إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

Summary

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Abstract

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

تم اكتشاف تأثير الضوء Brillouin نثر (BLS) من قبل ليون برويون في عام 1922. ¹ وهو يتألف من نثر غير مرن من الضوء المرئي من قبل الفونونات الصوتية تنشيط حراريا في المواد. في فيزياء الحالة الصلبة، الفونونات الصوتية والاهتزازات متماسكة من كل الذرات في شعرية. سلسلة ذات بعد واحد من نوعين بالتناوب من الذرات في شعرية هي نموذج بسيط يوضح الفرق بين الفونونات الصوتية، التي كشفت عنها BLS، والفونونات البصرية، سبرت عن طريق امتصاص الأشعة تحت الحمراء ورامان نثر (الشكل 1). الفونونات الصوتية والحركات في مرحلة من الذرات في سلسلة مع تشريد على طول اتجاه الانتشار (الفونونات الصوتية طولية) أو عمودي على اتجاه انتشار (عرضية الفونونات الصوتية)، في حين الفونونات البصرية هي حركات الخروج من مرحلة من ذرات إنتاج تتأرجح لحظة ثنائي القطب الكهربائية (طولية أو عرضية وسائط).

BLS الطيفوقد استخدم SCOPY في العلم التحليلي منذ 1920s. ومع ذلك، فقط منذ 1980s لها قياسات عالية التباين كانت ممكنة من خلال استخدام جنبا إلى جنب المتعددة الدخول مطياف فابري بيرو. ومنذ ذلك الحين، فإن عددا متزايدا من التقدم في BLS لتطبيقات تحليلية في المادة المكثفة (حيث يتم استغلال تفاعل الفوتون الطاقة الصوتية) ^2-4 والمواد المغناطيسية (من خلال تفاعل الفوتون، المجنون) قد عرضت ⁵ عنه. وقد مهدت أعمال المنوية على التطبيقات الطبية الحيوية ^6-8 الطريق إلى وضع نهج مختلف، بما في ذلك واحدة تطبق هنا واحد هو موضح سابقا ⁹ باستخدام الركيزة عاكسة في تكوين مثل الصفائح الدموية لتحقيق صفا كاملا للموتر مرونة عينة.

في العمل الحالي، ونحن نطبق BLS التحليل الطيفي إلى مقومات أساسية لالمصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الضامة، والبروتينات الليفية الإيلاستين والكولاجين النوع الأول. تYPE أنا الكولاجين هو جامد، جزيء حلزوني الثلاثي الذي يجمع أفقيا وطوليا مع الصليب ربط واسعة لتشكيل الألياف جامدة أساسا في الأنسجة مثل الأوتار. شبكات الكولاجين غالبا ما تتعايش مع شبكات الإيلاستين، وهو بروتين، على غير العادة، ويولد بعيدة المدى مرونة من خلال مزيج من الكون والتفاعلات الطاردة للماء مع بيئتها وضروري لوظائف الأنسجة مثل الرئة والجلد. وعلى غرار كل من الألياف باستخدام نموذج الكريستال سداسية في البحث الحالي. ⁹ في الجزء 1، وصفنا بروتوكول لاستخراج الألياف من الأنسجة الحيوانية وإعداد نموذج للقياسات الطيفية. في الجزء 2، يتم تقديم إجراءات إنشاء جهاز Brillouin والحصول على أطياف من الألياف. الجزء 3 يعطي تفاصيل تحليل البيانات تطبيقها على أطياف Brillouin لاستخراج المعلومات الميكانيكية ذات الصلة الواردة فيه. ثم، يتم عرض نتائج ممثل وdiscusseد.

Protocol

تحذير: يرجى الرجوع إلى بروتوكولات السلامة البيولوجية وجميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. الليزر المستخدمة في هذه التجارب هو الليزر من الفئة 3B. مطلوب الامتثال للقواعد المحلية لاستخدام الآمن للنظام. الرجاء استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند إجراء القياس الطيفي بالليزر بما في ذلك استخدام معدات الوقاية الشخصية (نظارات وقاية).

وقد تم الحصول على الأوتار الذيل 7-8 الاسبوع فئران ويستار القديمة الموت الرحيم لأغراض أخرى وفقا للائحة الاتحاد الأوروبي 1099/2009 ورعاية الحيوانات (ذبح أو قتل) لعام 1995. وقد تم الحصول على الأبقار رباط قفوي من المسالخ المحلية.

1. إعداد ألياف عينة

ملاحظة: ألياف البروتين المصفوفة خارج الخلية يمكن استخلاصها من الأنسجة المختلفة، وذلك باستخدام إجراءات مختلفة. وتم صقل البروتوكولات على أساس الإجراءات المطبقة على نطاق واسع.

1. استخراج ألياف الكولاجين من ذيل فأر
   1. التضحية الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من وزن الجسم الصوديوم بنتوباربيتون. ثم قطع الذيل مباشرة عند نقطة اتصال مع الجسم، والضغط إلى أسفل مع شفرة الحلاقة حافة واحدة. التفاف الذيل في التشبث الفيلم وتخزينه في المجمد -20 درجة مئوية حتى المطلوبة.
   2. جمع الذيل من الثلاجة، وقطع شريحة 20 مم طويل من نهاية القريبة في حين لا تزال مجمدة ثم ترك الأمر لذوبان الجليد في طبق بتري مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (7.4 درجة الحموضة) في RT.
   3. مرة واحدة يتم إذابة الذيل، وجعل شق على طول الجزء باستخدام مشرط لتقسيم الجلد. ثم قشر العودة إلى الكشف عن أربع حزم وتر مغمد حول فقرة الذيل.
   4. باستخدام ملقط غرامة والحرص على عدم تطبيق أي سلالة قبل، رسم بلطف كل الألياف من غمد ووضعه في قارورة تحتوي على الماء المقطر مع 0.01٪ ث / ت أزيد الصوديوم (نان ₃₎ إلى العلاقات العامةالمبردة نمو البكتيريا الحدث، ومخزن. وذيل واحد ينتج حوالي ثلاثين ألياف وتر.
   5. للحصول على نوع يفي النقي أنا الكولاجين، وتطبيق ثلاثة أجزاء عملية الهضم الأنزيمي ¹⁰ إلى ألياف وتر لإزالة بروتيوغليكان وجميع المواد غير كولاجيني أخرى.
      1. أولا، تزج الألياف في 0.125 U / مل chondroitinase ABC في 0.05 عازلة M تريس و 0.06 M خلات الصوديوم (CH ₃ COONa) في درجة الحموضة 8.0 لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة.
      2. ثم، تزج الألياف في 1 يو / مل السبحية هيالورونيداز في 0.05 عازلة M تريس و 0.15 كلوريد الصوديوم M (كلوريد الصوديوم) في الرقم الهيدروجيني 6.0 والعودة إلى الحاضنة تهتز لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية.
      3. وأخيرا، تزج الألياف في 1 ملغ / مل من التربسين في 0.05 M فوسفات الصوديوم (NaHPO ₄₎ و 0.15 م كلوريد الصوديوم في درجة الحموضة 7.2 لمدة 16 ساعة في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية.
   6. تخزين الألياف النقاء المبردة في قارورة تحتوي على الماء المقطر، وايال 0.01٪ نان ₃ لمنع نمو البكتيريا، حتى المطلوبة للقياس.
2. استخراج ألياف الإيلاستين من الرباط القفوي البقري
   1. الحصول على الرباط القفوي الأبقار من مسلخ، ألفه في التشبث الفيلم وتخزينه في المجمد -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   2. لإنتاج الإيلاستين نقية، وجمع في الرباط من الثلاجة، والسماح لذوبان الجليد في RT، يزيل الدهن باستخدام مشرط وهضم الرباط في حمام ماء يغلي وفقا للإجراء لانسينغ، ¹¹ على النحو التالي.
      1. إعداد محلول 0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) في الماء المقطر، وإضافته إلى الرباط منزوع الدهن في قارورة مخروطي الشكل، وتغطي الأنسجة.
      2. تغلي القارورة في حمام مائي عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      3. إزالة الرباط من القارورة الهضم وغسل كتلة الأنسجة غير القابلة للذوبان في الماء المقطر مرارا وتكرارا حتى يتم الحصول على درجة الحموضة 7.0 (رصدها باستخدام مقياس درجة الحموضة).
      4. إزالة الأنسجة من المباراة النهائيةغسل الحل ويغرق في الماء المقطر (مختلطة مع 0.01٪ نان ₃ لمنع نمو البكتيريا) في حاوية مغلقة وتخزينه المبردة.
   3. جمع الأنسجة من الثلاجة و، والحرص على عدم تطبيق الكثير من القوة وما قبل السلالة، واستخدام الملقط لسحب بلطف شرائح الإيلاستين أصغر (20-50 ملم طويلة، كاليفورنيا. 2 مم) بعيدا عن الكتلة الأكبر ووضعها في طبق بيتري مع حل PBS (7.4 درجة الحموضة).
   4. باستخدام ملقط غرامة، ندف بلطف حزم ألياف صغيرة حوالي 1 مم وقطع منها إلى أطوال ملم عدد قليل باستخدام مشرط.
   5. نقل الألياف إلى قارورة تحتوي على الماء المقطر (مع 0.01٪ نان ₃ لمنع نمو البكتيريا) وتخزينها المبردة حتى المطلوبة للقياس.
3. تركيب الألياف على الركيزة عاكسة
   1. استخدام قطع الماس، وقطع قطعة من شريحة سيليكون العاكسة.
   2. لإنشاء compartme رطبالإقليم الشمالي، وقطع شريط من بارافيلم لتناسب على شريحة سيليكون مع خفض جوفاء في مركز (كبير بما يكفي لتناسب الألياف) ووضعه على الركيزة السيليكون.
      ملاحظة: للحصول على القياسات الألياف الجافة، وقطع بارافيلم إلى U- شكل حتى أن واحدا من الجوانب الأربعة يبقى مفتوحا في الهواء عندما مختومة في الخطوة 1.3.4.
   3. إزالة الألياف من الثلاجة، واستخدام زوج من ملقط غرامة لجمع واحد من الألياف من حلول التخزين ووضعه في طبق بيتري صغير مملوء بالماء النقي في RT لمدة 5 دقائق لغسل العينة. ثم، وجمع الألياف وتحويلها إلى مركز جوفاء بارافيلم على الركيزة السيليكون.
      الحذر: تجنب الإضرار الألياف التي تمتد أنه خلال هذه العملية، وتجنب إعادة توجيه العينة على الركيزة لأن هذا قد يؤدي إلى تغير في الخواص الميكانيكية.
   4. وضع ساترة زجاج رقيقة على الألياف وختم الغرفة عن طريق تمرير حام الحديد ساخنا بلطف على سطح الزجاج لإذابة بارافيلم تحتالزجاج.
      الحذر: تجنب الإضرار الألياف التي لا تجلب طرف لحام قريبة جدا أو تسخين الركيزة بشكل مفرط.
   5. وضع غرفة مغلقة على سطح مستو تحت ثقل صغير وتترك لمدة حوالي 12 ساعة لتحقيق الاتصال الجيد بين العينة والسيليكون الركيزة مع تجنب الأضرار التي لحقت العينة.
   6. إزالة الوزن وتأمين غرفة في مكان على الركيزة، وذلك باستخدام مسامير.

2. إعداد تجربة Brillouin والحصول الألياف الأطياف

1. إعداد حجرة العينة
   1. جبل العينة أعد كما هو الحال في الجزء 1.3 على حامل العمودي مجهزة مقياس الزوايا لتمكين دوران في الطائرة من العينة مع الحفاظ على زاوية التشتت ثابتة (2 Φ = 90 °؛ انظر الشكل SI-1) ونثر موقف حجم.
   2. إجراء تعديل تركيز دقيق من ضوء الليزر على عينة من خلال جنيهنانو ثانية. ⁹
      الحذر: قد يكون انتاج الطاقة ليزر عالية جدا وينتج حرق في العينة. تأكد من أن يتم تعيين عالية بما فيه الكفاية لإعطاء حساسية جيدة ولكن ليست عالية جدا لتجنب الأضرار التي لحقت العينة. نحن هنا استخدام القوة من كاليفورنيا 76 ميغاواط على العينة. وكان هذا كافيا للحصول على حساسية جيدة دون حرق العينة، معتبرا أن هذا هو رقيق وفي اتصال مع الركيزة التي تساعد على تبديد الحرارة المتولدة عن إضاءة ليزر.
   3. ضع العينة على زاوية 45 درجة (Φ) لشعاع الليزر الحادث باستخدام مقياس الورنية. تحقيق لتحديد المواقع الأمثل عن طريق تشغيل قياس وتعظيم شدة القمم في الطيف (أنظر أدناه).
2. إنشاء مطياف
   1. فتح البرنامج لاقتناء والتلاعب في البيانات وإعداد الاستحواذ على الطيف Brillouin من العينة ^12. الإجراء الموضح هنا ينطبق على موltipass تداخل جنبا إلى جنب (الشكل SI-1A).
   2. محاذاة اثنين فابري بيرو (FP) التداخل المتغيرة بشكل مستقل الفولتية المطبقة على بيزو قبل وحدة التحكم. لهذا الإجراء قبل المحاذاة، ومراقبة الضوء المنعكس من قبل كل FP. عندما تميل كثافة تعكسها ضباط الإتصال اثنين من الصفر، يتم الوصول إلى المحاذاة الصحيحة.
   3. معايرة الطيف: نطاق التردد يمكن الوصول إليها، أو النطاق الطيفي مجانا (FSR)، تعتمد على المسافة بين اثنين من المرايا أول تجويف FP، L، من خلال FSR = ج / 2 لتر، حيث c هي سرعة الضوء، و يتم قياس L عن طريق الاتصال الهاتفي عيار.
   4. مزامنة بمسح اثنين من التداخل FP وتبديل النظام البصري لتكوين جنبا إلى جنب المتعددة الدخول. وهناك مراقبة ردود الفعل من شدة ضوء الليزر تنتقل تلقائيا الحفاظ على المواءمة بين ضباط الإتصال اثنين أثناء القياس.
3. قياس مستوى السوائلو Brillouin الأطياف
   الحذر: الطيف Brillouin يعتمد إلى حد كبير على درجة الحرارة والماء من العينة ومراقبة دقيقة جدا من هذه المعايير هو مفتاح الحصول على أطياف استنساخه.
   1. بدء الاستحواذ على الطيف Brillouin من العينة وتشغيله حتى يتم التوصل إلى جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قد يستغرق هذا عدة دقائق اعتمادا على نثر المقطع العرضي والتركيز وسمك العينة.
      ملاحظة: ليس هناك قاعدة الإبهام لنسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن يتم التحقق من جودة الطيفية التي التجريبي استنادا إلى عينة محددة تحليلها. هناك مفاضلة بين الجودة الطيفية ومدة القياس، وبالتالي المعلمات التجريبية يجب اختيارها وفقا لتطبيق معين.
   2. لقياس عينة الجافة، واتخاذ أطياف التوالي - لكل منهم، بعد خطوة 2.3.1 - حتى أي تغييرات في الموقف من قمم طالصورة احظ. ويتحقق هذا عندما تكون العينة في حالة توازن مع جو الغرفة ولن تجفيف مزيد يؤثر على الطيف.
   3. حدد الاستقطاب ضوء (VV أو VH، V لتقف على رأسي وH للالاتجاه الأفقي من الاستقطاب الخفيفة نسبة إلى الطائرة تناثر) والحصول على الأطياف في كل زاوية لمحور الألياف (θ؛ الشكل SI-1) عن طريق تدوير العينة في طائرة باليد.
   4. حفظ أطياف Brillouin إلى ملف لمعالجتها لاحقا.

3. تحليل Brillouin الأطياف

ملاحظة: تحليل صالح من قمم Brillouin يمكن تنفيذها باستخدام وظائف مختلفة. وقد تم اختيار وثبط المذبذب التوافقي (DHO) وظيفة ^4،13 لأن هذا هو نموذج صالح للقمم القادمة من وسائط صوتية ثبط في وسائل الإعلام اللزجة.

1. تحليل مناسبا من قمم Brillouin
   1. حدد النطاق الطيفي للذروة الاهتمام عشرالبريد Brillouin الطيف.
   2. تمكين أساس في صالح إذا كانت الخلفية الطيفية هي أعلى بكثير من الصفر.
      ملاحظة: خط الأساس يمكن أن تختلف بين الأطياف. ضمان أن يتم تطبيق التصحيح بطريقة منهجية وقابلة للتكرار.
   3. تطبيق مفصلة المربعات المناسب باستخدام وظيفة DHO ^4،13 إلى الذروة Brillouin الاهتمام بشكل متكرر حتى يتم تحقيق التقارب ويتم الحصول على أفضل منحنى المناسب. ثم، حفظ نتائج صالحة للملف.
   4. الحصول على متوسط ​​القيم من المعلمات تناسب اثنين من قمم كل صدرة Brillouin.
   5. حساب سرعة الموجة الصوتية من ذروة تردد (باستخدام التعبير أدناه).
   6. رسم نتائج مناسبة من خلال الرسوم البيانية، على سبيل المثال، الصوتية سرعة موجة مقابل زاوية لمحور الألياف، θ ، وتطبيق النماذج ذات الصلة (على سبيل المثال، لأنظمة متباين الخواص سمعيا ⁹⁾ لاستخراج كميات الميكانيكية مثل معامل مرونة الموترة.

النتائج

جهاز التحليل الطيفي Brillouin المستخدمة في هذه التجربة (الشكل SI-1A) وقد وصفت سابقا. ⁹ ويعمل واحد وضع 532 نانومتر ليزر الحالة الصلبة مع 76 ميغاواط انتاج الطاقة في العينة. و20 سم عدسة الوني تركز ضوء الليزر على العينة ويجمع الضوء المتناثرة من العينة في الهندسة ارتداد مبعثر. ويستخدم جنبا إلى جنب المتعددة الدخول مقياس فابري-بيرو لترشيح الضوء المتناثرة، وهو ما يتم الكشف عنها من قبل الضوئي للكشف عن انخفاض مستوى الضجيج. هذا النهج يعطي للغاية التباين العالي (حوالي 120 ديسيبل) والاستقرار من خلال بيزو مسح ذاتية المحاذاة من etalons. وقدم والمستقطب ومحلل لتحديد الاستقطاب الحادث والضوء المتناثرة. عادة ما يتم الحصول عليها الأطياف مع الاحتفاظ المستقطب الثابتة اختيار الاتجاه الرأسي (V) من الاستقطاب الضوء الساقط ومحلل اختيار بدلا من ذلك عمودي (V) سص أفقي (H) اتجاه الاستقطاب ضوء متناثرة. في هذا التكوين، تم الكشف عن وسائط صوتية الطولي والعرضي على التوالي.

وهناك طائفة Brillouin نموذجي لديه الذروة المركزية الشديدة بسبب تشتت مرن واحد أو أكثر من مجموعات من قمم تحولت على حد سواء، أو الحلل Brillouin، والتي هي التوقيع على اليات العينة. في هذه القياسات، يمكن أن الضوء المتناثرة تنشأ كلا من الفونونات السائبة السفر شبه متعامد على عينة و، وبعد تفكير من الضوء الساقط على واجهة عينة الركيزة، من الفونونات السائبة السفر موازية لسطح (وسائط PS). ⁹

ويبين الشكل 2 BLS أطياف من ألياف الكولاجين هضم التربسين الجافة والمائية التي تم الحصول عليها مع الاستقطاب VV عند 0.2 قرار غيغاهرتز، مع 30 غيغاهرتز النطاق الطيفي الحرة وحوالي 10 دقيقة وقت جمعفي الطيف. كل الطيف يقابل زاوية محددة من التناوب، θ (الشكل SI-1C). في ألياف الكولاجين الجاف في θ = 0 درجة، وسائط طولية تؤدي إلى ذروة السائبة في (18.92 ± 0.02) غيغاهيرتز، بينما وضع PS هو في (9.85 ± 0.03) جيجا هرتز (الشكل 2A). التحولات PS الذروة إلى ترددات منخفضة نسبيا حيث θ يذهب من 0 درجة (الطاقة الصوتية التحقيق التوجه المحوري للألياف) إلى 90 درجة (الطاقة الصوتية التحقيق التوجه شعاعي)، في حين أن ذروة السائبة إلا قليلا الحمراء التحولات على تغيير θ في نفس النطاق (الطاقة الصوتية يحقق اتجاه شبه شعاعي في جميع أنحاء دوران). في ألياف الكولاجين الرطب، قمم اثنين بسبب الفونونات الطولية هي دون تغيير أساسي في كافة مراحل التجربة، مع ذروة السائبة في كاليفورنيا 10.5 غيغاهرتز، وذروة PS في 4.9 غيغاهرتز (الشكل 2B). وهذا يدل على تخفيض بنسبة 80 إلى 100٪ في ذروة تردد (نسبة إلى بيانات 18.92و9.85 غيغاهرتز، على التوالي)، وبالتالي من صلابة من المواد، بسبب الماء. لاحظ أن وسائط السائبة وPS الكولاجين رطب تكمن وثيقة في وتيرة الى وسائط النقل من المياه النقية، مما يشير إلى أن ثوابتها المرنة هي مزيج من المساهمات الماء والألياف، مع الدور المهيمن الذي تلعبه المياه.

ويبين الشكل 3 مجموعة من هضم التربسين الجاف ألياف الكولاجين قياس في θ = 30 درجة مع VH الاستقطاب. تسرب من الاستقطاب VV تمكن PS وقمم السائبة للا يزال يتعين مراعاتها. وتمثل وسائط عرضية لذروته عند (4.1 ± 0.2) جيجا هرتز (θ = 0 درجة) والتي قليلا الزرقاء التحولات عن التغيرات θ من 0 درجة إلى 90 درجة. وأظهرت أيضا نتائج يصلح لكلا عرضية وقمم PS. تم استخراج المعلمات الذروة وكانت مشتقة سرعات الموجة الصوتية كما V _L = ت λ / √2، حيث م> v غير تردد الوضع الحصول عليها عن طريق تحليل منحنى مناسبا من القمم وλ هو الطول الموجي الإثارة و 532 نانومتر. لاحظ أنه في هذه الهندسة، لا يشترط معرفة معامل الانكسار من المواد للحصول على سرعة وضع الصوتية (نظرا لهندسة نثر، ف _ق = 2 ك _ط خطيئة (Φ)؛ الشكل SI-1B، ج)، وبالتالي جعل هذا النهج المفيد بشكل خاص.

الرقم 4 هو مؤامرة من سرعات الموجة الصوتية التي تم الحصول عليها من وسائط الطولي والعرضي (قمم PS وT) بوصفها وظيفة من θ زاوية . تحليل يصلح لنموذج متماثل سداسي مرنة صلبة ⁷ - المعادلات A1 و A2 أدناه - يوفر العناصر الخمسة للموتر مرونة الجاف نوع هضم التربسين أنا ألياف الكولاجين (الجدول 1).

ithin الصفحات = "1"> وترد السرعات الموجة الصوتية الطولي والعرضي بنسبة ⁹

(A1)

(A2)

حيث ρ هي كثافة المواد، وج _11، ج _33، ج _44، ج ₁₃ أربعة من خمسة الثوابت المرنة التي تميز الأنظمة مع التماثل سداسية. ثابت الخامس، ج _12، يمكن أن تستمد من العلاقة التقريبية ج ₁₂ ~ ج ₁₁ - 2 ج ₄₄ ⁷

معاملات مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في وقت سابق من عالم حواء الكولاجين غير المكررالتمرير يحدث ⁹ فرق ملحوظ لمعامل ج ₁₃ الذي ينعكس في قيم متشابهة من الرجوعية E مرونة _ǁ وE (ما يقرب من 7.2 و 7.7 جيغا) لالكولاجين تنقيته.

الرقم 5 هو مؤامرة من سرعة الموجة الصوتية طولية من الكولاجين الرطب مقابل θ . في هذه الحالة، يتم احترام أي تغيير الدوري في تردد، مما يتيح سرعة ثابتة في الخطأ ويبين الشكل 6 أطياف ألياف الإيلاستين الجافة والمائية قياس في θ = 0 درجة. لم يتم اكتشاف طرق عرضية لهذه العينات. في الإيلاستين الجافة، تحدث ذروة السائبة في 16.8 غيغاهرتز، بينما وضع PS في 8.2 غيغاهرتز ⁹ (13 و أقل من قمم المقابلة من الكولاجين الجافة 20٪). ألياف الإيلاستين الرطب تمثل الجزء الأكبر صEAK في (12.30 ± 0.01) غيغاهيرتز (بنسبة 37٪ في تردد من ذروة الجزء الأكبر من الإيلاستين الجافة). وضع PS الإيلاستين الرطب ليست واضحة في الطيف بسبب ذيل مكثفة من ذروة المرونة في تلك الترددات. من ناحية أخرى، ويعزى الذروة في كاليفورنيا 7.5 غيغاهرتز إلى كميات كبيرة من المياه.

ويبين الشكل (7) والاعتماد على سرعة الموجة الصوتية في ألياف الإيلاستين الجاف على θ. من هذه المعطيات، تم الحصول على المكونات مرونة العضلة الشادة (والرجوعية الميكانيكية) (الجدول 1). ⁹ كما هو الحال في الكولاجين الرطب، وهناك أدلة من توحد الخواص في معامل ميكانيكي من ألياف الإيلاستين المائية. وتشير هذه النتائج كيف Brillouin الطيفي يمكن أن تعطي معلومات ذات صلة عن صلابة وتكوينها والجوانب الهيكلية للمادة.

فايجوري 1. الصوتية والفونونات البصرية في سلسلة ذات بعد واحد من الذرات. رسم تخطيطي من الذبذبات الصوتية والبصرية في سلسلة ثنائية الذرة ذات بعد واحد. ذرات تكون كتلة m ₁ و م ₂ وبالتناوب. السهام تشير إلى نزوح الذرات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. Brillouin أطياف نوع تنقية التربسين أنا ألياف الكولاجين من وتر ذيل فأر. الأطياف من (A) الألياف الجافة و (ب) رطب الألياف من القياسات VV في زاوية مختلفة للألياف محور θ، في درجة. ويرد أيضا تشكيلة واسعة من الماء المقطر النقي. كانت أطياف تطبيع لشدة (الارتفاع) من ذروة السائبة. تسميات B و PS دلالة القمم المتعلقة بكميات كبيرة وسائط موازية لسطح، على التوالي. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري (الجذر التربيعي لعدد من التهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. Brillouin الطيف الجافة نوع تنقية التربسين أنا ألياف الكولاجين من وتر ذيل فأر. الطيف من قياس VH في θ = 30 درجة. تسميات T، PS وباء دلالة القمم المتعلقة المستعرضة، وسائط موازية لسطح والسائبة، على التوالي. وأظهرت أيضا نتائج تحليل مناسبا باستخدام نموذج ثبط المذبذب التوافقي (DHO) عن كل من وسائط T و PS. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري (الجذر التربيعي لعدد من التهم)./54648fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. قطعة سرعة الموجة الصوتية في وتنقيته التربسين الجاف الكولاجين مقابل زاوية لمحور الألياف. طولية وعرضية سرعات الموجة الصوتية من ألياف الكولاجين الجاف المستمدة من تحليل مناسبا من قمم Brillouin. يتم تجهيز البيانات إلى نموذج متماثل سداسي مرنة صلبة. خط أحمر: المعادلة A1 (R ² = 0.99)؛ الخط الأزرق: المعادلة A2 (R ² = 0.36). أشرطة الخطأ تشير إلى الأخطاء المعيارية التي تم الحصول عليها من الجذر التربيعي للعناصر قطري من مصفوفة التغاير بعد الخطية Levenberg-ماركوارت المربعات الصغرى تناسب أطياف Brillouin. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسي على هذا الرقم.

الرقم 5. مؤامرة من طولية سرعة الموجة الصوتية في الرطب الكولاجين تنقية التربسين مقابل زاوية لمحور الألياف. الطولية الصوتية سرعة موجة من ألياف الكولاجين رطب المستمدة من تحليل مناسبا من قمم Brillouin. خط يظهر هو دليل على العين ويعطي متوسط ​​قيمة سرعة الموجة الصوتية في هذا النطاق. أشرطة الخطأ تشير إلى الأخطاء المعيارية التي تم الحصول عليها من الجذر التربيعي للعناصر قطري من مصفوفة التغاير بعد الخطية Levenberg-ماركوارت المربعات الصغرى تناسب أطياف Brillouin. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

JPG "/>
الشكل 6. Brillouin أطياف ألياف الإيلاستين من الرباط القفوي البقري. الأطياف من الألياف جاف ورطب في θ = 0 درجة. كانت أطياف تطبيع لشدة (الارتفاع) من ذروة السائبة. تسميات B و PS دلالة القمم المتعلقة بكميات كبيرة وسائط موازية لسطح، على التوالي. ب _F و B _W الرجوع إلى قمم الجزء الأكبر من الألياف والماء، على التوالي. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري (الجذر التربيعي لعدد من التهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. قطعة والطولية سرعة الموجة الصوتية في الإيلاستين الجافة مقابل زاوية لمحور الألياف. الطولية الصوتية سرعة موجة الإيلاستين أكذوبة الجافإيه المستمدة من تحليل مناسبا من قمم Brillouin. يتم تجهيز البيانات إلى نموذج متماثل سداسي مرنة صلبة. خط أحمر: المعادلة A1 ⁹ (R ² = 0.74). أشرطة الخطأ تشير إلى الأخطاء المعيارية التي تم الحصول عليها من الجذر التربيعي للعناصر قطري من مصفوفة التغاير بعد الخطية Levenberg-ماركوارت المربعات الصغرى تناسب أطياف Brillouin. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم SI-1. يتم إرسالها التخطيطي لBrillouin انشاء وBLS نثر الهندسة. (أ) الضوء الساقط المنبعث من ليزر الحالة الصلبة إلى العينة من خلال عدسة مصاب بعمى الألوان. ضوء متفرقة عن طريق الفونونات الصوتية السائبة وتلك الناجمة عن reflection من الضوء على سطح الركيزة، والتي هي على اتصال مع العينة، يتم جمعها من قبل العدسة وتصفيتها عن طريق مقياس فابري-بيرو، جنبا إلى جنب والمتعددة الكشف عنها بواسطة مضخم. FP1 و FP2 تشير إلى تداخل اثنين تشكل جنبا إلى جنب انشاء. والمستقطب يختار استقطاب الضوء الساقط، ويستخدم محلل لتحديد استقطاب الضوء المتناثرة. (ب) الهندسة BLS مع العينة في اتصال مع سطح الركيزة السيليكون العاكسة. يتم وضع شريحة زجاجية (لا يظهر) أعلاه العينة لاغلاق المقصورة، ويتم تطبيق ضغط لطيف من خلال منصات في زوايا الركيزة. الضوء الساقط (ك _ط) يمر عبر العدسة، ينكسر في واجهة عينة الهواء (ك _'ط) والتي تركز على واجهة عينة الركيزة. والضوء المتناثرة التي جمعها عدسة نفسه (ك _{الصورة)} النتائج من التفاعل مع كل الفونونات السائبة (فب) وأولئك الذين يسافرون PS من العينة (ف _ق). . يشار إلى الزوايا بين الاتجاهات من ضوء وضعها الطبيعي على السطح كما Φ Φ و"(C) رسم تخطيطي للعينة ونظام الإحداثيات المعتمدة؛ تعرف ض محور مواز غير عادية لاتجاه الألياف. زوايا θ وα هي تلك بين اتجاه _الصورة الفونونات ف وف _ب أن ض -axis على التوالي ك _ط، ك _"ط، ك _ق، ك _{الصورة:} عدد الموجة من الحادث والمنتشرة النور؛ ف _ب، ف _{الصورة،} ناقلات موجة من الجزء الأكبر وسائط PS، على التوالي. (نقلا عن المرجع 9.) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. معاملات موتر مرنة مستمدة من تحليل مناسبا للسرعات الموجة الصوتية معاملات موتر المرنة الجافة نوع تنقية التربسين أنا ألياف الكولاجين (. هذا العمل) وألياف الإيلاستين (المرجع 9).

عينة	معاملات المرنة (جيد جدا)
الكولاجين هضم التربسين	ج 33	18.7 ± 0.1
	ج 11	14.4 ± 0.2
	ج 44	3.4 ± 0.1
	ج 12	7.2 ± 0.2
	ج 13	11.2 ± 0.3
الإيلاستين	ج 33	11.5 ± 0.2
	ج 11	10.4 ± 0.1
	ج 44	1.9 ± 0.2
	ج 12	6.6 ± 0.2
	ج 13	6.8 ± 0.3

Discussion

Brillouin تشتت الطيفي هو أداة فريدة من نوعها التي المكونات الفردية للموتر مرونة من ألياف البروتين يمكن وصفها بالتفصيل لم يسبق له مثيل. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء القياسات على نطاق والمجهرية، وبالتالي سوف توفر لنا رؤى جديدة في آليات الصغيرة الحجم من الهياكل البيولوجية، مما يسمح لنا، للمرة الأولى، لفهم الميكانيكية، وربما وظيفية، وأهمية التعقيدات في الهندسة المعمارية مصفوفة والكيمياء الحيوية والتي تم الكشف عنها في السنوات الأخيرة.

يقيس تقنية الخواص الميكانيكية في نطاق تردد غيغاهرتز. لم يتم البحث في هذا المجال قبل لالبوليمرات الحيوية الهيكلية وعلى حد سواء يثير ويوفر وسيلة للإجابة على الأسئلة الأساسية حول الآليات الجزيئية للمرونة.

وصفنا الخطوات لاستخراج الكولاجين والإيلاستين الألياف من الأنسجة الحيوانية ولقياس Brillouin scatteriنانوغرام الأطياف باستخدام الركيزة عاكسة لتحقيق صفا كاملا من الميكانيكا الحيوية الألياف. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي تلك التي تضمن أن يتم الحصول على ألياف النقاء والظروف التجريبية المناسبة في مكانها الصحيح لقياسات متكررة من البروتينات الليفية. ومع ذلك، فإنه يجب أن يوضع في الاعتبار أن إجراءات استخراج قد يغير من الخواص الميكانيكية للألياف.

إدخال تعديلات على هذه التقنية تنطوي على اقتران مع المجهر الضوئي لنثر Brillouin microfocused ورسم النهج ⁽¹³⁾ وتركيبة ممكنة مع التقنيات التكميلية (على سبيل المثال، رامان نثر). وتركز التطبيقات الحالية لهذه التقنية بشكل أساسي على المواد البيولوجية رفعه، ولكن التطورات الهامة، على سبيل المثال، تلك التي تقوم على عدة etalons VIPA ^14، تبذل الممكن ترجمة هذه التقنية من الفوق إلى السرير مع مجموعة واسعة من التطبيقات بالفعل شيطانstrated ^15،16 بما في ذلك إمكانية في تطبيقات الجسم الحي. النهج VIPA هو بديل لما وصفنا. انها أسرع وقت الشراء ولكن ليس بالضرورة مناسبا في حالة العينات مبهمة مثل تلك تحليلها هنا. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الركيزة عاكسة ليست عملية في مجموعة عمليات التي تستخدم etalons VIPA بسبب التباين من شأنه أن لا يكون كافيا لرفض ضوء شبه مرنة. القيود ذات الصلة لسرعة الحصول على مجموعة البيانات الطيفية وضعيفة بطبيعتها قسم نثر صليب المواد قد يحد من التطبيقات لالنظم البيولوجية الحيوية واكتساب البيانات من أعماق الأنسجة، ولكن التحسينات التقنية قد تحسن في الأداء الحالي.

BLS يعد بأن يكون أداة رئيسية في البحوث الفيزيائية الحيوية الأساسية في المصفوفة خارج الخلية، وبالتالي إلى إنتاج رؤى جديدة لتطور الخصائص الميكانيكية خلال النمو مصفوفة وخسارتهم في المرضيةانحطاط. ومع ذلك، من المهم أن نتذكر أن القياسات موسع، وبالتالي يمكن الاضطلاع بها في الجسم الحي. في الواقع، وقد تحقق هذا بالفعل في القرنية ¹⁶ وهذا العمل يمكن أن يوفر منصة لتطوير أدوات التشخيص الجديدة لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تصيب النسيج الضام.

الموجات فوق الصوتية elastography والقوة الذرية المجهر (AFM) طرق بديلة لقياس الميكرو ميكانيكية، ولكن تقدم تقنية BLS القرار المكانية أفضل (على نطاق والتحت خلوية) من السابق، وعلى عكس AFM، لا يفرض القوى الميكانيكية على عينة ولا يقتصر على تحليل فقط من السمات السطحية. الرجوعية Brillouin من الكولاجين والإيلاستين هي في حدود برنامج العمل العالمي، في حين الرجوعية الشباب من سلالات العيانية هي من ترتيب ميجا باسكال (سيتم الإبلاغ عن مزيد من التفاصيل في مكان آخر). وتشير هذه النتيجة إلى معامل المرونة التفاضلية مع الاعتماد القوي على وتيرة الإثارة، نظرا لالسلوك اللزجة من الألياف. BLS يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من المشاكل ومواد في العلوم الطبية الحيوية. ويمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض والأنسجة البيولوجية، فضلا عن توفير أداة المادية لفهم أساسي من المواد والتفاعلات على المستوى الجزيئي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C2905
Tris Buffer	Fluka	93358
Sodium Acetate	Fisher Scientific	S608-500
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Sodium Azide	Fisher Scientific	S2002
Streptomyces Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H1136-1AMP
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S7653
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4665
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Pure Water	Millipore	ZRQS0P3WW	Produced in-house
Distilled Water	Bibby Scientific Limited	D4000	Produced in-house from water still
Euthatal	Merial	J01601A
Tandem Interferometer TFP-1	JRS Scientific Instruments
Freezer	Lec	TU55144
Refrigerator	Zanussi	ZBA15021SA
Hot Plate	Fisher Scientific	SP88857206
Clamps	VWR	241-7311 & 241-7201
Clamp Stand	VWR	241-0093
Thermometer	Fisher Scientific	13-201-401
Cling Film	Sainsbury's	7650540
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Silicone	IDB Technologies	N/A	No catalogue number. Order upon request.
Cover Glass	VWR	631-1571
Conical Flask	VWR	214-1175
Beaker	VWR	213-0469
Measuring Cylinder	VWR	612-3838
Vial	VWR	548-0051 & 548-0863
Petri Dish	VWR	391-0441
Scalpel	Swann Morton Ltd	0914 & 0308
Diamond Scribe	RS Instruments	394-217
Soldering Iron	RS Instruments	231-5332
Fine Forceps	VWR	232-0188
Double Micro-Spatula	VWR	Various Sizes
pH Meter	Hanna Instruments	HI-2210-02
Orbital Shaker	IKA	0002819000