JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

اتحادات الميكروبية داخل خلايا النحل تلعثم إثراء والحفاظ على حبوب اللقاح ليرقات النحل. باستخدام تسلسل الجيل القادم، جنبا إلى جنب مع المختبرات والتجارب الميدانية، وهذه المخطوطة يصف البروتوكولات المستخدمة لاختبار الفرضية القائلة بأن بقايا مبيد للفطريات تغير ميكروبيومي حبوب اللقاح، ومستعمرة التركيبة السكانية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى مستعمرة الخسارة.

Abstract

غالباً ما تستخدم مزارعي بخاخ مبيد للفطريات أثناء لوم لحماية المحاصيل ضد المرض الذي يعرض النحل لبقايا مبيد للفطريات. على الرغم من اعتبار "النحل الآمنة"، وهناك أدلة متزايدة على أن بقايا مبيد للفطريات في حبوب اللقاح ترتبط بانخفاض النحل (بالنسبة لأنواع العسل وتلعثم نحلة). الآليات التي ما زال مجهولاً نسبيا، تكهن الباحثون أن تشارك متنافسة الميكروبات والنحل. الجراثيم تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على و/أو تجهيز حبوب اللقاح، الذي يخدم كالتغذية للنحل اليرقات. بتغيير المجتمع الميكروبية، فمن المحتمل أن مبيدات الفطريات تعطيل هذه الخدمات بوساطة ميكروب، ومما يعرض للخطر صحة النحل. ويصف هذه المخطوطة البروتوكولات المستخدمة للتحقيق في الآليات غير المباشرة التي قد تسبب الفطريات انخفاض مستعمرة. تجارب قفص تعريض النحل للمعالجة بمبيد للفطريات الزهور قدمت بالفعل أول دليل على أن الفطريات تسبب خسائر مستعمرة عميقة في أصلي تلعثم نحلة (impatiens بومبوس). استخدام جرعات الميدانية ذات الصلة من مبيدات الفطريات، وضعت سلسلة من التجارب لتقديم وصف أكثر دقة لديناميات المجتمع الميكروبي المعرضة لمبيد للفطريات حبوب اللقاح. بتسلسل الجيل القادم وتحليل مواد التحقيق في التحولات في التكوين الهيكلي لتجمعات الفطرية والبكتيرية داخل ميكروبيومي حبوب اللقاح. تجارب البلدان المتقدمة النمو هنا قد صممت لتوفير فهم ميكانيكية لكيفية تأثير مبيدات الفطريات ميكروبيومي حبوب اللقاح-الأحكام. وفي نهاية المطاف، هذه النتائج ينبغي تسليط الضوء على المسار غير المباشر من خلالها مبيدات الفطريات قد تسبب انخفاض مستعمرة.

Introduction

إدارتها وأنواع النحل البرية تعاني من انخفاضات على نطاق واسع، مع آثار كبيرة على النظم الطبيعية والزراعية على حد سواء1. وعلى الرغم من الجهود المتضافرة لفهم أسباب هذه المشكلة، العوامل المحركة لعسل النحل الانخفاضات لا تزال غير مفهومة جيدا2،،من34. لأنواع معينة من النحل البرية، الأصلية، أصبحت الحالة الأليمة5،6. إذا كان لا يمكن أن يستمر السكان النحل عندما أنها تتقاطع مع الزراعة الصناعية وسكانها سوف تستمر في الانخفاض، وسوف تحمل المحاصيل التي تتطلب الملقحات (35 في المائة من الإنتاج في العالم7) خفض المحاصيل.

وفي حين قد تورط العديد من العوامل المحتملة كمبيد آفات التعرض، والمرض، والموئل خسارة1،4،،من89،10 في عسل النحل الانخفاض، يعرف إلا القليل نسبيا عن أثر هذه الضغوطات التفاعلية على صحة النحل الأصلية، داخل أو بالقرب من النظم الزراعية. الكثير من الجهود البحثية الحالية مواصلة التركيز على المبيدات الحشرية، (مثلاً، neonicotinoids11،12)، على الرغم من أن البحوث السابقة تشير إلى أن مبيدات الفطريات قد تلعب أيضا دوراً في انخفاض النحل بعرقلة تشكيل الذاكرة، الاستقبال حاسة الشم13وعش الاعتراف14، نشاط إنزيم والوظائف الأيضية15،،من1617. على الصعيد العالمي، مبيدات الفطريات الاستمرار في تطبيق للمحاصيل المزهرة خلال لوم. وقد وثقت الدراسات الأخيرة أن النحل عادة إعادة بقايا مبيد للفطريات إلى خلية18، في الواقع، وقد أظهرت الدراسات أن نسبة كبيرة من خلايا تم اختبارها الواردة مبيد المخلفات19،20. مزيد من العمل قد كشفت عن أن بقايا مبيد للفطريات يترافق مع معدلات عالية من عسل النحل وفيات اليرقات21،،من2223 ، ووجود "حبوب اللقاح مدفون" داخل المستعمرات، التي على الرغم من أن غير سامة، تخلو من النشاط الميكروبي وهو الخطر غذائياً24. على الرغم من حقيقة أن مبيدات الفطريات طالما اعتبرت "النحل الآمنة"، هناك الآن أدلة على أن التعرض لمبيد للفطريات وحدها يمكن أن تسبب الخسائر مستعمرة شديدة في أنواع نحلة تلعثم أصلية، impatiens بومبوس25.

لإقامة علاقة سببية بين التعرض لمبيد للفطريات ومستعمرة وفيات، أسلوب عمل هذه المواد الكيميائية تحتاج إلى يتحدد. كما تدل على ذلك في26من التربة والرواسب2728من البيئات المائية، باستهداف الفطريات، مبيدات الفطريات الأكثر احتمالاً يغير وفرة الفطرية وتحول التنوع داخل حبوب اللقاح-الأحكام، وبالتالي الاحتجاج مجتمع رئيسية التي قد بقوة لصالح البكتيريا. دون الفطرية المنافسين أو الخصوم، يمكن أن تنتشر بعض البكتيريا المسببة للأمراض دون رادع نسبيا، تيسير تلف حبوب اللقاح-الأحكام. الماضي البحوث قد أثبتت أن الكائنات الحية الدقيقة، وبخاصة الخمائر والفطريات الخيطية، بمثابة سيمبيونتس الغذائية للنحل29،،من3031، حماية ضد الطفيليات والعوامل الممرضة32 ،33، وتقدم المحافظة على المدى الطويل من مخازن حبوب اللقاح. مبيدات الفطريات، لذلك، قد غير مباشر يضر بالنحل غير ناضجة بتعطيل المجتمع الميكروبية اللازمة لتوفير هذه الخدمات و/أو بزيادة التعرض ل مسببات الأمراض والطفيليات الانتهازية12. ومع تزايد الطلب على إنتاج الأغذية، المحاصيل في جميع أنحاء العالم هي يجري رش كل سنة مع مبيدات الفطريات خلال لوم، مؤكدا الحاجة إلى فهم حجم هذه الآثار الناجمة عن مبيد للفطريات.

حتى الآن، الثغرات المعرفية الأولية المتعلقة بالنحل الأصلية الميكروبية علم البيئة يمكن أن يمثله في المسائل التالية: وإلى أي مدى يتغير فطريات المجتمع الميكروبي داخل النحل حبوب اللقاح-الأحكام؟ ما هي آثار المصب تستهلك حبوب اللقاح مع مجتمع الميكروبية عميقة غيرت؟ تمشيا مع هذه الأسئلة وثيقة الصلة إيكولوجيا، وضعت تجارب مع الأهداف الرئيسية لكشف 1) أن بقايا مبيد للفطريات وحدها يمكن أن يسبب انخفاض حاد مستعمرة في أنواع أصلية النحل؛ 2) الدرجة التي يتم تغيير المجتمعات الميكروبية في حبوب اللقاح-الأحكام بمبيدات الفطريات، و 3) كيف تتأثر صحة النحل مجتمع الميكروبية غيرت شديدة. وقد حددت أهداف تجريبية لمعالجة المسائل المذكورة أعلاه باستخدام مزيج من التجارب المختبرية والميدانية. استخدام الجينومية الدولة للفنون والتقنيات الجزيئية جنبا إلى جنب مع الأساليب التقليدية للمراقبة الميدانية، يهدف هذا البحث إلى قطعة معا من الآثار المحتملة للفطريات على صحة النحل.

الهدف الأول من هذه الدراسة إثبات أن التعرض مبيد للفطريات وحدها يمكن أن تسبب الخسائر مستعمرة كبيرة بين أنواع النحل الأصلي. واستخدمت دراسة شملت أقفاص ميدانية كبيرة للتحقيق في آثار التعرض لمبيد للفطريات على نمو مستعمرة impatiens بومبوس، النحل أصلية في كل مكان، ووفرة في الولايات المتحدة (الشكل 1و الشكل 2، الشكل 3). كان الافتراض بأن المعالجة بمبيد للفطريات خلايا سيقدم انخفاض اللياقة البدنية، والديموغرافيا شاذة بالمقارنة مع خلايا غير مكشوف. البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجربة تؤيد هذه الفرضية، مما يدل على أن بقايا مبيد للفطريات داخل حبوب اللقاح يمكن أن تكون السبب الوحيد للخسائر مستعمرة عميقة في أنواع أصلية تلعثم نحلة25. والهدف الثاني من هذه الدراسة هو التحقيق في استجابة ميكروبيومي حبوب اللقاح للتعرض لمبيد للفطريات. هو الافتراض بأن تكوين المجتمع للميكروبات داخل حبوب اللقاح-أحكام يتعرضون لمبيدات الفطريات يختلف عن حبوب اللقاح غير المعالجة. البكتيريا و/أو أنواع فطرية مهيمنة واحدة في حين يتوقع أن تنخفض إلى حد كبير وفرة الفطرية والتنوع، سوف يرجح أن تنمو دون رادع في حالة عدم وجود الفطريات الأخرى المتنافسة. من خلال سلسلة من المحاكمات في فيفو ، سيتم تحليل هذه التحولات في تركيبة المجتمع الميكروبية باستخدام ميتاجينوميكس.

Protocol

1-دراسة "تأثير التعرض مبيد للفطريات" في "تلعثم نحلة مستعمرة نجاح استخدام قفص التجارب الميدانية"

  1. مجموعة حتى عشرة مش أقفاص في حقل مزروع بالشوفان. حفر خندق حول كل القفص، وحفر كافة الحواف الأربع من القفص مش في الأرض لضمان أن لا يمكن الهروب من النحل. الأسهم في الأقفاص مع وعاء، النباتات المزهرة التي هي معروفة لتكون جذابة للنحل (مثل الحنطة السوداء، لسان الثور، أليس، والكون، وعباد الشمس) ( الشكل 2).
  2. الملحق في الأقفاص مع علبة واحدة من البرسيم بلوم (36 سم × 42 سم). كتلة الموارد الأزهار داخل أحد أركان القفص، تحتل مساحة حوالي 2.5 م × 1 م فيجيتاتي منطقة القفص المتبقية بالشوفان.
  3. عشوائياً تعيين تلعثم نحلة كل العمال التي تحتوي على المستعمرات وملكة واحدة، لعلاج (مبيد للفطريات الحاضر/غائبة، N = 5 مستعمرات كل معاملة، ومجموع 10 مستعمرات)، ثم وضعها داخل قفص حقل (N = 1/قفص) لمدة 29 يوما (23 حزيران/يونيه -21 تموز/يوليه عام 2014).
  4. توجيه مربعات مستعمرة أن المستعمرة ' الفتحات s تشير إلى الجنوب لتزويد النحل بأفضل الظروف الملاحية. دعم المستعمرات بقربه مياه السكر، توضع داخل مربعات خلية لتكملة توافر الرحيق.
    5. باستخدام يد عقد
  5. تطبيق المستندة إلى التالونيل فطريات على مستوى حقل ذات صلة (20 غرام/لتر) للنباتات المزهرة في أقفاص علاج فطريات خمسة، بخاخ مبيدات الآفات، مرتين خلال الدراسة (اليوم 0 و 13). معطف الزهور موحد أن لا سائل أخرى تلتزم بالأسطح الأزهار ( الشكل 3).
  6. في ختام الدراسة الميدانية القفص، إزالة المستعمرات impatiens باء من الأقفاص باليد، بارد في خلايا عن طريق وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية عن 20 دقيقة
  7. إزالة النحل باستخدام الملقط العقيمة، وتسجيل عدد اليرقات، الخوادر، والإناث البالغات (أنا- ﻫ. العلافون)، والذكور البالغين. توازن التحليلي باستخدام تسجيل الوزن الجاف الملكة الأم واليرقات، الخوادر، والكبار من الإناث (أي العلافون)، والذكور البالغين-

2. دراسة "آثار التعرض مبيد للفطريات" في "المجتمعات الميكروبية" في حبوب اللقاح-أحكام "تلعثم نحلة أعشاش استخدام المختبر على أساس" التجارب في فيفو

  1. بولفيريزي تجارياً بشراء حبوب اللقاح إلى مسحوق ناعم باستخدام معيار طاحونة الكرة في المختبر. تعقيم مسحوق حبوب اللقاح التي نقع في الإيثانول 70%، مما يتيح لها تتبخر بين ليلة وضحاها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من العقم من حبوب اللقاح بطلاء ملغ ~0.5 على وسائط أجار الأغراض العامة-
    1. الجاف، إضافة حبوب اللقاح معقمة، باستخدام ماصات معقم، الجرعة الميدانية ذات الصلة لمبيد للفطريات: بروبيكونازولي في نسبة 14.3 في المائة؛ أزوكسيستروبين في 22.9 في المائة للعلاج (0.74 ميليلتر وميليلتر 0.65 على التوالي اليوم/خلية). خلط جيدا باستخدام العصي الخشبية معقمة.
  2. مكان 6 خلايا تجريبية (n = 3 للتحكم والعلاج) في benchtop مختبر نظيفة وصحية الحفاظ على درجة حرارة الغرفة. كل يوم تزن ز 4.27 من حبوب اللقاح 34 ، 35 مختلطة مع مبيدات الفطريات (للعلاج) أو الماء المعقم (لمراقبة) داخل غطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة القياسية.
    1. باستخدام مصيدة أبواب المقدمة من جانب صندوق من الورق المقوى مرفقا بها خلايا النحل، إدخال اللقاح داخل خلايا النحل. الملحق الخلايا مع محلول السكر تعقيم كل أسبوع. مواصلة تغذية النظام لمدة أربعة أسابيع-
  3. في ختام الدراسة المستندة إلى مختبر، بارد في الخلايا من وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية ل 20 دقيقة كشط حبوب اللقاح-الأحكام الواردة ضمن الدوائر الحضنة باستخدام الملقط المعقم وملاعق ومكان في أنابيب التخزين العقيمة. مخزن في درجة عد جيم-80 وسجل وزن العمال والملكة الأم في بداية ونهاية التجربة (الخطوة 1.7).
  4. مجموعات "عزل الحمض النووي" من عينة توفير حبوب اللقاح باستخدام عزل الحمض النووي المتاحة تجارياً (انظر "جدول المواد" للحصول على التفاصيل).
    1. إضافة 0.25 g لتوفير اللقاح لاستخراج أنابيب، بإيجاز دوامة مزيج.
      2. جعل
    2. 200 مغ/مل الحل ليسوزيمي في المياه المقطرة، يكفي 50 ميليلتر/عينة. هزة بقوة لحل النموذج تماما.
      3. إضافة 50 ميليلتر من الحل lysozyme لأنابيب استخراج عينة في ذلك
    3. ، ومزيج جيد بعكس عدة مرات. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في حمام مائي. إذا شكلت متسرعا، الحل إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب قبل استخدام الحرارة.
    4. ميليلتر 70 إضافة حل تحلل مائي لاستخراج أنابيب، تأمين أفقياً على لوح مسطح دوامة مع الشريط، وأنابيب دوامة لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة-
    5. نقل المادة طافية إلى أنبوب جمع نظيفة 2 مل. إضافة 250 ميليلتر الحل ترسيب البروتين، ودوامه لإينكوباتي س. 5 في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق في حمام الثلج.
      ملاحظة: توقع بين ميليلتر 400 إلى 500 ميليلتر من المادة طافية. المادة طافية قد لا تزال تحتوي على بعض الجزيئات.
    6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في 10,000 س ز، ونقل تصل إلى 600 ميليلتر من المادة طافية إلى أنبوب جمع نظيفة 2 مل. إضافة 200 ميليلتر من مثبط مائي إزالة الحل، دوامة بإيجاز، واحتضان في 4 درجات مئوية عن أدنى 5 أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة في غ. س 10,000 نقل ما يصل إلى 750 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب جمع نظيفة 2 مل.
      7. س.
    7. ميليلتر إضافة 1200 من حل ربط مائي للمادة طافية، ودوامه 5 تحميل ما يقرب من 675 ميليلتر من المادة طافية على تصفية تدور، وأجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. التدفق من خلال تجاهل.
      8. كرر
    8. 2.4.7-مرتين-
      ملاحظة: مجموع الأحمال ثلاثة لكل عينة معالجة مطلوبة.
    9. إضافة 500 ميليلتر الإيثانول، وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ق في غ. س 10,000 تجاهل التدفق من خلال، والطرد المركزي مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة 10 آلاف × تصفية تدور مكان زاي في أنبوب جمع نظيفة 2 مل.
    10. إضافة 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى مركز غشاء التصفية. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ق في غ. س 10,000 تجاهل عامل التصفية تدور. مخزن جمع الحمض النووي بين-20 درجة مئوية و-80 درجة مئوية
  5. استخدام عزل الحمض النووي لتسلسلها.
    1. قوانتيفي، وتطبيع الحمض النووي المعزولة إلى 2 نانوغرام/ميليلتر بتحليل فلوروميتريك. ردود فعل
      1. تحضير في ثلاث نسخ لكل عينة تم استخراجها لمقارنة الكميات النسبية من 28S (المصنع)، تحليل لها (الفطرية)، ومكونات كل نموذج توفير حبوب اللقاح 36 (البكتيرية) 16S. تأكد من أن كل رد يحتوي على 10 نانوغرام من مجموع الحمض النووي و x 2 من سيانيني غير متناظرة صبغ على أساس مزيج الرئيسي ميليلتر 2.5 كل من الإشعال إلى الأمام وعكس أزواج 28KJ/28 باء 37 للنبات و ITS1/ITS5.8R للحمض النووي الفطرية 38 .
    2. "تضخيم الحمض النووي" باستخدام المعلمات التالية: تمسخ قبل 2 دقيقة عند 50 درجة مئوية، تمسخ 2 دقيقة الأولى عند 95 درجة مئوية، دورات 40 (15 ثانية عند 98 درجة مئوية، 15 s في 58 درجة مئوية، 60 s عند 72 درجة مئوية)، متبوعاً بمنحنى تذوب.
    3. إعداد بروتوكول بكر 2-الخطوة، متداخلة باستخدام مكتبات الجيل التالي تسلسل استهداف الرنا الريباسي 16S V3/V4 المتغير المنطقة والبحث عن/5.8s الرنا الريباسي المنطقة الفاصلة. بمول
      1. ميليلتر 12.5 إضافة الحمض النووي إلى 5 لكل التمهيدي و 2 x ميكس الرئيسي. جعل ردود الفعل منفصلة لكل منطقة (16S أو لها؛ انظر الجدول 1). تعديل كبسولة تفجير المنطقة المحددة كما هو موضح سابقا 39 ، 40 لإضافة محول المنظم على حدة عبء النوكليوتيدات تسلسل إلى تسلسل جينات محددة.
      2. أداء التضخيم الأولية باستخدام المعلمات التالية: 3 دقيقة تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية، 25 دورات (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية)، التمديد النهائي 5 دقيقة في 72 درجة مئوية.
      3. يلي الأول التضخيم والتحقق من حجم المكتبة، والكمية التي تنقل الغرواني الكهربي، وتنظيف باستخدام 1 × حجم المرحلة الصلبة عمارة عكسهاأوبيليزاتيون الخرز إزالة بقايا كبسولة تفجير ورد فعل الكواشف. تجمع 16S وفي أمبليكونس كمياً لإنشاء تجمع أمبليكون واحدة لكل عينة.
        4. إضافة محولات معينة التسلسل
      4. وعينه محددة فهارس المزدوج باستخدام كبسولة تفجير التالية (انظر الجدول 1). إضافة 2.5 ميليلتر من تضخيم الحمض النووي إلى 5 بمول من كل التمهيدي و 2 x ميكس الرئيسي. إجراء مكتبة التضخيم باستخدام المعلمات التالية: 3 دقيقة تمسخ الأولى عند 95 درجة مئوية، 8 دورات (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، 30 s عند 72 درجة مئوية)، التمديد النهائي 5 دقيقة في 72 درجة مئوية.
    4. التالي PCR، الانتهاء من تنظيف المكتبات باستخدام وحدة تخزين 1 x من حبات التثبيت عكسها المرحلة الصلبة. تقييم نوعية وكمية للانتهاء من المكتبات باستخدام التنقل الغرواني الكهربي، وفلوروميتري، على التوالي. توحيد المكتبات إلى 2 ميكرومتر وتجمع قبل التسلسل.
    5. إجراء تسلسل الجيل القادم على منصة مماثلة للمحولات إضافة في بكر الثانوية، بطول مناسب لتغطية كامل amplicon 41-
  6. تسلسل الشرح والتحليل تكوين الجراثيم.
    1. الجمع بين زوج في نهاية تسلسل البيانات (R1 و R2) إلى كونتيجس واحدة لكل متسلسلة المكتبات. بعد دمج ملفات R1 و R2، يتم إنتاج ملف فاستا واحد لكل من المكتبات.
      ملاحظة: يتم إجراء هذه الخطوة والعمليات الوارد وصفها أدناه (ما لم يذكر خلاف ذلك) في مزار الإصدار 1.38.0 38-
    2. الشاشة كل ملف فاستا لإزالة القواعد الغامضة وتسلسلات طويلة غير متوقعة وطويلة هوموبوليميرس-
      ملاحظة: المعلمات للفحص، وإزالة تسلسل ماكسامبيج = 0، maxlength = 600، وماكسهوموب = 8 لكل الجينات. إزالة سلاسل متطابقة، ولكن يبقى جدول كونتينجينسي بشكل منفصل لكل المكتبات (يعرف أيضا باسم الجدول العد في مزار).
    3. محاذاة تسلسلات فريدة من نوعها من مكتبة الجينات 16S ضد إصدار قاعدة بيانات سيلفا 123، ومكتبة للبحث عن المورثات ضد قاعدة "توحد،" 42-
      ملاحظة: يجب أن المشروح متواليات من مستوى المملكة إلى مستوى جنس.
      1. في وقت لاحق، المجموعة محاذاة تسلسلات مع pre.cluster الدالة باستخدام فرق = 5، وإزالة التركيبات.
    4. تصنيف سلاسل باستخدام الأسلوب وانغ 43 على أساس سيلفا (للجينات 16S) و "توحيد لها" (للجينات للبحث عن) تصنيف الملفات (استقطاع قيمة 80%).
      5. تحميل
    5. في ص 44 الجداول كونتينجينسي (واحد لكل الجينات) التي تم إنشاؤها أثناء عملية التصنيف في مزار. على كل مستوى من مستويات التصنيف، الحصول على الوفرة النسبية في مكتبة لمزيد من التحليل لتغيرات المجتمع الميكروبية.
      ملاحظة: كل مستوى التصنيف، دمج معا المجموعات التصنيفية عند الوفرة النسبية هو أقل من 2 في المائة لكل التكرار تجريبية.

النتائج

دراسة ميدانية في قفص:

البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب قفص أظهر أن المستعمرات تلعثم نحلة استجابة كبيرة للتعرض لمبيد للفطريات. خلايا النحل المعالجة بمبيد للفطريات المنتجة إلى حد كبير عدد أقل من العمال (± 12.2 3.8، يعني ± سراج الدين) من خلا?...

Discussion

وظلت التحقيقات المتعلقة الآثار مبيدات الفطريات على صحة النحل جانبا المداريين استراتيجيات إدارة الآفات. وتهدف دراستنا لسد هذه الفجوة في المعرفة باستخدام مجموعة من التقنيات التكميلية التي صراحة عزل العوامل المحركة للنحل الانخفاضات المحتملة. التخطيط، والأساس المنطقي، وتقديم هذه التجارب ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

المؤلف أشكر مركز التكنولوجيا الحيوية جامعة ويسكونسن تسلسل الحمض النووي مرفق لتوفير المساعدة التقنية مع التضخيم وتسلسل مرافق وخدمات، كيتلين كارلسون، وموهبة جنيفر، أوتو جيك وهاس ماكس التحليل الجزيئي. وأيد هذا العمل "خدمة البحوث" الزراعية-وزارة الزراعة خصصت الأموال (معلومات البحث الحالي نظام #3655-21220-001). وقدمت "المؤسسة الوطنية للعلوم" (تحت "رقم منحة" مزيدا من الدعم DEB-1442148)، مركز الكيان التشغيلي المعين البحيرات الأبحاث الحيوية الكبرى (مكتب وزارة الطاقة علوم البر دي-FC02-07ER64494)، ووزارة الزراعة المعهد الوطني للأغذية والزراعة (هاتش مشروع 1003258). C.T.H. هو "باحث بيو" في مجال العلوم البيولوجية الطبية وزميل كلية تويبفر الفريد، تدعمها بيو الخيرية ومؤسسة ألكسندر فون همبولت، على التوالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Natupol BeehiveKoppertUSRESM116 hives
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
AboundSyngenta4033540Azoxystrobin 22.9%
ChlorothalonilSyngenta3452Fungicide used for trials
Pollen granulesBee rescuedB004D5650C3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculationCurrie Lab
Yeast strains for inoculationHittinger lab
Primer pairsUW Biotech Center
DNA Isolation KitMo Bio12830-50Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851DNA quantification tool
Select Master Mix for CFXThermo Fisher4472952Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection SystemBio Rad1855196Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,Axygen10159-696Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 KitAgilent5067-1504Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq SequencerIlluminaUsed for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)VWR

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  42. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  43. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
  44. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  45. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  46. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  47. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  48. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  49. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  50. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  51. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  52. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  53. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  54. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  55. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved