWEIS: Vor dem Experiment jeder Manipulator sollte die optimale Zellbeschichtungsbedingungen geschaffen, um eine angemessene Dichte der Zellen zu erreichen, da Variationen oc kanncur zwischen jedem Manipulator und jeder unterschiedlichen Zelllinie.

1. Am Tag vor dem Experiment, erweitern HeLa-RFP-H2B Zellen sicher zu stellen, dass sie in der exponentiellen Wachstumsphase am Tag der Plattierung sind. Machen Sie zwei aufeinanderfolgende 1/3 Verdünnungen in 10 cm-Platten ausgehend von einer 80% konfluent 1x10 cm Platte.
   HINWEIS: Planen Sie die Anzahl der Platten für das Experiment. Berechnen Sie jede Bedingung als Duplikate, eine für kurzfristige Live-Cell-Imaging und eine für Protein extrahiert die Wirksamkeit von Knockdown und exogenen Proteinexpression durch Western-Blot-Analyse zu bestimmen. Planen Sie eine zusätzliche Platte die Zellzahl vor der Virusübertragung zu bestimmen.
2. Vor der Zelle Beschichtung, Beschichtung von Glasbodenschalen mit 10 ug / ml Fibronektin. 1 ml einer 1: 100 - Verdünnung von 1 mg / ml Fibronektin (verdünnt in sterile 1x PBS) pro 35 mm - Schale zu gut die gesamte Oberfläche abzudecken und für 1 h bei 37 ° C, 5% CO ₂ inkubieren.
3. Während der Inkubation ergänzt vorwärmen & agr; MEM with 10% FBS (& agr; MEM ^10%) und 0,05% Trypsin / EDTA bei 37 ° C.
4. Nach 45 Minuten Inkubation, starten Sie die Zell-Lösung vor. In der sterilen Haube absaugen Medium aus einer 10 cm Platte, spülen Sie vorsichtig zweimal mit 1,5 ml 0,05% Trypsin / EDTA, und lassen Sie 0,5 ml Trypsin / EDTA bei der letzten Aspiration.
5. Inkubieren der Zellen für 2-3 min bei 37 ° C, 5% CO _2. Durch sanftes die Platte und die Beobachtung unter dem Mikroskop tippen, stellen Sie sicher, dass alle Zellen abgelöst worden. 10 ml & agr; MEM ^10% und Pipette vorsichtig mehrmals um die Zellen zu trennen. Zählen einer 10 ul-Probe der Zellsuspension unter Verwendung eines Hämocytometers.
6. Absaugen Fibronektinlösung aus den Glasboden Gerichte. Fibronektin darf nicht vor der Zell Beschichtung zu trocknen.
7. Platte 1,5x10 ⁵ Zellen pro 35 mm - Schale in 2 ml ^10% & agr; MEM und inkubieren bei 37 ° C, 5% CO _2. Stellen Sie sicher, nach 30-45 min unter dem Mikroskop, dass die Zellen gut sind sepabewertet, da sie die Tendenz haben, in der Mitte der Platte zu sammeln.
8. Falls erforderlich, agitieren die Platten sanft kreuzweise um die Zellen zu verteilen. Platte eine 35-mm-Platte zusätzlich zur Anzahl der Bedingungen, um die Zellzahl vor der Virusübertragung zu zählen.
9. Wachsen Zellen bis zum nächsten Tag eine Zelldichte von mindestens 50% zu erreichen. Eine Zelldichte von weniger als 50% führt zu einer signifikanten Abnahme der Virus Transduktionseffizienz erhöhte Schwankungen der Proteinexpression pro Zelle und eine erhöhte Zelltoxizität.
   HINWEIS: Beschichtung von Glasschalen mit Fibronektin verbessert das Zellwachstum und die Morphologie und die richtige fördert Progression von Zellen durch Mitose. Es können im allgemeinen durch im Handel erhältliche Gelatine ersetzt werden, das billiger ist.

3. Adenovirus Transduction und endogenes Protein Knockdown von siRNA-Transfektion in HeLa-RFP-H2B Zellen unter Verwendung von CaPi Ausfällungen

Achtung! Arbeiting mit Viren erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen und eine ordnungsgemäße Entsorgung aller Materialien, die in Kontakt mit dem Virus gewesen ist.

Achtung! In unseren Händen fällt CaPi oft haben mehr unerwünschte Wirkungen, zum Beispiel auf biologische Prozesse Vesikeltransport beteiligt (zB Autophagie). Dementsprechend wird empfohlen, ein kationisches Lipid Transfektionsreagenz zu verwenden (siehe unten) und mindestens 48 Stunden vor der Analyse zu warten.

ANMERKUNG: Eine Kontroll - Adenovirus ein nicht verwandten Gen (dh LacZ) , oder kein Gen trägt , verwendet , um einen minimal MOI in allen Adenofections zu erreichen (10-20 PFU / Zelle) die geringste Menge an rekombinantem Adenovirus trägt das Gen von Interesse verwendet wird .

Hinweis: Dieses Verfahren hat sich gezeigt, Normalisieren Expression pro Zelle in einer großen Zellpopulation zu unterstützen.

1. Einen Tag nach der Zell Plattieren, zählen die Anzahl der Zellen, die aus dem zusätzlichen plattierten Schale. Saugen Sie das Medium undSpülen Sie einmal mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA. In wieder 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO ₂ , bis alle Zellen abgelöst haben. Trennen Sie die Zellen auch eine 1 ml-Pipette und die Anzahl der Zellen pro ml zählen unter Verwendung eines Hämozytometers.
2. Bestimmung der Menge des Virus benötigt Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 2 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Proteins von Interesse (POI) pro Zelle und 18 pfu pro Zelle von einem leeren Vektor zu transduzieren (zB LacZ) insgesamt 20 PFU pro Zelle zu haben. Zugleich transduzieren 4 PFU von jeder Baculovirus (Actin und αTubulin, GFP und RFP-tagged respectively). Transduktion der Zellen folgendes adenofection Protokoll. Viren wurden wie in Fuchs et al. ¹⁴
3. Bereiten Sie in einer sterilen Haube ein 1,5 - ml - Kunststoffröhrchen für jede Bedingung und fügen 400 ul warmen & agr; MEM-minus ^10%.
4. Auftauen ein Aliquot der Viren langsam auf Eis und, falls erforderlich, verdünnt ter Virus Lager, um ein Volumen von mehr als 1 & mgr; l zu pipettieren Pipettierfehler zu minimieren.
5. Die berechnete Virus Menge pro Zustand zu jedem Röhrchen 1,5 ml Kunststoff , die 400 & mgr; l & agr; MEM-minus ^10% und vorsichtig mischen durch Pipettieren. Legen Sie das Virus Lager sofort wieder bei -80 ° C seine Aktivität zu halten.
6. Aspirieren das Medium von den Zellen und sanft das Virus Mischung tropfenweise pipettieren. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ und agitieren die Platten sorgfältig unter sterilen Haube jeweils 15 min für 1 h auf die Zellen auch mit dem Virus umfassen. eine geringe Menge an Medium erleichtert den Kontakt des Virus mit den Zellen.
7. Nach der Inkubation Pipettieren vorsichtig 1,6 ml & agr; MEM-minus ^10% auf jeder Platte ein Gesamtvolumen von 2 ml zu erhalten, durch Zugabe von 2 mM Thymidin Zellsynchronisation beginnen und die Zellen für weitere 2 Stunden bei 37 ° C, 5% CO ₂ inkubieren .
8. Inzwischen bereiten die siRNA-Transfektion Mix following , die capi Transfektionsverfahren (siehe Abbildung 1). Wenn keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die Menge von siRNA durch sterilem Wasser auf eine leere Transfektion durchzuführen.
9. Berechnen 200 ul Mischung für jede Bedingung, die sich in 400 & mgr; l pro Duplikat. Das folgende Beispiel ist für eine endgültige siRNA Konzentration von 50 nM gegeben und wurde für jedes Protein von Interesse angepasst werden. In einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen, Pipetten 50 & mgr; l 1 M CaCl ₂ und 11 & mgr; l 20 & mgr; M siRNA in 139 ul sterilem H ₂ O , und durch Verwirbeln gemischt. Nach einem schnellen Spin, fügen Sie vorsichtig tropfenweise 200 ul HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH - Wert von 7,01 bis 7,05).
   HINWEIS: Je kleiner die Tropfen sind, umso kleiner die Niederschläge, was zu einer besseren Transfektionseffizienz. Vorsichtig mischen dreimal durch Luftinjektion mit einer 200 ul-Pipette.
10. Inkubieren der Mischung für 30 min bei RT. Fügen Sie langsam tropfenweise 200 ul Transfektionsgemisch zu jeder Platte undagitieren kreuzweise. Übertragen Sie die Platten bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 16 Stunden.
11. Am nächsten Tag spülen Zellen zweimal mit 2 ml warmem HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) und 2 ml & agr; MEM-minus ^10%. Nicht mit mehr als vier Zellplatten zu einem Zeitpunkt gehen, da Variationen in der Temperatur über die Länge des Zellzyklus beeinflussen.
12. Visualisieren Sie die Infektionseffizienz unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer Vergrößerung von 20-40x (Luft) und erwerben drei repräsentative Bilder pro Zustand in den beiden fluoreszierenden und Übertragungskanäle für die Dokumentation. Sieben Stunden später, fügen Sie 2 mM Thymidin und Inkubation für weitere 16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.
13. Am nächsten Tag, 48 Stunden nach der siRNA - Transfektion und Virus - Infektion, spülen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml warmem Phosphatpuffer - Salzlösung (PBS) und Release 7 h in 2 ml & agr; MEM ^10% w / o Phenolrot für Live - Cell - Imaging oder mit Phenol Rot für die Proteinextraktion.
14. Ernte Zellen für jede Bedingung 48 h nach der Transfektion für die Herstellung von Proteinextrakten und Western - Blot - Analyse der Effizienz von Zuschlags und die Expression des endogenen Proteins ¹⁵ zu bestimmen.
    HINWEIS: Verwenden Sie Antikörper gegen das Protein von Interesse sowie entsprechende Antikörper, die als Ladekontrollen dienen. Die Effizienz der Zuschlags sollte durch Laden abnehmenden Mengen von Steuer Zelllysaten (transfiziert mit Kontroll siRNA) bestimmt werden, um eine Titrationskurve zu liefern ( das heißt, 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus Transduction und endogenes Protein Knockdown von siRNA-Transfektion in HeLa-Zellen unter Verwendung eines kationischen Lipids Transfektionsreagenz

HINWEIS: Hier präsentieren wir ein Protokoll, das für Experimente angepasst wurde, dass zum Beispiel keine Zellsynchronisation beinhalten und / oder wenn siRNA-Transfektion nicht von der CAPI-Verfahren durchgeführt werden können, unerwünschte toxische Wirkungen in irgendeiner Zelle lin zu vermeidenes. Dieses Protokoll umfasst auch eine Zelle replating Schritt nach adenofection um zu einer geeigneten Zelldichte zu arbeiten. Wir haben nur getestet das kationische Lipid Transfektionsreagenz.

Achtung! Arbeiten mit Viren erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen und eine ordnungsgemäße Entsorgung aller Materialien , die in Kontakt mit dem Virus gewesen ist.

1. Platte 1,75 x 10 ⁵ Zellen pro 35 mm - Schale in 2,5 ml & agr; MEM ^10% und bei 37 ° C, 5% CO _2. Platte eine 35-mm-Platte zusätzlich zur Anzahl der Bedingungen, um die Zellzahl vor der Virusübertragung zu zählen.
2. Wachsen Zellen bis zum nächsten Tag eine Zelldichte von mindestens 50% zu erreichen. Eine Zelldichte von weniger als 50% führt zu einer signifikanten Abnahme der Virus Transduktionseffizienz erhöhte Schwankungen der Proteinexpression pro Zelle und eine erhöhte Zelltoxizität.
3. Einen Tag nach der Zell Plattieren, zählen die Anzahl der Zellen, die aus dem zusätzlichen plattierten Schale. Aspirierendas Medium und spülen einmal mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA. In wieder 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO ₂ , bis alle Zellen abgelöst haben. Separate Zellen gut eine 1 ml-Pipette und die Anzahl der Zellen pro ml zählen.
4. Bestimmen Sie die Menge des Virus benötigt , um eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 20 bis 40 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Proteins von Interesse (POI) pro Zelle und 0-20 PFU pro Zelle eines leeren Vektor zu transduzieren (zB LacZ) insgesamt 40 PFU pro Zelle zu haben.
5. Bereiten Sie in einer sterilen Haube ein 1,5 - ml - Kunststoffröhrchen für jede Bedingung und fügen 400 ul warmen & agr; MEM ^10%.
6. Tauwetter ein Aliquot der Viren langsam auf Eis und, falls notwendig, das Virus Lager um verdünnen ein Volumen von mehr als 1 & mgr; l zu pipettieren Pipettierfehler zu minimieren.
7. Die berechnete Virusmenge pro Zustand zu je 1,5 ml Kunststoffröhrchen 400 ul & agr; MEM , enthaltend ^10% und sanft durch Pipettieren mischen. Platz the-Virus Lager bei -80 ° C sofort wieder seine Aktivität zu halten.
8. Aspirieren das Medium von den Zellen und sanft das Virus Mischung tropfenweise pipettieren. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ und agitieren die Platten sorgfältig unter sterilen Haube jeweils 15 min für 1 Stunde auf gut die Zellen mit dem Virus Verdünnung bedecken. eine geringe Menge an Medium erleichtert den Kontakt des Virus mit den Zellen.
9. Inzwischen bereiten nach der Transfektion Methode, um die siRNA-Transfektion Mix. Wenn keine siRNA erforderlich ist, ersetzen Sie die Menge von siRNA durch Medium ohne Serum eine leere Transfektion durchzuführen.
   1. Das folgende Beispiel ist für eine endgültige siRNA Konzentration von 50 nM gegeben und wurde für jedes Protein von Interesse angepasst werden. Für jede adenofection bereiten ein 1,5 - ml - Kunststoffröhrchen 416 nM siRNA in 150 ul Medium ohne Serum enthält (zB 6,25 ul 20 uM siRNA + 144 & mgr; l Medium ohne Serum) und ein 1,5 - ml - Kunststoffrohr haltendeng 6,25 ul kationische Lipid Transfektionsreagenz + 144 & mgr; l Medium ohne Serum.
   2. Mischen Sie den Inhalt jedes Kunststoffrohr durch Auf- und Abpipettieren mehrmals mit einer 200 ul Pipette. Kombinieren Sie den Inhalt der beiden Rohre und mischen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals mit einer 200 ul Pipette. Inkubieren für 5 min bei RT.
10. Nach der Inkubation mit dem Virus, Pipette vorsichtig 1,8 ml & agr; MEM ^10% auf jeder Platte mit einem Gesamtvolumen von 2,2 ml zu erhalten , und sofort werden langsam tropfenweise zu jeder Platte die siRNA - Transfektion Mischung und rühren kreuzweise. Übertragen Sie die Platten bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 24 Std.
11. Am nächsten Tag re-Platte die Zellen von jeder 35 mm - Platte in vier neue 35 - mm - Platten in 2,5 ml & agr; MEM je ^10% und Inkubation für weitere 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.
12. Am nächsten Tag, 48 Stunden nach der siRNA-Transfektion und Virus-Infektion, Ernte-Zellen von einer Platte für jede Bedingung für die Herstellung vonProteinextrakte und Western - Blot - Analyse der Effizienz von Zuschlags und die Expression des endogenen Proteins ¹⁵ zu bestimmen.
    HINWEIS: Bei den verbleibenden Platten, gehen mit Zellfixierung, das Protokoll der Wahl verwenden und die Proben zu Immunfluoreszenzanalyse mit den Antikörpern von ¹⁴ Interesse unterziehen.

5. Live Cell Imaging von mitotischen Zellen und Datenanalyse

1. Führen Sie kurzfristige Live Cell Imaging Experimente an mitotischen Zellen mit einem inversen Mikroskop mit einem befeuchteten / 5% CO ₂ / temperaturgeregelten Kammer ausgestattet.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein Spinnscheibe konfokalen Mikroskop (40X, 0,75 NA) verwendet wurde, ausgerüstet mit einem EMCCD gekühlten ladungsgekoppelten Kamera bei -50 ° C.
2. Vor dem Erwerb, stellen Sie sicher, dass die Kammer die geeignete Temperatur von 37 ° C erreicht hat.
   HINWEIS: Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern, abhängig von der mikroskopischen System.
3. Legen Sie die Kulturschalen in der MICROscope Kammer 1 Stunde vor dem Erwerb richtige Gleichgewicht des Mediums zu ermöglichen und den Fokus zu vermeiden aufgrund von Temperaturänderungen driften. Überwachung der mitotischen Zustand der Zellen. An diesem Punkt 10-15% der Zellen sollte in den frühen Stadien der Mitose (Prophase-Prometaphase) sein.
4. Während der Ausgleichszeit, stellen Sie die Aufnahmeparameter wie in vorherigen Experimenten bestimmt. Typischerweise sind eine Belichtungszeit für beide Kanäle (488 und 594) von 0,2-3 sec mit einer Laserintensität von 100% und einer Empfindlichkeit von 121-130 geeignete Parameter in unseren Händen.
   HINWEIS: Erste Tests mit den geringst möglichen Laserintensität und Erfassungszeit / Intervall, um zu bestimmen, die mit einem Minimum an Photobleichens in einer entsprechenden Auflösung zur Folge haben, die Zellschäden verursacht und stört mitotischen Progression.
5. Wählen mehrere Felder pro Bedingung eine signifikante Anzahl von Zellen zu erhalten, ohne den Erfassungsintervall zu analysieren. Mit einem Spinning Disk konfokales System, ein typisches Setup wird inClude vier verschiedenen Bedingungen, 7 Feldern pro Platte und zwei Farbkanäle (488 und 594) mit einem 1,5-2 min Intervall über einen 75 min-Periode.
6. Wählen Sie Zellen, die bei der mitotischen Eintritt sind, erneut den Fokus, wenn alle Felder ausgewählt wurden, und den Erwerb beginnen so schnell wie möglich.
7. Überwachen Sie die Stabilität des Systems für mindestens drei Zeitpunkten und wieder den Fokus, wenn nötig.
8. Nach der ersten Bildgebungslebendzell kurzfristige von 75 min, können neue Felder mitotischer Zellen eines zweiten Satzes von Filmen zu erwerben werden gewählt, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen, die analysiert wird.
9. Bestimmen gut definierten Kriterien die mitotische Phänotypen von Zellen zu analysieren, die auf den Fluoreszenzmarker abhängen verwendet werden. Mängel in der Mitose können in der Mitose (von nuklearen Zusammenbruch bis anaphase), Chromosomenfehlausrichtung, Spindel wippen und Cortex blebbing ¹⁴ verlängert verbrachte Zeit umfassen.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenoviren Transduction in Differentiating C2C12-Maus-Myoblasten

HINWEIS: Die adenofection Protokoll ist auch auf schwer zu Infect Myoblasten Maus C2C12 Differenzierung unterzogen.

1. Platte 2 x 10 ⁵ C2C12 - Zellen in 35 mm Kulturschalen in Wachstumsmedium auf Plastik oder auf einem Substrat der Wahl.
   HINWEIS: Die Zelldifferenzierung auf Gelatine- oder Matrigel-beschichteten Schalen verbessert. Planen Sie eine zusätzliche Platte die Zellzahl vor der Virusübertragung zu bestimmen.
2. Am nächsten Tag sollten die Zellen 80% Konfluenz erreicht haben. Induzieren Differenzierung der Myoblasten, indem die Zellen zweimal mit warmem PBS gewaschen und Zugabe von 2 ml Differenzierungsmedium (DM).
3. Am nächsten Tag, gekennzeichnet als Tag 1 (D1) der Differenzierung, transduzieren Myozyten mit Adenovirus LifeAct-TagGFP2 das Aktin-Zytoskelett in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Zählen Sie die Zellenzahl von der zusätzlichen Platte wie unter 3.2 beschrieben. Berechnen 5 PFU / Zelle LifeAct-TagGFP2 Adenovirus und 45 PFU / Zelle AdLacZ im Anschluss an die PrüfungB. in Tabelle 1 beschrieben. Die Gesamtvirusmenge 50 PFU / Zelle ist. Viren wurden wie beschrieben ¹⁴ verwendet ,
4. Bereiten Sie in einer sterilen Haube ein 1,5-ml-Kunststoffröhrchen für jede Bedingung und fügen 400 ul warmen DM.
5. Tauwetter ein Aliquot der Viren langsam auf Eis und, falls notwendig, das Virus Lager um verdünnen ein Volumen von mehr als 1 & mgr; l zu pipettieren Pipettierfehler zu minimieren.
6. Fügen Sie die entsprechende Menge von Viruspartikeln pro Zustand zu je 1,5 ml Kunststoffröhrchen mit 400 ul DM und vorsichtig mischen durch Pipettieren. Legen Sie das Virus Lager sofort wieder bei -80 ° C seine Aktivität zu halten.
7. Saugen Sie das Medium von den Gerichten und sanft die Virusmischung tropfenweise pipettieren. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ und agitieren die Platten sorgfältig unter sterilen Haube jeweils 15 min für insgesamt 1 h bis gut die Zellen mit dem Virus umfassen.
8. Nach der Inkubation Pipette vorsichtig 1,6 ml DM auf jede Platte und weiterhin die incubation für weitere 2 Stunden bei 37 ° C, 5% CO _2.
9. Eine leere Transfektionsgemisch nach dem CaPi Transfektionsverfahren der Zwischenzeit bereiten. Berechnen 200 ul Mischung für jede Bedingung. Verwenden Sie das folgende Beispiel für ein Gesamtvolumen von 400 & mgr; l-Mix.
   1. In einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen, Pipetten 50 ul 1 M CaCl & _sub2 ; in 150 ul sterilem H ₂ O , und durch Verwirbeln gemischt. Nach einem schnellen Spin, fügen Sie vorsichtig tropfenweise 200 ul HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH - Wert von 7,01 bis 7,05). mit einer 200 ul Pipette vorsichtig durch Luftinjektion dreimal mischen.
10. Inkubieren der Mischung für 30 min bei RT. Fügen Sie langsam tropfenweise 200 ul der Transfektionsgemisch zu jeder Platte und agitieren kreuzweise. Übertragen Sie die Platten bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 16 Stunden.
11. Am nächsten Tag, spülen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml warmem HEPES (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) und 2 ml DM. Visualisieren Sie die infection Effizienz unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer Vergrößerung von 20-40X (Luft) und erwerben drei repräsentative Bilder pro Zustand in den beiden fluoreszierenden und Übertragungskanäle für die Dokumentation.
12. Je nach Versuchsaufbau gewünscht wird, folgen die Differenzierung in Myotuben für mehrere Tage. Die Zellen können zur Immunfluoreszenzanalyse oder Live-Cell-Imaging-Studien fixiert und anschließend durchgeführt werden kann ausgesetzt werden.

Ergebnisse

Transfektion von BAG3-GFP - Plasmid - DNA unter Verwendung von kationischen Lipiden mit heterogenen Expression assoziiert in HeLa - Zellen einige Zellen zeigt kaum nachweisbaren Mengen des Proteins und andere Lager sehr hohe BAG3 Ebenen (2A). In diesen Zellen, Proteinverlust Homöostase wurde durch Akkumulation von BAG3-GFP nachgewiesen in perinukleären Aggregate (2A, Pfeile). Im Gegensatz dazu Zelltransduktion mit Adenoviren BAG3-GFP tragen zeigte homo...

Diskussion

Hier beschrieben wir ein Verfahren ermöglicht Verarmungsrettungsexperimente durchgeführt werden, die funktionelle Analyse von zellbiologischen Prozessen anwendbar ist, die besonders empfindlich auf eine Überexpression von Proteinen, die Stöchiometrie und die Dynamik von Proteinkomplexen und makromolekulare Strukturen zu beeinträchtigen. Mitotischen Zellteilung ist ein extremes Beispiel für fein abgestimmte Zelle Morphodynamik, die die dramatische und spektakuläre Veränderungen in der Gesamtstruktur einer Zelle b...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046