JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bumble arı kovanlarını içinde mikrobiyal konsorsiyumlar zenginleştirmek ve polen arı larvaları için korumak. Laboratuvar ve deneyler, alan bazlı ile birlikte sonraki nesil sıralama kullanarak bu el yazması mantar ilacı artıkları polen microbiome ve koloni demografi, sonuçta koloni için önde gelen alter varsayımını sınamak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar kaybı.

Özet

Yetiştiriciler kez çiçeklenme sırasında bitkileri mantar ilacı artıkları arılara sunar hastalığa karşı korumak için mantar ilacı spreyler kullanın. Ne kadar "arı için güvenli" olarak, mantar ilacı kalıntılarında polen arı düşüşler (için bal ve bumble bee tür) ile ilişkili montaj kanıtlar var. Mekanizmaları nispeten bilinmeyen kalırken, araştırmacılar arı-mikrop symbioses katılan spekülasyonlar var. Mikroplar koruma ve/veya işleme polen, larva arılar için beslenme olarak hizmet veren çok önemli bir rol oynamaktadır. Mikrobiyal topluluk değiştirerek, bu mantar ilaçları bu mikrop aracılık hizmetlerini kesintiye uğratamaz ve böylece arı sağlık uzlaşma için muhtemeldir. Bu el yazması hangi-ebilmek var olmak mucip mantar ilaçları koloni düşüş dolaylı mechanism(s) araştırmak için kullanılan iletişim kurallarını açıklar. Kafes deneyler için mantar ilacı tedavi çiçekler arılar açığa zaten mantar ilaçları bir yerel bumble bee (Bombus Impatiens) derin koloni kayıplara neden ilk kanıt sağladı. Mantar ilaçları alan ilgili dozlarda kullanılarak, bir dizi deney geliştirilmiştir daha ince bir mantar ilacı maruz polen mikrobiyal topluluk dinamiklerini sağlamak için. Mantar ve bakteri buluntu polen microbiome içinde yapısal bileşimi nöbetleşe yeni nesil sıralama ve metagenomic analiz tarafından incelenmiştir. Burada geliştirilen deneyler mantar ilaçları polen-hükümler microbiome etkilemesi mekanik bir anlayış sağlamak için tasarlanmıştır. Sonuçta, bu bulgular dolaylı yolu üzerinden koloni düşüşler mantar ilaçları neden olabilecek ışık.

Giriş

Yönetilen ve yabani arı türü her ikisi de doğal ve tarım sistemleri1için önemli etkileri ile yaygın düşüşler yaşandığı. Bu sorunun nedenleri anlamak için uyumlu çabaları rağmen bal arı düşüşler sürüş hala değil iyi anlaşılan2,3,4etmenlerdir. Vahşi, yerli arıları belirli türler için durum korkunç5,6haline gelmiştir. Arı nüfusu ile endüstriyel tarım kesiştiği, nüfusları düşmeye devam edecek ve bitkileri polinatörler (dünya çapında üretim%735) gerektiren tahammül edecek sürekli olamaz eğer hasat azaltılmış.

Böcek ilacı pozlama gibi birçok potansiyel faktörler hastalık ve habitat kaybı1,4,8,9,10 bal arı düşüş karıştığı olmuştur, nispeten az etkileşimli etkisi bu stresler yerli arılar sağlık, içinde veya yakınında tarım sistemleri hakkında bilinir. Birçok mevcut araştırma çabalarının böcek öldürücüler, (örneğin, neonicotinoids11,12üzerinde), mantar ilaçları da bir rol arı düşüş bellek oluşumu bozulması tarafından oynayabilir ki son araştırma gösterir rağmen odaklanmaya devam, koku alma13, yuva tanıma14, enzim aktivitesi ve metabolik işlevleri15,16,17. Genel olarak, mantar ilaçları çiçeklenme sırasında çiçekli bitkiler için uygulanmaya devam. Son yıllarda yapılan çalışmalarda arılar genellikle mantar ilacı artıkları geri kovan18için gerçekten de getirmek., çalışmalar test kurdeşen bulunan mantar ilacı artıkları19,20büyük bir kısmı göstermiştir belgeledi. Daha fazla çalışma ortaya çıkar o mantar ilacı tortu yüksek oranda bal arı larva ölüm21,22,23 ve "entombed polen" koloniler içinde varlığı ile ilişkili olan, ancak toksik olmayan, mikrobiyal aktiviteyi yoksun ve beslenme güvenliği aşılan24. Mantar ilaçları uzun süre "arı için güvenli" olarak kabul edilmiştir ki rağmen hiçbir şey şimdi kanıt için mantar ilacı yalnız bu maruz kalma ciddi koloni kayıp bir yerel bumble bee türler, Bombus Impatiens25neden olabilir.

Ölüm, bu kimyasalların modus operandi nedensellik arasında mantar ilacı pozlama ve koloni kurmak için belirlenecek gerekir. Toprak26, çökeller27ve su ortamları28, mantarlar hedefleyerek kanıtladığı, mantar ilaçları olasılıkla mantar bereket alter ve çeşitlilik içinde polen-hükümler, böylece büyük bir topluluk çağırma kaydır güçlü bakteri lehine olabilir. Mantar rakip veya antagonistleri bazı Patojen bakteriler nispeten denetlenmeyen, polen-hükümler bozulma kolaylaştırmak prolifere. Araştırmalar göstermiştir mikroorganizmalar, özellikle Mayalar ve ipliksi Mantarlar, arılar29,30,31için beslenme simbiont olarak hizmet, parazitler ve patojenler32 karşı koruma ,33ve polen mağazaların uzun vadeli koruma sağlar. Mantar ilaçları, bu nedenle, dolaylı olarak olgunlaşmamış arılar bu hizmetleri sağlamak için gerekli mikrobiyal topluluk kesintiye tarafından ve/veya duyarlılık fırsatçı patojenler ve parazitler12artırarak zarar verebilir. Gıda üretim talepleri artan ile bitkileri dünya çapında her yıl mantar ilaçları ile mantar ilacı kaynaklı etkileri büyüklüğünü anlamak gerek vurgulayan bloom sırasında püskürtme.

Yerel arı mikrobiyal ekoloji temsil tarafından aşağıdaki soruları ile ilgili birincil bilgi boşlukları, Tarih: ne ölçüde mantar ilacı mikrobiyal toplum içinde arı polen-hükümler değişir mi? Polen derinden değişmiş bir mikrobiyal toplulukla tüketen aşağı akım etkileri nelerdir? Bu ekolojik konu ile ilgili sorular ile tutarak, deneyler 1 açığa birincil hedefleri ile geliştirilmiştir) Yalnız o mantar ilacı tortu ciddi koloni düşüş bir yerli arı türler; neden olabilir 2) derecesi için polen-hükümler mikrobiyal topluluklarda değiştirilmiş mantar ilaçları ve 3) nasıl arı sağlık ciddi biçimde değiştirilmiş bir mikrobiyal topluluk tarafından etkilenir. Deneysel amaçlar deney Laboratuvarı ve alan bazlı bir birleşimini kullanarak yukarıdaki sorulara yönelik olarak tanımlanmış. State-of--art metagenomic ve alan gözlem geleneksel yöntemleri yanında moleküler teknikleri kullanarak, bu araştırma mantar ilaçları olası etkilerini arı sağlığı üzerinde bir araya toplamaya amaçlamaktadır.

Bu çalışmanın ilk hedefi mantar ilacı pozlama yalnız yerli arı türler arasında önemli koloni kayıp neden olabilir göstermektir. Büyük alan kafesleri içeren bir çalışma Bombus Impatiens, (Resim 1, Resim 2, şekil 3) ABD'de her yerde, bol yerli arı koloni gelişimini mantar ilacı pozlama etkilerini araştırmak için kullanıldı. Bu mantar ilacı tedavi kovanları düşük fitness ve atipik demografi maruz olmayan yığınlar için karşılaştırıldığında sunacak olan. Mantar ilacı artıkları polen içinde derin koloni kayıp bir yerel bumble bee türler25tek nedeni olabilir gösteren bu hipotez desteklenen bu deneyden elde edilen veri. Polen microbiome yanıt için mantar ilacı pozlama araştırmak için bu çalışmanın ikinci amacı olduğunu. Mikroplar polen-hükümler için mantar ilaçları maruz içinde topluluk bileşimi tedavi edilmezse polen farklı olacak olan. Mantar bolluk ve çeşitlilik önemli ölçüde düşüş bekleniyor olsa da, bakteri ve/veya tek bir baskın mantar türü büyük olasılıkla diğer rakip mantarlar yokluğunda denetlenmeyen büyüyecek. In-vivo deneyler bir dizi sayesinde, bu vardiya mikrobiyal topluluk bileşiminde metagenomics kullanarak analiz edilecektir.

Protokol

1. mantar ilacı pozlama etkisi Bumble Bee Colony başarı kullanarak alan kafes deneyler incelemek

  1. Set on kadar kafes kafes bir alanda dikildi yulaf ile. Her kafes çevresinde bir siper kazmak ve kafes kafes tüm dört kenarları arılar kurtuluş yok emin olmak için zemine kazmak. Arılara (örneğin buğday, hodan, alyssum, evren ve ayçiçeği) çekici olduğu bilinmektedir saksı, çiçekli bitkiler ile kafesleri stok ( Şekil 2).
  2. Bloom yonca tek tepsi (36 cm x 42 cm) ile kafesleri ek. Küme köşelerinden yulaf tarafından yaklaşık 2.5 m x 1 m. Vegetate kalan kafes alan bir yer kaplayan kafesin içinde çiçek kaynakları.
  3. Rasgele koloniler, içeren her işçi ve tek bir Kraliçe, bir tedavi bumble bee atama (mantar ilacı hediye/yok, N = tedavi başına 5 koloniler, 10 kolonileri toplam), sonra onları bir alan kafes içinde yer (N = 1/kafes) 29 gün (23 Haziran -21 Temmuz 2014).
  4. Şark koloni kutuları öyle ki koloni ' s açıklıklar gelin arılar ile en uygun seyir koşulları sağlamak için güneyde. Şeker su mesane, nektar kullanılabilirlik ek olarak kovan kutularının içinde yerleştirilir ile kolonileri sübvanse.
  5. Uygula chlorothalonil tabanlı fungisit çiçekli bitkiler beş mantar ilacı tedavi kafeslerde alan ilgili bir seviyeye (20 g/L) adlı bir el kullanarak böcek ilacı püskürtme, iki kez çalışma (gün 0 ve 13) sırasında düzenlenen. Öyle ki hiçbir daha fazla sıvı çiçek yüzeylere ( şekil 3)'in çiçekleri düzgün kat.
  6. Ve sonuç alan kafes çalışmanın B. Impatiens kolonileri kafesleri üzerinden el ile kaldırmak, -20 ° C-dondurucu 20 dakika süreyle yerleştirerek kurdeşen serin
  7. Kaldırmak steril forseps kullanarak arılar ve larva, Pupa, Yetişkin kadın kaydedin (ı. e. toplayıcılar) ve yetişkin erkekler. Bir analitik denge kullanarak kaydetmek Kuru Ağırlık annesi Kraliçe, larva, Pupa, Yetişkin kadın (Yani toplayıcılar) ve yetişkin erkekler.

2. In Vivo çalışmalarda Bumble Bee yuvalarını kullanarak laboratuvar dayalı polen hükümleri mikrobiyal topluluklar üzerinde mantar ilacı pozlama etkileri incelemek

  1. ticari olarak satın Pulverize polen bir standart kullanarak ince bir toz için Laboratuvar top-mill. Toz polen % 70 etanol, gecede UV ışık altında buharlaşır izin ıslatarak sterilize. Kısırlık polen ~0.5 mg genel amaçlı agar medya üzerinde kaplama tarafından doğrulayın.
    1. Kuru için sterilize polen, steril Pipetler, kullanarak eklemek mantar ilacı alan ilgili doz: %14,3; propiconazole azoxystrobin %22,9 tedaviler için (0,74 µL ve 0.65 µL sırasıyla / gün / hive). İyi sterilize edilmiş ahşap çubukları kullanarak karıştırın.
  2. Yer 6 deneysel kurdeşen (n = 3 her kontrol ve tedavi için) bir temiz, hijyenik laboratuar benchtop oda sıcaklığında muhafaza içinde. Her gün mantar ilaçları (için Tedaviler) veya standart aseptik tekniği kullanarak bir başlık içinde (Denetim için) steril su ile karıştırılarak polen 34 , 35 4.27 g tartmak.
    1. Tuzak kapı kovanlar, kapsayan karton kutu yan tarafından sağlanan kullanarak tanıtmak polen kovanlar içinde. Kurdeşen sterilize şeker çözeltisi ile her hafta ek. Dört haftadır rejim besleme devam.
  3. -20 ° C-dondurucu 20 dk. Scrape sterilize forseps ve spatula kullanarak damızlık Odaları içinde yer polen hükümler dışarı yerleştirip steril depolama tüpler yerinde kovanlar laboratuar tabanlı çalışma sonucunda, serin. Mağaza-80 ° C. sayısı ve kayıt ağırlığı işçiler ve başlangıç ve bitiş deneme (Adım 1,7), Ana Kraliçe.
  4. İzole DNA'ları piyasada bulunan DNA yalıtım kullanarak polen tedariki örnek kitleri (malzemeler tablo ayrıntılar için bakınız).
    1. Polen-hükmün ayıklama için 0, 25 g tüpler, kısa bir süre karıştırmak için girdap ekleyin.
    2. 200 mg/mL deiyonize distile su, 50 µL/örnek için yeterli lizozim çözüm olun. Shake şiddetle tamamen formu çözüm.
    3. Bu örnekte ayıklama tüplerini 50 µL lizozim çözüm eklemek ve de birkaç kez ters çevirme ile karıştırın. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 10 dakika için tüp kuluçkaya. Çökelti oluşturmuştur Eğer çözüm kullanmadan önce eriyene kadar 60 ° c ısı.
    4. Ayıklama tüpler, sulu lizis çözüm eklemek 70 µL güvenli yatay bandı ile bir Kafesli döşeme girdap yastık üzerinde ve girdap için 10 dk santrifüj tüpleri 10.000 x g 30 için de oda sıcaklığında s.
    5. Süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. 5 dakika içinde bir buz banyosu için 4 ° C'de 5 s. Incubate protein yağış çözüm ve girdap 250 µL add.
      Not: süpernatant ile 500 µL için 400 µL arasında bekliyoruz. Süpernatant hala içeriyor olabilir bazı parçacıklar.
    6. 10.000 x g, 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler santrifüj kapasitesi ve 600 µL olan süpernatant temiz 2 mL toplama tüp aktarın. Sulu inhibitörü kaldırma çözüm, kısaca, girdap 200 µL ekleyin ve 5 dk. 10.000 x g., 1 dk. için oda sıcaklığında tüpler Transfer süpernatant ile 750 µL kadar temiz 2 mL koleksiyonu tüpüne santrifüj 4 ° C'de kuluçkaya.
    7. Ekle 1200 µL sulu bağlama çözüm süpernatant ve 5 için girdap s. yaklaşık 675 µL süpernatant üstüne bir spin filtre ve oda sıcaklığında 1 dk. için 10.000 x g, santrifüj, yük. Aracılığıyla akış atın.
    8. Tekrar 2.4.7. ikinci kez.
      Not: Toplam üç yükler işlenen her örnek için gereklidir.
    9. Ekle 500 µL etanol ve oda sıcaklığında santrifüj 30 s 10.000 x g. aracılığıyla akış atmak ve santrifüj kapasitesi tekrar g. yer spin filtre bir temiz 2 mL toplama tüp x 10.000 ' 1 dakika oda sıcaklığında.
    10. Ekle 100 µL elüsyon, arabellek filtre membran ortasına. 30 oda sıcaklığında santrifüj 10.000 x g. s atma spin filtre. Mağaza toplanan DNA-20 ° ve-80 ° C arasında
  5. kullanmak için sıralama DNA izole.
    1. Miktarını ve Fluorometrik analizi ile izole DNA 2 ng/µL'normalleştirmek. Nüsha 28S göreli miktarlarını karşılaştırmak ayıklanan her örnek için
      1. hazırla reaksiyonlar (bitki), onun (mantar), analiz ve 16S (bakteri) bileşenleri her polen tedariki örnek 36. Her reaksiyon 10 içerdiğinden emin olun ng toplam DNA, asimetrik siyanür boya göre ana Mix 2 x ve 2.5 µL her bitki için ileriye ve geriye doğru astar çiftleri 28KJ/28B 37 ve ITS1/ITS5.8R mantar DNA'ın 38 .
    2. DNA'sı aşağıdaki parametreleri kullanarak yükseltmek: 40 50 ° c, 2 dk ilk denatürasyon 95 ° C'de 2 dk öncesi denatürasyon döngüleri (15 98 ° c, 15 s s 58 ° c, 60 s 72 ° c), ardından bir erime eğrisi.
    3. Hazırlamak yeni nesil sıralama kitaplıkları 16S rRNA hedefleme kullanan bir 2-adım, iç içe geçmiş PCR Protokolü V3/V4 değişken bölge ve Its / 5.8s rRNA spacer bölge. Her astar ve 2 ana mix x
      1. ekleyin 12.5 µL DNA'ın 5'e pmol. (16S veya Its; bkz. Tablo 1) her bölge için ayrı reaksiyonlar olun. Gene özel sıraları için sequencer özel bağdaştırıcı çıkıntı nükleotit dizileri eklemek için yukarıda açıklanan 39 , 40 olarak bölge belirli astar değiştirmek.
      2. İlk amplifikasyon aşağıdaki parametreleri kullanarak gerçekleştirmek: 25 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.
      3. Aşağıdaki ilk amplifikasyon, Kütüphane boyutu ve miktar tarafından elektroforetik hareketlilik doğrulayın ve 1 birim katı faz ters çevrilebilir imm x kullanılarak temizleArtık astar ve reaksiyon Kimyasalları kaldırmak için obilization boncuk. Havuz 16S ve kantitatif her örnek için bir tek amplicon havuzu oluşturmak için amplicons.
      4. Sequencer belirli bağdaştırıcıları eklemek ve belirli ikili dizinler (bkz. Tablo 1) aşağıdaki primerler kullanılarak örnek. Güçlendirilmiş DNA'ın 2.5 µL her astar ve 2 ana mix x 5 pmol ekleyin. Aşağıdaki parametreleri kullanarak kütüphane amplifikasyon gerçekleştirmek: 8 3 dk. ilk denatürasyon 95 ° c döngüleri (30 s 95 ° c, 30 s 55 ° c, 30 s 72 ° c), 5 min son uzantısı ' 72 ° C.
    4. Aşağıdaki PCR, temiz bitmiş kitaplıkları bir 1 x birim katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk için. Kalite ve miktar elektroforetik hareketlilik ve fluorometry, sırasıyla kullanarak bitmiş kütüphanelerin değerlendirmek. 2 µM ve sıralama önce havuzu için kitaplıklarına standartlaştırmak.
    5. Tüm amplicon 41 karşılamak için uygun bir uzunlukta ikincil PCR eklenen bağdaştırıcılarına benzer bir platform üzerinde yeni nesil sıralama gerçekleştirmek.
  6. Sıra ek açıklama ve mikrobiyal kompozisyon analizi.
    1. Birleştirme çift uçlu sıralama veri (R1 ve R2) tüm sıralı kitaplıkları için tek contigs. R1 ve R2 dosyalarını birleştirdikten sonra her kitaplık için bir tek fasta dosyası üretilir.
      Not: Mothur sürüm 1.38.0 38 bu adım ve (aksi belirtilmedikçe) aşağıda açıklanan işlemler gerçekleştirilir.
    2. Belirsiz bazlar, beklenmedik uzun serileri ve uzun homopolymers kaldırmak için her fasta dosya ekran.
      Not: Tarama ve sıra kaldırma maxambig parametreleridir = 0, maxlength = 600 ve maxhomop = 8 her iki genler için. Aynı sıraları kaldırmak, ancak bir contingence tablo tüm kitaplıkları (aka Mothur sayısı tablo) için ayrı ayrı devam.
    3. SILVA veritabanı sürümü 123 karşı gen 16S Kütüphane ve gen Its Kütüphanesi birleştirmek Its veritabanı 42 karşı benzersiz sıraların hizalayın.
      Not: Dizileri cins seviyeye Krallık düzeyden açıklanmalıdır.
      1. Daha sonra küme uyumlu dizileri diff kullanarak işlev pre.cluster ile = 5 ve chimeras kaldırın.
    4. İstimal belgili tanımlık yöntem SILVA (için gen 16S) ve onun birleştirmek (için gen Its) taksonomi dosyalarını (kesme biçimi değerini % 80) göre Wang 43 dizileri sınıflandırmak.
    5. R 44 Mothur sınıflandırma işlemi sırasında oluşturulan contingence tabloları (gen başına bir adet) yükleyin. Taksonomik her düzeyde, mikrobiyal topluluk değişiklikleri daha iyi inceleyebilmemiz için kütüphane başına göreli bereket almak.
      Not: göreli bereket tüm deneysel yinelemeleri için % 2'den az olduğunda taksonomik her düzeyde, taksonomik grupların birleştirin.

Sonuçlar

Saha kafes çalışması:

Kafes deneylerden elde edilen veriler bumble arı kolonileri mantar ilacı maruz kalma önemli bir tepki olduğunu göstermiştir. Mantar ilacı tedavi kovanlarını kontrol kovanları daha önemli ölçüde daha az işçi (12,2 ± 3,8, ortalama ± SE) üretilen (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (şekil 4). Ayrıca, arı biyokütle manta...

Tartışmalar

Etkisi soruşturmalar arı sağlığı üzerinde mantar ilaçları, böcek Yönetim Stratejileri çöküşünde bir yönünü kalmıştır. Bizim çalışma a maiyet-in açıkça arı düşüşler sürüş potansiyel faktörler izole tamamlayıcı teknikleri kullanarak bu bilgi boşluğu amaçlamaktadır. Planlama, mantığı ve işleme bu deneyler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Hayır arılar bu demografi analiz taviz verecek bu yana kafes kafes deneyleri kaçmasına izin ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazar(lar) amplifikasyon ve sıralama özellikleri ve Hizmetleri, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto ve Max Haase ile teknik yardım sağlamak için sağlamak için Wisconsin Üniversitesi biyoteknoloji Merkezi DNA sıralama tesis teşekkür Moleküler analizi. Bu eser USDA tarımsal araştırma Servisi tahsis fonlar (geçerli araştırma bilgi sistemi #3655-21220-001) tarafından desteklenmiştir. Daha fazla destek (altında Grant No Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanan Deb-1442148), DOE büyük göller biyoenerji Araştırma Merkezi (Office DOE bilim BER DE-FC02-07ER64494) ve USDA Ulusal Enstitüsü gıda ve Tarım (Hatch projesi 1003258). C.T.H. biyomedikal Bilimleri ve bir Alfred Toepher öğretim görevlisi, sırasıyla Pew Charitable güvenir ve Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenen bir Pew yazardır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Natupol BeehiveKoppertUSRESM116 hives
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
AboundSyngenta4033540Azoxystrobin 22.9%
ChlorothalonilSyngenta3452Fungicide used for trials
Pollen granulesBee rescuedB004D5650C3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculationCurrie Lab
Yeast strains for inoculationHittinger lab
Primer pairsUW Biotech Center
DNA Isolation KitMo Bio12830-50Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851DNA quantification tool
Select Master Mix for CFXThermo Fisher4472952Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection SystemBio Rad1855196Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,Axygen10159-696Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 KitAgilent5067-1504Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq SequencerIlluminaUsed for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)VWR

Referanslar

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  42. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  43. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
  44. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  45. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  46. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  47. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  48. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  49. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  50. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  51. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  52. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  53. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  54. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  55. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 128Koloni Daralt bozuklu umetagenomicsmikrobiyal e itlilikmicrobiomepolenMaya

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır