Préparation de la matrice extracellulaire des fibres de protéines pour Brillouin Spectroscopy

Résumé

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Résumé

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

Introduction

L'effet de diffusion de lumière Brillouin (BLS) a été découvert par Léon Brillouin en 1922. ¹ Il se compose de la diffusion inélastique de la lumière visible par les phonons acoustiques activés thermiquement dans un matériau. Dans la physique des solides, phonons acoustiques sont des vibrations cohérentes de tous les atomes dans un réseau. Une chaîne unidimensionnelle de deux types alternés d'atomes dans une maille est un modèle simple qui illustre la différence entre les phonons acoustiques, révélées par le BLS et les phonons optiques, sondé par absorption infrarouge et Raman (figure 1). phonons acoustiques sont des mouvements en phase des atomes dans la chaîne avec un déplacement le long de la direction de propagation (phonons acoustiques longitudinaux) ou perpendiculairement à la direction de propagation (transversales des phonons acoustiques), tandis que les phonons optiques sont des mouvements hors phase des atomes la production d'un moment dipolaire électrique oscillant (longitudinale ou modes transverses).

BLS spectroscopie a été utilisé dans la science analytique depuis les années 1920; cependant, seulement depuis les années 1980 ont des mesures de contraste élevé été possible grâce à l'utilisation du tandem multipass spectromètre Fabry-Perot. Depuis lors, un nombre croissant de progrès dans le BLS pour les applications analytiques de la matière condensée (où l'interaction photon-phonon est exploité) ^2-4 et magnétiques des matériaux (par le biais de l'interaction photon-magnon) ⁵ a été provoqué. Œuvres séminales sur les applications biomédicales ^6-8 ont ouvert la voie au développement de diverses approches, y compris celui qui est appliqué ici et celui précédemment décrit ⁹ en utilisant un substrat réfléchissant dans une configuration lamellaire pour obtenir la description complète du tenseur d'élasticité un échantillon.

Dans le présent travail, nous appliquons la spectroscopie BLS aux constituants fondamentaux de la matrice extracellulaire dans les tissus conjonctifs, les protéines fibreuses d'élastine et de collagène de type I-. Type collagène est une molécule hélicoïdale triple rigide qui assemble latéralement et longitudinalement avec croix vaste liaison pour former des fibres essentiellement rigides dans les tissus tels que les tendons. Réseaux de collagène coexistent souvent avec des réseaux d'élastine, une protéine qui, exceptionnellement, génère longue portée élasticité grâce à une combinaison de l'entropie et des interactions hydrophobes avec son environnement et est essentielle aux fonctions de tissus tels que les poumons et la peau. Les deux fibres sont modélisées à l' aide d' un modèle de cristal hexagonal dans la recherche actuelle. ⁹ Dans la partie 1, on décrit le protocole d' en extraire les fibres des tissus animaux et de préparer l'échantillon pour les mesures spectroscopiques. Dans la partie 2, la procédure de mise en place de l'appareil de Brillouin et l'acquisition de spectres à partir des fibres est présenté. La partie 3 donne des détails sur l'analyse des données appliquées aux spectres de Brillouin pour extraire les informations pertinentes contenues dans celui-ci mécanique. Ensuite, les résultats représentatifs sont présentés et discusseré.

Protocole

Attention: S'il vous plaît consulter les protocoles de sécurité biologique et toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Le laser utilisé dans ces expériences est un laser de classe 3B; respect des règles locales pour une utilisation sûre du système est nécessaire. S'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de l'exécution d'une mesure de la spectroscopie laser, y compris l'utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité).

tendons de queue ont été obtenus 7-8 semaine rats Wistar euthanasiés à d'autres fins, conformément à la réglementation européenne 1099/2009 et du bien-être des animaux (abattage ou mise à mort) Règlement 1995. Bovins ligament nuchal ont été obtenus à partir d'un abattoir local.

1. Préparation de l'échantillon des fibres

REMARQUE: Les fibres de protéines de la matrice extracellulaire peuvent être extraits de différents tissus, en utilisant des procédures différentes. Les protocoles ont été affinés sur la base de procédures largement appliquées.

1. Extraction des fibres de collagène de queue de rat
   1. Sacrifiez un rat par une injection intra-péritonéale de 100 mg / kg de pentobarbital de sodium de poids corporel. Ensuite, couper la queue directement au point de contact avec le corps, en appuyant avec une lame de rasoir simple de pointe. Envelopper la queue dans le film et le stocker congelé à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
   2. Recueillir la queue du congélateur, couper un 20 mm de long segment à partir de l'extrémité proximale tout en gelée, puis laisser décongeler dans une boîte de Pétri remplie de tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4) à la température ambiante.
   3. Une fois que la queue est décongelé, faire une incision le long de la longueur du segment à l'aide d'un scalpel pour séparer la peau. Puis peler pour révéler quatre faisceaux tendineux gainés sur la queue vertèbre.
   4. En utilisant des pinces fines et en faisant attention à ne pas appliquer de pré-déformation, tirer doucement chaque fibre hors de la gaine et le placer dans un flacon contenant de l' eau distillée avec 0,01% p / azoture de sodium v (NaN ₃₎ prla croissance bactérienne de l'événement, et conserver au réfrigérateur. Une seule queue donne une trentaine de fibres tendineuses.
   5. Pour obtenir le type fibreuse pure collagène, appliquer un processus de digestion enzymatique en trois parties ¹⁰ aux fibres tendineuses pour éliminer les protéoglycanes et tout autre matériel non collagénique.
      1. Tout d' abord, immerger les fibres dans 0,125 U / ml de chondroïtinase ABC en tampon Tris 0,05 M et 0,06 M d' acétate de sodium _(CH3COONa) à pH 8,0 pendant 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à agitation par secousses à 200 tours par minute.
      2. Ensuite, plonger les fibres dans 1 U / ml Streptomyces hyaluronidase dans tampon Tris 0,05 M et 0,15 M de chlorure de sodium (NaCl) à pH 6,0 et revenir à l'incubateur à agitation pendant 24 heures à 37 ° C.
      3. Enfin, immerger les fibres dans 1 mg / ml de trypsine dans du phosphate de sodium 0,05 M (NaHPO ₄₎ et 0,15 M de NaCl à pH 7,2 pendant 16 heures dans un incubateur sous agitation à 37 ° C.
   6. Stocker les fibres purifiées réfrigérés dans des flacons contenant de l'eau distillée, wie 0,01% de _NaN3 pour empêcher la croissance bactérienne, jusqu'à ce que nécessaire pour la mesure.
2. Extraction des fibres d' élastine de ligament nuchal bovin
   1. Obtenir ligament nuchal bovin de l'abattoir, l'envelopper dans une pellicule de plastique et de le stocker congelé à -20 ° C jusqu'à utilisation.
   2. Pour produire l' élastine pure, recueillir le ligament du congélateur, laisser décongeler à la température ambiante, dégraisser à l'aide d' un scalpel et digérer le ligament dans un bain d'eau bouillante selon la procédure Lansing, ¹¹ comme suit.
      1. Préparer une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau distillée à 0,1 M et l'ajouter au ligament dégraissée dans une fiole conique, recouvrant le tissu.
      2. Faire bouillir le ballon dans un bain d'eau à 95 ° C pendant 45 min.
      3. Enlever le ligament du flacon de digestion et on lave le bloc de tissu insoluble dans l'eau distillée à plusieurs reprises jusqu'à pH 7,0 (contrôlé en utilisant un pH-mètre) est obtenu.
      4. Retirer le tissu de la finalesolution de lavage et de l' immerger dans de l' eau distillée (mélangé avec 0,01% de _NaN3 pour empêcher la croissance bactérienne) dans un récipient fermé et le stocker au réfrigérateur.
   3. Recueillir le tissu du réfrigérateur et, en faisant attention de ne pas appliquer trop de force et de pré-contrainte, utiliser des pinces pour tirer doucement les petits segments d' élastine (20 à 50 mm de long, environ 2 mm d' épaisseur) de la plus grand bloc et placez - les dans une boîte de Petri avec une solution de PBS (pH 7,4).
   4. En utilisant des pinces fines, taquiner doucement petits faisceaux de fibres autour de 1 mm d'épaisseur et les couper à la longueur de quelques mm à l'aide d'un scalpel.
   5. Transférer les fibres dans des flacons contenant de l' eau distillée (avec 0,01% de _NaN3 pour empêcher la croissance bactérienne) et les stocker au réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire pour la mesure.
3. Montage des fibres sur substrat réfléchissant
   1. L'utilisation d'un tailleur de diamants, couper un morceau de lame de silicone réfléchissant.
   2. Pour créer un compartme hydratént, couper une bande de Parafilm à adapter sur la glissière de silicone avec une coupe creuse dans le centre (assez grand pour accueillir une fibre) et placez-le sur le substrat de silicone.
      NOTE: Pour les mesures de fibres sèches, couper le parafilm en une forme en U de telle sorte que l'un des quatre côtés reste ouvert à l'air lorsqu'il est scellé à l'étape 1.3.4.
   3. Retirez les fibres du réfrigérateur, utilisez une paire de pinces fines pour recueillir une fibre unique à partir de la solution de stockage et le placer dans une petite boîte de Pétri remplie d'eau pure à la température ambiante pendant 5 min pour laver l'échantillon. Ensuite, collecter les fibres et le transférer vers le centre du creux du parafilm sur le substrat en silicone.
      Attention: Ne pas endommager la fibre en l'étirant au cours de cette opération, et éviter réorientant l'échantillon sur le substrat car cela peut entraîner une modification des propriétés mécaniques.
   4. Placer une mince lamelle de verre au-dessus de la fibre et sceller la chambre par le passage d'un fer à souder chauffé doucement sur la surface du verre pour faire fondre le parafilm au-dessousle verre.
      Attention: Ne pas endommager la fibre en ne mettant pas la pointe de soudage trop près ou trop chauffer le substrat.
   5. Placez la chambre étanche sur une surface plane sous un petit poids et le laisser pendant environ 12 heures pour obtenir un bon contact entre le substrat de l'échantillon et de silicium, tout en évitant d'endommager le spécimen.
   6. Retirez le poids et fixer la chambre en place sur le substrat, à l'aide des vis.

2. Mise en place l'expérience de Brillouin et acquisition de fibre Spectra

1. Préparation du compartiment d'échantillon
   1. Monter l'échantillon préparé comme dans la partie 1.3 sur un support vertical équipé d'un goniomètre pour permettre la rotation dans le plan de l'échantillon , tout en maintenant un angle de diffusion constant (2 Φ = 90 °; voir la figure SI-1) et la diffusion position de volume.
   2. Effectuer un réglage de mise au point précise de la lumière laser sur l'échantillon à travers le chierns. ⁹
      Attention: La puissance de sortie de laser peut être trop élevé et de produire une brûlure dans l'échantillon. Assurez-vous qu'il est réglé suffisamment élevé pour donner une bonne sensibilité, mais pas trop élevée pour éviter d'endommager l'échantillon. Ici , nous avons utilisé une puissance d'environ 76 mW sur l'échantillon. Cela était suffisant pour obtenir une bonne sensibilité sans brûler l'échantillon, considérant également que c'est mince et en contact avec un substrat qui aide à dissiper la chaleur générée par l'éclairage au laser.
   3. Placer l'échantillon à un angle de 45 ° (Φ) au faisceau laser incident en utilisant une échelle Vernier. Atteindre un positionnement optimal en exécutant une mesure et en maximisant l'intensité des pics dans le spectre (voir ci-dessous).
2. Mise en place du spectromètre
   1. Ouvrez le logiciel pour l' acquisition et la manipulation des données et mettre en place l'acquisition d'un spectre de l'échantillon de ¹² Brillouin. La procédure décrite ici est valable pour le multipass tandem interféromètre (Figure SI-1A).
   2. Aligner les deux Fabry-Pérot (FP), l'évolution des interféromètres de manière indépendante les tensions appliquées à l'élément piézoélectrique par l'unité de commande. Pour cette procédure de pré-alignement, observer la lumière réfléchie par chaque FP. Lorsque l'intensité réfléchie par les deux points focaux tend vers zéro, l'alignement correct soit atteint.
   3. Calibrer le spectre: la gamme de fréquences accessibles, ou une plage spectrale libre (FSR), dépend de la distance entre les deux miroirs de la première cavité FP, L, par FSR = c / 2 L, où c est la vitesse de la lumière et L est mesurée par une jauge d' accès à distance.
   4. Synchroniser les scans des deux interféromètres FP et mettez le système optique à la configuration tandem multipass. Un contrôle de rétroaction de l'intensité de la lumière transmise par laser maintient automatiquement l'alignement des deux points focaux pendant la mesure.
3. mesure of Brillouin Spectra
   Attention: Le spectre de Brillouin est fortement dépendante de la température et de l'hydratation de l'échantillon et de contrôle de manière attentive de ces paramètres est essentielle pour obtenir des spectres reproductibles.
   1. Lancement de l'acquisition d'un spectre de l'échantillon de Brillouin et l'exécuter jusqu'à ce qu'un bon rapport signal-bruit est atteint. Cela peut prendre plusieurs minutes en fonction de la diffusion de la section transversale, la concentration et l'épaisseur de l'échantillon.
      NOTE: Il n'y a pas une règle de base pour le rapport signal-bruit, mais la qualité spectrale est vérifiée par l'expérimentateur sur la base de l'échantillon spécifique analysé. Il y a un compromis entre la qualité spectrale et la durée de la mesure, par conséquent, les paramètres expérimentaux doivent être sélectionnés en fonction de l'application spécifique.
   2. Pour la mesure d'un échantillon sec, prendre spectres successifs - pour chacun d'eux, après l'étape 2.3.1 - jusqu'à aucun changement dans la position des pics is observées. Ce résultat est obtenu lorsque l'échantillon est à l'équilibre avec l'atmosphère ambiante et sans séchage supplémentaire aura une incidence sur le spectre.
   3. Sélectionner la polarisation de la lumière (VV ou VH, V représente verticale et H pour une direction horizontale de la polarisation de la lumière par rapport au plan de diffraction) et l' acquisition des spectres à chaque angle par rapport à l' axe de fibre (θ, la figure SI-1) en faisant tourner l'échantillon avion à la main.
   4. Enregistrer les spectres de Brillouin à déposer pour un traitement ultérieur.

3. L'analyse des spectres Brillouin

NOTA: Ajuster l'analyse des pics de Brillouin peuvent être effectuées en utilisant diverses fonctions. Un amorti oscillateur harmonique (DHO) fonction ^4,13 a été choisie comme cela est un modèle valable pour les pics provenant de modes acoustiques amorties dans les milieux viscoélastiques.

1. Analyse Fit des pics de Brillouin
   1. Sélectionnez la plage spectrale pour le pic d'intérêt pour ee Brillouin spectre.
   2. Activer une ligne de base à l'ajustement si le fond spectral est nettement supérieur à zéro.
      NOTE: La ligne de base peut varier entre les spectres. Faire en sorte que la correction est appliquée d'une manière systématique et reproductible.
   3. Appliquer une analyse détaillée moindres carrés en utilisant une fonction DHO ^4,13 au pic de Brillouin d'intérêt de manière itérative jusqu'à ce que la convergence soit atteinte et le meilleur ajustement de courbe est obtenue. Ensuite, enregistrez les résultats aptes à déposer.
   4. Obtenir des valeurs moyennes des paramètres d'ajustement des deux pics de chaque doublet de Brillouin.
   5. Calculer la vitesse de l'onde acoustique à la fréquence de crête (en utilisant l'expression ci-dessous).
   6. Tracer les résultats d' ajustement par le biais de graphiques, par exemple, la vitesse de l' onde acoustique par rapport à l' angle d'axe de la fibre, θ , Et appliquer des modèles pertinents (par exemple, pour les systèmes acoustiques anisotropes ⁹⁾ pour extraire des grandeurs mécaniques tels que les coefficients d' élasticité du tenseur.

Résultats

L'appareil de spectroscopie de Brillouin utilisé dans cette expérience (figure SI-1A) a été décrit précédemment. ⁹ On utilise un mode unique de 532 nm du laser à l' état ​​solide avec 76 mW de puissance de sortie au niveau de l'échantillon. Une lentille achromatique 20 cm focalise la lumière laser sur l'échantillon et à recueillir la lumière diffusée par l'échantillon dans une géométrie de rétrodiffusion. Un tandem multipass Fabry-Pérot est utilisée pour filtrer la lumière diffusée, qui est alors détectée par un détecteur à photodiode à faible bruit. Cette approche donne un contraste très élevé (environ 120 dB) et la stabilité par piézo-balayage d'auto-alignement des étalons. Un polariseur et analyseur sont introduits pour sélectionner la polarisation de l'incident et la lumière diffusée. Les spectres sont habituellement obtenus avec le polariseur maintenu fixe la sélection de la direction verticale (V) de la polarisation de la lumière incidente et de l'analyseur en sélectionnant alternativement la verticale (V) or horizontal (H) en direction de la polarisation de la lumière diffusée. Dans cette configuration, les modes acoustiques longitudinaux et transversaux sont détectés respectivement.

Un spectre de Brillouin typique a un pic central intense due à la diffusion élastique et un ou plusieurs ensembles de pics également décalés, ou doublets Brillouin, qui sont la signature de la mécanique de l'échantillon. Dans ces mesures, la lumière diffusée peut provenir à la fois de phonons en vrac voyagent quasi-orthogonal à l'échantillon et, après réflexion de la lumière incidente à l'interface échantillon-substrat, de phonons en vrac se déplaçant parallèlement à la surface (modes PS). ⁹

La figure 2 montre les spectres BLS des fibres de collagène trypsine digéré secs et hydratés obtenus avec VV polarisation à une résolution de 0,2 GHz, avec une gamme spectrale libre 30 GHz et environ 10 min temps de collectepar spectre. Chaque spectre correspond à un angle de rotation spécifique, θ (Figure SI-1C). En fibre de collagène sec à θ = 0 °, les modes longitudinaux donnent lieu à un pic en vrac à (18,92 ± 0,02) GHz tandis que le mode PS est à (9,85 ± 0,03) GHz (figure 2A). Les décalages PS de pointe à des fréquences plus basses que θ entre 0 ° (phonon sonder l'orientation axiale de la fibre) à 90 ° (phonon sonder l'orientation radiale), alors que le pic en vrac seulement légèrement rouge-quarts sur l' évolution θ dans la même gamme (phonons sondant une direction quasi-radiale à travers la rotation). En fibre de collagène humide, les deux pics dus à phonons longitudinaux sont essentiellement inchangés tout au long de l'expérience, avec le pic en vrac à environ 10,5 GHz et le pic PS à 4.9 GHz (figure 2B). Ceci indique une réduction de 80 à 100% de la fréquence maximale (par rapport aux données de 18,92et 9,85 GHz, respectivement), et par conséquent de la rigidité du matériau, en raison de l'hydratation. Notez que les modes de collagène hydraté en vrac et PS se trouvent à proximité de la fréquence des modes d'eau pure, ce qui suggère que ses constantes élastiques sont une combinaison des contributions de l'eau et de fibres, avec un rôle dominant joué par l'eau.

La figure 3 montre un spectre de fibre de collagène digéré par la trypsine sec mesurée à θ = 30 ° avec VH polarisation; une fuite de la polarisation VV permet le PS et des pics en vrac à observer encore. Modes transverses représentent un pic à (4,1 ± 0,2) GHz (θ = 0 °) qui a légèrement bleu-quarts que les changements thetav de 0 ° à 90 °. résultats Fit pour les deux transversales et des pics PS sont également représentés. Paramètres de pointe ont été extraites et les vitesses des ondes acoustiques ont été calculées comme V _L = v λ / √2, où v est la fréquence du mode obtenu par analyse de la courbe d'ajustement des pics et λ est la longueur d' onde d'excitation, 532 nm. Notez que dans cette géométrie, la connaissance de l'indice de réfraction du matériau n'est pas nécessaire pour obtenir la vitesse de mode acoustique ( en raison de la géométrie de diffusion, q _s = 2 k _i sin (Φ); Figure SI-1b, c), d' où rendant cette approche particulièrement avantageuse.

Figure 4 est une représentation graphique des vitesses des ondes acoustiques obtenues à partir de modes longitudinaux et transversaux (PS et T pics) en fonction de l'angle θ . Analyse Fit à un modèle de symétrie hexagonale solide élastique ⁷ - Equations A1 et A2 ci - dessous - fournit les cinq composantes du tenseur d'élasticité de type trypsine digéré sec collagène des fibres (tableau 1).

Les vitesses des ondes acoustiques longitudinales et transversales sont données par ⁹

(A1)

(A2)

où ρ est la densité du matériau, c _11, c _33, c ₄₄ et c ₁₃ sont quatre des cinq constantes élastiques qui caractérisent les systèmes avec une symétrie hexagonale. La cinquième constante, c _12, peut être déduit de la relation approchée C ₁₂ ~C _11. - 2 c ₄₄ ⁷

Les coefficients sont similaires à celles précédemment obtenues à partir de collagène non purifié fibers. ⁹ Une différence notable se produit pour le coefficient c ₁₃ qui se reflète dans les mêmes valeurs de modules élastiques E _ǁ et E (Environ 7,2 et 7,7 GPa) pour le collagène purifié.

La figure 5 est un tracé de la vitesse de l' onde acoustique longitudinale de collagène humide par rapport θ . Dans ce cas, aucune modification périodique de la fréquence est observée, ce qui donne une vitesse constante à l'intérieur de l'erreur. La figure 6 montre les spectres des fibres d'élastine et hydratée sèche mesurée à thetav = 0 °. modes Transverse ne sont pas détectés pour ces échantillons. En élastine sec, le pic se produit en vrac à 16,8 GHz tandis que le mode PS à 8,2 GHz ⁹ (13 et 20% de moins que les pics de collagène sec correspondant). les fibres d'élastine par voie humide présentent un encombrement pEAK à (12.30 ± 0.01) GHz (37% de moins en fréquence que le pic de l'élastine en vrac sec). Le mode PS de l'élastine humide ne ressort pas dans le spectre en raison de la queue intense du pic élastique à ces fréquences. D'autre part, le pic à environ 7,5 GHz est attribuée à l'eau en vrac.

La figure 7 montre la dépendance de la vitesse de l' onde acoustique en fibre de élastine sec sur θ. A partir de ces données, les composantes du tenseur d' élasticité (et des modules mécaniques) ont été obtenus (tableau 1). ⁹ Comme dans le collagène humide, il existe des preuves d'isotropie dans le module mécanique de fibres d'élastine hydratées. Ces résultats indiquent la spectroscopie de Brillouin peut donner des informations importantes sur la rigidité, la composition et les aspects structurels d'un matériau.

Fi1. gurer acoustiques et phonons optiques dans la chaîne unidimensionnelle des atomes. Schéma de vibrations acoustiques et optiques dans une chaîne diatomique unidimensionnel. Atomes ont une masse m ₁ et m ₂ et sont alternées. Les flèches indiquent les déplacements des atomes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Les spectres Brillouin de type trypsine purifiée de collagène de fibres à partir d'un tendon de queue de rat. Les spectres de (A) fibres sèches et (B) hydraté fibre à partir de mesures VV selon un angle différent de fibre axe θ en degrés. Un spectre de l'eau distillée pure est également représentée. Les spectres ont été normalisées par rapport à l'intensité (hauteur) du pic de masse. B étiquettes et PS indiquent les pics liés à la masse et les modes parallèles à la surface, respectivement. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type (racine carrée du nombre de coups). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure spectre de type trypsine purifiée sèche 3. Brillouin collagène des fibres de queue de rat tendon. Spectre d'une mesure VH à θ = 30 °. T étiquettes, PS et B désignent les pics liés aux modes transversaux, parallèles à la surface et la masse, respectivement. Les résultats de l'analyse en forme en utilisant un modèle oscillateur harmonique amorti (DHO) pour les deux modes T et PS sont également représentés. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type (racine carrée du nombre de comptes)./54648fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Terrain de la vitesse de l' onde acoustique dans sec collagène de type trypsine purifiée vs angle à l' axe de la fibre. Vitesses des ondes acoustiques longitudinales et transversales de la fibre de collagène sec provenant de l' analyse en forme des pics de Brillouin. Les données sont montés sur un modèle de solide élastique hexagonale symétrique. Ligne Rouge: Equation A1 (R ² = 0,99); ligne bleue: l' équation A2 (R ² = 0,36). Les barres d'erreur indiquent les erreurs types obtenues à partir de la racine carrée des éléments diagonaux de la matrice de covariance après un non - linéaires de Levenberg-Marquardt moindres carrés des spectres de Brillouin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versi sur ce chiffre.

Figure 5. Terrain de la vitesse de l' onde acoustique longitudinale humide collagène de type trypsine purifiée vs angle à l' axe de la fibre. Vitesse de l' onde acoustique longitudinale de la fibre de collagène hydraté dérivé de l' analyse en forme des pics de Brillouin. La ligne représentée est un guide pour l'œil et donne la valeur moyenne de la vitesse de l'onde acoustique dans cette gamme. Les barres d'erreur indiquent les erreurs types obtenues à partir de la racine carrée des éléments diagonaux de la matrice de covariance après un non - linéaires de Levenberg-Marquardt moindres carrés des spectres de Brillouin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. Brillouin spectres des fibres d' élastine de ligament nuchal bovin. Spectra de fibre sèche et hydratée à θ = 0 °. Les spectres ont été normalisées par rapport à l'intensité (hauteur) du pic de masse. B étiquettes et PS indiquent les pics liés à la masse et les modes parallèles à la surface, respectivement. B _F et B _W désignent les pics en vrac de la fibre et de l' eau, respectivement. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type (racine carrée du nombre de coups). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Terrain de la vitesse de l' onde acoustique longitudinale dans élastine sec vs angle à l' axe de la fibre. De vitesse de l' onde acoustique longitudinale fib élastine sècheer dérivé de l'analyse en forme des pics de Brillouin. Les données sont montés sur un modèle de solide élastique hexagonale symétrique. Ligne Rouge: Equation A1 ⁹ (R ² = 0,74). Les barres d'erreur indiquent les erreurs types obtenues à partir de la racine carrée des éléments diagonaux de la matrice de covariance après un non - linéaires de Levenberg-Marquardt moindres carrés des spectres de Brillouin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure SI-1. Schéma du Brillouin set-up et BLS géométrie de diffusion. (A) La lumière incidente émise par un laser à l' état ​​solide est envoyé à l'échantillon à travers une lentille achromatique. La lumière diffusée par les phonons acoustiques de volume et par ceux résultant de réflection de lumière à la surface du substrat, qui est en contact avec l'échantillon est collecté par la lentille, filtré par un interféromètre de Fabry-Pérot en tandem multipass et détectée par un photomultiplicateur. FP1 et FP2 indiquent les deux interféromètres constituant le tandem set-up. Un polariseur sélectionne la polarisation de la lumière incidente, et un analyseur est utilisé pour sélectionner la polarisation de la lumière diffusée. (B) la géométrie du BLS avec un échantillon en contact avec la surface d'un substrat de silicium réfléchissant. Une lame de verre (non représenté) est placé au-dessus du spécimen pour sceller le compartiment, et une légère pression est appliquée par des tampons aux quatre coins du substrat. La lumière incidente (k _i) passe à travers la lentille, est réfractée à l'interface air-échantillon (k _'i) et concentré à l'interface échantillon-substrat. La lumière diffusée recueillie par la même lentille (k _'s) résulte de l' interaction avec les deux phonons en vrac (qb) et ceux qui voyagent PS de l'échantillon (q _s). . Angles entre les directions de la lumière et la normale à la surface sont indiqués comme Φ et Φ '(C) Diagramme schématique de l'échantillon et du système de coordonnées adopté; z définit l'axe extraordinaire parallèle à la direction des fibres. Angles θ et α sont celles entre la direction de phonons q _s et q _b à l'axe z, respectivement k _i, k _'i, k _s, k' _s:. Nombres d' onde de l'incident et la lumière diffusée; q _b, q _s, les vecteurs d'onde de l'encombrement et le mode PS, respectivement. (Reproduit de ref 9.) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. coefficients de tenseurs élastiques dérivées de l' analyse ajustement des vitesses des ondes acoustiques coefficients de tenseurs élastiques de trypsine purifiée de type sec collagène fibres (. ce travail) et les fibres d'élastine (ref 9).

échantillon	coefficients élastiques (GPa)
collagène digéré par la trypsine	c 33	18,7 ± 0,1
	c 11	14,4 ± 0,2
	c 44	3,4 ± 0,1
	12 c	7,2 ± 0,2
	c 13	11,2 ± 0,3
élastine	c 33	11,5 ± 0,2
	c 11	10,4 ± 0,1
	c 44	1,9 ± 0,2
	12 c	6,6 ± 0,2
	c 13	6,8 ± 0,3

Discussion

spectroscopie de Brillouin est un outil unique, par lequel les différents composants du tenseur d'élasticité d'une fibre de protéine peuvent être caractérisées en détail sans précédent. En outre, les mesures peuvent être effectuées à l'échelle microscopique et ainsi nous fournira de nouveaux aperçus sur les mécanismes de micro-échelle des structures biologiques, ce qui nous permet, pour la première fois, de comprendre la mécanique, et probablement fonctionnelle, l'importance de la complexité dans l'architecture de la matrice et de la biochimie qui a été révélé au cours des dernières années.

La technique de mesure des propriétés mécaniques dans une gamme de fréquences des GHz. Ce domaine n'a jamais été explorée auparavant pour les biopolymères structurelles et à la fois élève et fournit les moyens de répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes moléculaires de l'élasticité.

Nous avons décrit les étapes consistant à extraire les fibres de collagène et d'élastine dans les tissus animaux et pour mesurer Brillouin scatteriLes spectres ng utilisant un substrat réfléchissant pour obtenir la description complète de la biomécanique de la fibre. Les étapes critiques au sein du protocole sont ceux qui assurent que les fibres purifiées sont obtenues et les conditions expérimentales appropriées sont en place pour des mesures reproductibles des protéines fibreuses. Cependant, il faut garder à l'esprit que les procédures d'extraction peuvent modifier les propriétés mécaniques des fibres.

Des modifications de la technique impliquent le couplage par microscopie optique pour microfocused diffusion de Brillouin et une cartographie des approches ¹³ et la combinaison possible avec des techniques complémentaires (par exemple, la diffusion Raman). Les applications actuelles de la technique sont principalement axées sur les matériaux biologiques excisées, mais les développements importants, par exemple, celles qui sont fondées sur plusieurs étalons de VIPA ^14, font possible la traduction de cette technique de la paillasse au chevet avec une gamme d'applications déjà démon^15,16 tré y compris le potentiel pour des applications in vivo. L'approche VIPA est une alternative à ce que nous décrivons; il a plus rapide temps d'acquisition, mais ne sont pas nécessairement appropriés dans le cas des échantillons opaques tels que ceux analysés ici. De plus, l'utilisation d'un substrat réfléchissant est pas pratique dans set-ups qui utilisent les étalons VIPA parce que leur contraste ne serait pas suffisante pour rejeter la lumière quasi-élastique. Les contraintes liées à la vitesse d'acquisition d'un ensemble de données spectrales et la section intrinsèquement faible diffusion de la croix de la matière peuvent limiter les applications à des systèmes biologiques dynamiques et à l'acquisition de données à partir de profondeur dans les tissus, mais des améliorations techniques peuvent améliorer les performances actuelles.

BLS promet d'être un outil majeur dans la recherche biophysique fondamentale sur la matrice extracellulaire et ainsi de produire de nouvelles connaissances sur l'évolution des propriétés mécaniques lors de la croissance de la matrice et leur perte pathologiquedégénérescence. Cependant, il est important de se rappeler que les mesures sont non invasive et pourraient donc être menées in vivo. En effet, cela a déjà été réalisé dans la cornée ¹⁶ et ce travail peut fournir une plate - forme pour le développement de nouveaux outils diagnostiques pour un large éventail de maladies du tissu conjonctif.

élastographie par ultrasons et la microscopie à force atomique (AFM) sont d'autres méthodes de mesure micromécanique, mais la technique BLS offre une meilleure résolution spatiale (sur une échelle subcellulaire) que l'ancien et, contrairement à l'AFM, impose pas de forces mécaniques sur l'échantillon et ne se limite pas à l'analyse uniquement des caractéristiques de surface. moduli Brillouin de collagène et d'élastine sont dans la gamme GPa, tandis que les modules d'Young de souches macroscopiques sont de l'ordre de MPa (plus de détails seront signalés ailleurs). Ce résultat indique un module d'élasticité différentiel avec une forte dépendance à la fréquence d'excitation, grâce àle comportement viscoélastique des fibres. BLS peuvent être appliquées à un large éventail de problèmes et les matériaux en sciences biomédicales. Il peut aider à répondre aux questions sur la physiologie et la pathologie des tissus biologiques, ainsi que de fournir un outil physique pour la compréhension fondamentale des matériaux et des interactions au niveau moléculaire.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chondroitinase ABC	Sigma-Aldrich	C2905
Tris Buffer	Fluka	93358
Sodium Acetate	Fisher Scientific	S608-500
PBS	Sigma-Aldrich	P4417
Sodium Azide	Fisher Scientific	S2002
Streptomyces Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H1136-1AMP
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S7653
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4665
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Pure Water	Millipore	ZRQS0P3WW	Produced in-house
Distilled Water	Bibby Scientific Limited	D4000	Produced in-house from water still
Euthatal	Merial	J01601A
Tandem Interferometer TFP-1	JRS Scientific Instruments
Freezer	Lec	TU55144
Refrigerator	Zanussi	ZBA15021SA
Hot Plate	Fisher Scientific	SP88857206
Clamps	VWR	241-7311 & 241-7201
Clamp Stand	VWR	241-0093
Thermometer	Fisher Scientific	13-201-401
Cling Film	Sainsbury's	7650540
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Silicone	IDB Technologies	N/A	No catalogue number. Order upon request.
Cover Glass	VWR	631-1571
Conical Flask	VWR	214-1175
Beaker	VWR	213-0469
Measuring Cylinder	VWR	612-3838
Vial	VWR	548-0051 & 548-0863
Petri Dish	VWR	391-0441
Scalpel	Swann Morton Ltd	0914 & 0308
Diamond Scribe	RS Instruments	394-217
Soldering Iron	RS Instruments	231-5332
Fine Forceps	VWR	232-0188
Double Micro-Spatula	VWR	Various Sizes
pH Meter	Hanna Instruments	HI-2210-02
Orbital Shaker	IKA	0002819000