JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Abstract

الساعات الإيقاعية وظيفية في جميع الكائنات الحساسة للضوء، مما يسمح للتكيف مع العالم الخارجي عن طريق توقع التغيرات البيئية اليومية. وقد تم إحراز تقدم كبير في فهمنا للعلاقة الوثيقة بين الساعة الإيقاعية ومعظم جوانب علم وظائف الأعضاء في المجال على مدى العقد الماضي. ومع ذلك، كشف الأساس الجزيئي الذي يكمن وراء وظيفة مذبذب الساعة البيولوجية في الإنسان يبقى من أعلى تحديا تقنيا. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا لنهج تجريبي لفترة طويلة الأجل (2-5 أيام) تسجيل تلألؤ بيولوجي وجمع تدفق المتوسطة في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة. لهذا الغرض، قمنا transduced الخلايا الأولية مع مراسل وسيفيراز lentiviral التي هي تحت سيطرة أحد المروجين الجين الساعة الرئيسية، والذي يسمح لتقييم مواز من إفراز هرمون وتلألؤ بيولوجي الإيقاعية. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الظروف لتعطيل الساعة اليومية في العلاقات العامةالخلايا البشرية imary التي transfecting سيرنا استهداف مدار الساعة. نتائجنا على تنظيم الساعة البيولوجية من إفراز الأنسولين من البنكرياس الجزر الإنسان، وإفراز myokine من قبل خلايا العضلات والهيكل العظمي الإنسان، وهي معروضة هنا لتوضيح تطبيق هذه المنهجية. ويمكن استخدام هذه الإعدادات لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتحليل تأثيرها وظيفية في الخلايا الأولية في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية.

Introduction

برز نظام توقيت الساعة البيولوجية (من اللاتينية "حوالي عام اليومية") في جميع الكائنات الحساسة للضوء، وآلية التكيف مع دوران الأرض. في الثدييات، ويتم تنظيم ذلك بطريقة هرمية، ويشمل على مدار الساعة المركزية، والتي تقع في النواة التأقلم من منطقة ما تحت المهاد بطني، والطرفية (أو الرقيق) مؤشرات التذبذب التي هي عميلة في الأجهزة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا ذاتية الحكم مؤشرات التذبذب مكتفية ذاتيا وظيفية تقريبا في كل خلية من خلايا الجسم 1. تمثل إشارات ضوئي جديلة مزامنة المهيمنة (Zeitgeber) لالخلايا العصبية SCN، في حين أن الإشارات العصبية والخلطية المنبثقة عن اللجنة الدائمة للتغذية إعادة تعيين الساعات الطرفية. وبالإضافة إلى ذلك ايقاعات بقية النشاط، التي تدفع في دورات التغذية الصيام بدوره، هي المزيد من المزامنات لساعات الطرفية 2. وفقا لفهمنا الحالي، يستند ماكياج الجزيئي للساعة رئيسية على النسخي وtranslaالحلقات ردود الفعل tional، والتي يتم حفظها بين الكائنات الحية. هذا يضم منشطات النسخ BMAL1 وعلى مدار الساعة، التي تنشط معا النسخ للجينات الساعة الأساسية لكل وCRY السلبية. ومستويات عالية من PER والبروتينات CRY تمنع النسخ الخاصة بهم من خلال تثبيط مجمع / ساعة BMAL1. وتتكون حلقة المساعدة من المستقبلات النووية REV-ERBs وRORs، التي تنظم أيضا نسخ من BMAL1 وعلى مدار الساعة. وعلاوة على ذلك، والأحداث posttranslational بما في ذلك الفسفرة، sumoylation، أستلة، O-GlcNAcylation والتدهور والدخول النووي من البروتينات على مدار الساعة الأساسية تمثل طبقة تنظيمية هامة إضافية في إنشاء 24 ساعة التذبذب دورة 3.

ينبع الأدلة التراكمية من الدراسات التي أجريت في نماذج القوارض ويسلط الضوء على الدور الحاسم للنظام الساعة البيولوجية في تنسيق التمثيل الغذائي والغدد الصماء وظائف 4-5. وهناك عدد من تأالبريد نطاق التحليل Transcriptome على تشير إلى أن التغذية - الصيام دورات تلعب دورا مركزيا في تزامن مؤشرات التذبذب الطرفية 6-8. في اتفاق مع هذه الدراسات، وقد كشف تحليل metabolomic وlipidomic في القوارض والبشر أن عددا كبيرا من المركبات تتذبذب في الأنسجة، والبلازما، واللعاب بطريقة الإيقاعية 9-11. الأهم من ذلك، معظم الهرمونات يحمل إيقاعات الساعة البيولوجية في 5،12-13 الدم. وعلاوة على ذلك، والساعات الإيقاعية من هرمون المقابلة إنتاج الأنسجة الطرفية قد ينظم إفراز هرمون محليا. وقد وصفت مؤشرات التذبذب الإيقاعية خلايا مستقلة في القوارض والخلايا خلايا البنكرياس البنكرياس الإنسان 14-16. هذه المؤشرات تلعب دورا أساسيا في تنظيم Transcriptome على جزيرة البنكرياس وظيفة 15،17-18. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت myokine إفراز بواسطة myotubes الهيكل العظمي البشري مؤخرا لعرض نمط الإيقاع اليومي، الذي ينظمه oscillato خلايا مستقلةالتمرير المنطوق في هذه الخلايا 19.

وقد استخدمت عدة طرق لدراسة ايقاعات كل يوم في البشر في الجسم الحي على نطاق واسع. على سبيل المثال، تم دراستها الميلاتونين البلازما أو مستويات الكورتيزول وكذلك الصدرية درجة حرارة سطح الجلد (إعادة النظر في المراجع 3،20) لتقييم الساعات الساعة البيولوجية الداخلية. على الرغم من أن هذه الأساليب تسمح دراسة التذبذبات الإيقاعية النظامية في الجسم الحي، فهي بعيدة كل البعد عن توفير تقييم دقيق لإيقاعات الساعة البيولوجية مستقلة خالية من يعمل في الأجهزة والأنسجة المختلفة. ومع ذلك، فإن مثل هذا التشريح من التنظيم المنهجي أن يكون أداة لا غنى عنها لفهم تأثير معين من الساعات الجزيئية الخلايا على وظيفة هذه الخلايا. ولذلك، فقد بذلت جهدا كبيرا لوضع نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسة الساعات الإنسان في الخلايا المستزرعة مخلد أو الأولية متزامنة في المختبر. الأهم من ذلك، وقد ثبت أنخصائص ساعة قياس في الخلايا الأولية الليفية الجلد مثقف تعكس بشكل وثيق خصائص مدار الساعة الفردية الكائن الحي كله 21. تطوير صحفيين الساعة البيولوجية الفلورسنت وإضاءة الحيوية التي تقدمت كثيرا هذا النهج 22-27. وعلاوة على ذلك، ودراسة الساعات الخلية الأولية التي هي مستمدة من الأجهزة الطرفية المختلفة تتيح للتحقيق في الخصائص الجزيئية من الساعات الأنسجة محددة الإنسان 3،5،16،19-20،28. وهكذا، وتقييم الساعات الساعة البيولوجية في المختبر في إإكسبلنتس أو الخلايا الأولية متزامنة، وذلك باستخدام صحفيين إضاءة الحيوية، يمثل طريقة مفيدة للغاية لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتأثيرها على وظيفة الجهاز.

في هذه المقالة، وسوف نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتقييم التعبير الجيني الساعة البيولوجية في جزيرة الابتدائية والعضلات والهيكل العظمي خلايا الإنسان متزامنة في المختبر، وكذلك تأثير على مدار الساعة الخلوية مستقلةاضطراب في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على التلاعب الواردة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة جنيف والتي الأخلاقي جنة SUD EST الرابع (اتفاق 12/111) 19. تم عزل الجزر الإنسان من البنكرياس من الجهات المانحة الأعضاء المتعددة بالسكتة الدماغية في مركز جزيرة زرع في مستشفى جامعة جنيف (سويسرا) كما وصفها لنا في المراجع 16،18، أو تم الحصول عليها من مصدر تجاري.

1. إعداد الثقافة الخلية الأولية

  1. الإنسان البنكرياس جزيرة العزلة، التفكك والثقافة
    ملاحظة: معطف كل أنبوب، غيض من البلاستيك أو ماصة مع كونوت الطبية مختبرات (CMRL) المتوسطة من أجل منع الجزر أو الخلايا خلايا البنكرياس من الالتصاق على سطح البلاستيك، والتي يمكن أن تؤدي إلى خسارة كبيرة من مادة الخلية.
    1. قبل يوم واحد إلى جزيرة تفكك خلية إضافة 1 مل من المصفوفة خارج الخلية laminin-5-الغني (المستمدة من 804G الخلايا كما descriالسرير في اشارة 29) في 3.5 سم الطبق. قبل خلايا الطلاء، ونضح المصفوفة وغسل الطبق 3 مرات مع الماء المعقم ثنائية المقطرة. السماح للطبق لتجف تحت مجلس الوزراء تدفق الصفحي لمدة 5 دقائق.
    2. داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي، توزيع الجزر التي تم الحصول عليها مع CMRL المتوسطة إلى 15 مل أنبوب (ق). أجهزة الطرد المركزي في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. نضح طاف، ثم resuspend الكرية في 1 مل من المياه المالحة الفوسفات العقيمة Dulbecco و(DPBS) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية دون الكالسيوم والمغنيسيوم. أجهزة الطرد المركزي في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل من DPBS.
    5. لحساب عدد من الجزر الصغيرة، الماصة 10 ميكرولتر من تعليق جزيرة 1 مل في طبق جديد 3.5 سم. حساب عدد من الجزر في انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر تحت المجهر وهذا من حساب عدد من الجزر في تعليق الجزيرة 1 مل. إضافة 14 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة أكثرمرة في 272 x ج لمدة 5 دقائق.
    6. لجزيرة تفارق الخلية، ونضح طاف وإضافة 1 مل من محلول خلية مفرزة لمدة أقصاها 1000 في حكمه خلايا البنكرياس (IEQ). وضع أنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية وتخلط بلطف الجزر من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات كل دقيقة، خلال 6-10 دقيقة.
      ملاحظة: للتحقق من جودة عملية الهضم، الماصة بانخفاض بنسبة 2 ميكرولتر من تعليق على شريحة زجاجية والاختيار تحت المجهر أن جميع الخلايا يتم فصل جيدا، وأنه لا الحلل أو كتل الخلايا بقيت.
    7. وقف رد الفعل من خلال إضافة 14 مل من CMRL البرد مع المكملات الغذائية (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ من L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ البنسلين ستربتومايسين (P / S)، 1٪ الجنتاميسين، 1 ٪ البيروفات الصوديوم). أجهزة الطرد المركزي في 425 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف وإضافة 15 مل من CMRL المتوسط ​​وبيليه الخلية.
    8. resuspend الكرية في حجم صغير من CMRL مع المكملات الغذائية. حساب عدد الخلايا تحت المجهر باستخدام hemocytoمتر، وضبط حجم CMRL من أجل الحصول على تركيز خلية من ~ 650، 000 خلية / مل.
    9. الماصة 3 فصل قطرات من 100 ميكرولتر من كل من تعليق خلية موزعة حصلت عليه في الخطوة 1.1.8 في صحن 3.5 سم قبل المغلفة مع laminin.
      ملاحظة: خلايا نعلق على طبق في حوالي 24 ساعة.
    10. احتضان الخلايا (الشكل 1A) في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. تغيير المتوسطة من الخلية يسقط كل 2-3 أيام من قبل الشفط 100 ميكرولتر من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من متوسطة جديدة.
  2. بالخلايا العضلية الجذعية الثقافة الابتدائية الإنسان والتمايز في Myotubes
    1. خزعة الأنسجة، والعزلة خلية الفضائية والثقافة بالخلايا العضلية الجذعية
      ملاحظة: تم الحصول على خزعات العضلات من مجموعة اتيان Lefai (INSERM، ليون، فرنسا) 19.
      1. تنقية myoblasts الهيكل العظمي الأولية وفقا للإجراءات المنصوص عليها في السابق 30.
    2. التفريق صmyoblasts الإنسان rimary إلى myotubes
      1. خذ قارورة واحدة (1 × 10 6 خلايا) من myoblasts الإنسان تخزينها في النيتروجين السائل وذوبان الجليد الخلايا بسرعة عن طريق وضع القارورة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع الإثارة.
      2. الخلايا الماصة (1 مل) في 24 مل من متوسط ​​النمو يتكون من لحم الخنزير F-10 تستكمل مع FBS 20٪، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.
      3. الطرد المركزي 5 دقائق في 150 × ز.
      4. إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 15 مل من متوسط النمو العذبة في 2.5 × 10 5 خلايا.
      5. لوحة ما لا يقل عن 2.5 × 10 5 خلايا لكل F75 قارورة ملتصقة. الحفاظ على myoblasts في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      6. مرة واحدة الخلايا تصل إلى 60-80٪ confluency، فصل الخلايا مع التربسين-EDTA 0.05٪ لمدة 1-2 دقيقة ولوحة منها في 2 مل من متوسط ​​النمو على 3.5 أطباق ملتصقة سم بتري.
      7. بعد الوصول إلى نقطة التقاء، وإزالة المتوسطة النمو.
      8. بدء بروتو التمايزعمود من myoblasts الإنسان في myotubes بواسطة زرع لهم في 2 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 1 غرام / لتر من الجلوكوز، 2٪ FBS، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين ب (التمايز المتوسطة) في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
        عادة ما تتشكل Myotubes في غضون 7-10 أيام: ملاحظة.
      9. تحقق العضلات تمايز الخلايا تحت المجهر (الشكل 2A) من خلال مراقبة انصهار myoblasts إلى myotubes متعدد النوى 19.

2. صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) ترنسفكأيشن

  1. سيرنا ترنسفكأيشن من خلايا جزيرة الإنسان
    ملاحظة: يتم تنفيذ بروتوكول ترنسفكأيشن في قطرات من 100 ميكرولتر في اليوم التالي بعد تفكك خلية (الخطوات 1.1.1-1.1.10).
    1. نضح 100 ميكرولتر من المتوسطة CMRL من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من المصل خالية الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) 2 ساعةقبل ترنسفكأيشن من قبل pipetting.
    2. إعداد مزيج القائم على MEM من كاشف ترنسفكأيشن و 50 نانومتر الهدف سيرنا (siClock) أو 50 نانومتر من غير تستهدف siControl وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. للطبق واحد مع 3 قطرات إعداد اثنين من 1.5 مل الأنابيب مع 200 ميكرولتر من MEM لكل منهما.
      2. إضافة إلى واحدة من هذه الأنابيب 4 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن.
      3. إضافة إلى ثاني أنبوب 1 ميكرولتر من محلول الأسهم سيرنا المناسب (20 ميكرومتر).
      4. تستنهض الهمم هذه الأنابيب اثنين ببطء على شاكر المداري لمدة 5 دقائق ثم خلط محتويات الأنابيب معا وتستنهض الهمم لمدة 20 دقيقة أكثر.
    3. نضح 100 ميكرولتر من MEM من كل قطرة واستبدالها مع نفس الحجم من مزيج ترنسفكأيشن التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة قبل pipetting.
    4. استبدال الحل ترنسفكأيشن مع CMRL المتوسطة بعد 4 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية. كرر الخطوات 2.1.1-2.1.3 في اليوم التالي لخلية إعادة ترنسفكأيشن.
  2. سيرنا ترنسفكأيشن من Myotubes الإنسان
    1. قبل ترنسفكأيشن، استبدال المتوسطة (راجع الخطوة 1.2.2.8) مع 2 مل من المتوسط ​​التمايز جديدة في 3.5 سم طبق بتري.
    2. في أنبوب 1.5 مل العقيمة، وإعداد خليط من 20 نانومتر سيرنا (siControl أو siClock)، وهو ما يعادل 2.4 ميكرولتر من حل 20 ميكرومتر سيرنا، و 12 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مخففة في 100 ميكرولتر من متوسطة التمايز. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف.
    3. خلايا Transfect مع 114.4 ميكرولتر من مزيج سيرنا في 3.5 سم طبق بتري ومكان الخلايا في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.

3. على المدى الطويل المستمر الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل يقوم بالتوازي مع تقييم إفراز هرمون في الخلايا الحية الابتدائية الإنسان

  1. إدخال مراسلون ضوء بارد الساعة البيولوجية في خلايا الإنسان الأساسية التيLentiviral تنبيغ
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات مع الجسيمات lentiviral في مجال السلامة الأحيائية منشأة مستوى 2 إلى اتخاذ احتياطات إضافية للعمل مع العوامل التي تشكل خطرا محتملا المعتدل للعاملين والبيئة.
    1. تحضير جسيمات مراسل lentiviral التي شاركت في transfecting متجه pLenti6.4 الفائدة / R4R2 / V5-DEST / Bmal1 لوك أو البلازميد 31 مع ناقلات lentiviral pMD2G pLV156-Per2-dLuc (وتسمى Bmal1 لوك وPer2 لوك، على التوالي،) وpsPAX إلى خلايا 293T باستخدام طريقة polyethylenimine (لإجراءات تفصيلية أنظر المرجع 16).
    2. عاير الجسيمات lentiviral التي تم الحصول عليها (يمكن الحصول على تفاصيل عن المعايرة في http://lentilab.unige.ch/). لمزيد من التجارب، استخدم lentiviruses مع التتر تتراوح 10 أبريل - 10 مايو حدات transducing [TU / ميكرولتر].
    3. أطباق مكان مع الخلايا جزيرة الإنسان أو myoblasts الإنسان (في 30-50٪ confluency) داخل المقصورة تدفق الصفحيوآخرون واستبدال المتوسطة مع 2 مل من المتوسط ​​CMRL تستكمل جديدة (راجع الخطوة 1.1.7) أو متوسطة النمو (راجع الخطوة 1.2.2.2)، على التوالي.
    4. حساب وافر من العدوى (وزارة الداخلية) (أي الجسيمات المعدية (وحدات transducing) / عدد الخلايا).
    5. تنبيغ ثقافة الخلية الأولية من قبل pipetting حل الفيروسة البطيئة على طبق من أجل الحصول على وزارة الداخلية = 3 (على سبيل المثال، ل65،000 خلايا تعلق إضافة 3 ميكرولتر من الحل فيروس مع عيار 6.5 × 10 4-100 انخفاض متوسط ميكرولتر).
    6. احتضان بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة. تغيير المتوسطة في اليوم التالي.
      ملاحظة: تنبيغ الخلايا جزيرة الإنسان قبل 4 أيام على الأقل لتسجيل تلألؤ بيولوجي من أجل تحقيق يكفي للتعبير عن التركيبة المراسل. وtransduced Myoblasts خلال مرحلة التوسع، ثم نمت لالتقاء، والتفريق في وقت لاحق إلى myotubes.
  2. في المختبر التزامن الخلايا الأولية البشرية
      <لى> إضافة 10 ميكرومتر من أدينيليل محلقة المنشط في 2 مل من المتوسط ​​في 3.5 سم طبق بتري تحتوي على الخلايا الأولية transduced سابقا في الخطوة 3.1.5.
    1. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
    2. تغيير المتوسط ​​تحتوي على أدينيليل محلقة المنشط مع 2.5 مل من تسجيل المتوسط ​​تحتوي على 100 ميكرومتر وسيفيرين.
      ملاحظة: للحصول على استخدام الخلايا جزيرة الإنسان CMRL تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، 1٪ الجنتاميسين. لmyotubes البشري استخدام الفينول الأحمر - DMEM الحرة مع 1 جم / لتر الجلوكوز تستكمل مع 2٪ FBS، 2٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.

4. تقييم بالتوازي مع الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل وهرمون إفراز شخصيات في خلايا المتزامنة الإنسان إفرازية الابتدائية

  1. إعداد طويل الأجل Perifusion المستمر وضوء بارد تسجيل لخلايا الإنسان الأساسية.
    ملاحظة: عموميات عند العملبيئة تطوير متكاملة مجلس الوزراء تدفق الصفحي، نظيفة كل الأسطح الملامسة والحد من التعرض للثقافات أو متوسطة في الهواء لتجنب التلوث.
    1. لإعداد المتوسطة perifusion، إضافة 100 ميكرومتر من وسيفيرين إلى المتوسط.
      ملاحظة: للحصول على استخدام الخلايا جزيرة الإنسان CMRL تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، 1٪ الجنتاميسين. لmyotubes البشري استخدام الفينول الأحمر - DMEM الحرة مع 1 جم / لتر الجلوكوز تستكمل مع 2٪ FBS، 2٪ L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد، 1٪ P / S، و 0.5٪ الجنتاميسين و 0.2٪ أمفوتيريسين B.
    2. داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي، افتح 3.5 سم الأطباق التي تحتوي على transduced، transfected ومتزامنة الثقافات الخلية الأولية (خلايا خلايا البنكرياس أو myotubes) كما هو موضح أعلاه. إدراج قبعات معدنية معقمة (وضعت في المنزل) (الشكل 1B2) في سم أطباق 3.5 والتي تكون مجهزة مع سيليكون تدفق / هروب رأس المال الذي يربط أنابيب (الشكل 1B1 / B5).
    3. وضع الأطباق على منصة القياس في 37 درجة مئوية لآيت محكم الحاضنة. إصلاح الأطباق إلى منصة باستخدام محول screwable (الشكل 1B3). إدراج أنابيب تدفق / هروب رأس المال من نظام perifusion في أنابيب السيليكون المناسبة من الغطاء (الشكل 1B1 / B5) وضبط سرعة المضخة بمعدل تدفق ~ 0.5 مل من المتوسط في 1 ساعة.
    4. فتح البرنامج بالتنقيط biolumicorder في المنزل المتقدمة التي تسجل الإشارات من (PMT) كاشف أنبوب مضخم. اختار الدليل حيث سيتم تخزين البيانات والبدء تلألؤ بيولوجي المستمر تسجيل من كل طبق عن طريق النقر على أيقونة "البدء".
      ملاحظة: بدلا من ذلك إلى البرنامج بالتنقيط biolumicorder، برامج أخرى (على سبيل المثال LumiCycle)، ويمكن استخدامها لتسجيل إشارات من PMT كاشف.
    5. وضع معقمة لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا في خانة جمع على الجليد.
    6. فتح برنامج حاسوبي لمراقبة يتحكم في توقيت التبديل الآلي بين آبار الجمع. إعداد الوقت ثindow من جمع المتوسط ​​(ثانية). بدء تحصيل المتوسطة تدفق كل 4 ساعات (14،400 ثانية؛ ~ 2 مل لكل الوقت نقطة) من خلال النقر على "تشغيل" رمز.
    7. نقل وقياس متوسط ​​تدفق من كل مجموعة جيدة في العقيمة 2 مل أنابيب من قبل pipetting. إبقاء الأنابيب في الثلاجة -20 درجة مئوية قبل البدء في الخطوة التالية. كرر الخطوات 4.1.5-4.1.6 كل 24 ساعة.
    8. وقف تسجيل تلألؤ بيولوجي والتدفق المتوسط ​​عن طريق النقر على أيقونة "وقف" على البرنامج المقابلة. تنزع الأغطية المعدنية ونضح المتوسطة المتبقية من الأطباق.
    9. من أجل تطبيع قيم البروتين يفرز التي تم الحصول عليها في تجارب مختلفة، إما استخراج الحمض النووي (التطبيع التي كتبها محتوى الحمض النووي الجيني لmyotubes 19)، أو إضافة 1 مل من العازلة تحلل حمض الإيثانول (التطبيع التي كتبها المحتوى الكلي للهرمون لخلايا جزيرة 18) ل أطباق.

5. قياس مستويات هرمون جزيرة وMyokine في التدفقحصل المتوسطة التي كتبها Perifusion المستمر للخلايا الغدد الصماء الابتدائية الإنسان

  1. الأنسولين
    1. تحديد مستويات الانسولين القاعدية في المتوسط ​​تدفق من الوقت نقاط جمعها باستخدام الأنسولين المناعي فحص (ELISA) مجموعة انزيم مرتبط الإنسان باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. تطبيع البيانات إلى الحجم المطلق للالمتوسطة التي تم جمعها في كل بئر والمحتوى الكلي للأنسولين، المستخرجة من الخلايا المعالجة حمض الإيثانول في نهاية التجربة (الخطوة 4.1.9) 18.
  2. انترلوكين 6 (IL-6)
    1. تحديد القاعدية IL-6 مستويات في المتوسط ​​تدفق من الوقت نقاط جمعها باستخدام IL-6 ELISA عدة الإنسان باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. تطبيع البيانات إلى الحجم المطلق للالمتوسطة التي تم جمعها في كل بئر ومحتوى الحمض النووي الجيني في نهاية التجربة (الخطوة 4.1.9).

6. تحليلات الإدراجات الساعة البيولوجية للBioluminescence وهرمون إفراز الملامح

  1. تحليل تلألؤ بيولوجي
    1. تحليل الشخصية تلألؤ بيولوجي باستخدام البرامج المقدمة (19).
  2. تحليل JTK دورة
    1. تحليل هرمون الشخصية إفراز وتسجيل نتائج تلألؤ بيولوجي باستخدام خوارزمية JTK_CYCLE 32.
    2. تعيين عرض فترة الإيقاعية في 20-24 ساعة.
      ملاحظة: في حالة تم تسجيلها الظروف التجريبية في موازاة ذلك، تحليل إحصائي تقرن يمكن إجراء مقارنة التجارب.
  3. تحليل CosinorJ
    1. بدلا من ذلك، تحليل إفراز هرمون وملامح تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية باستخدام برنامج CosinorJ 28.

النتائج

تقييم جزيرة هرمون إفراز بالتوازي مع الساعة البيولوجية تلألؤ بيولوجي تسجيل من خلايا Perifused جزيرة الإنسان

بعد تقديم التوصيف الجزيئي الأول من الساعة اليومية، ناشط في الخلايا جزيرة الإنسان 16،

Discussion

وتتكون الإعدادات التجريبية الموصوفة هنا التسليم lentiviral من الصحفيين تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة، تليها مزامنة لاحقة في المختبر والتسجيل المتواصل من تلألؤ بيولوجي لعدة أيام، وتحليل مواز من إفراز هرمون من قبل نفس الخلايا...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لزملائنا من جامعة جنيف: جاك فيليب لتعليقات بناءة على هذا العمل، Ueli Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع تطوير نظام perifusion وللإلهام العلمي، أندريه Liani لديها تصور التصميم والتصنيع والتكليف نظام الارواء، لسة-التكنولوجيا المحدودة شركة للمساعدة في نظام perifusion وتطوير البرمجيات بالتنقيط biolumicorder، جورج Severi للحصول على المساعدة مع التجارب perifusion، أورسولا Loizides-مانغولد لقراءة نقدية للمخطوطة، وآن ماري مخلوف للتحضير الفيروسة البطيئة . لاتيان Lefai، ستيفاني Chanon وهوبير فيدال (INSERM، ليون) لإعداد myoblasts الأولية الإنسان؛ ودومينيكو بوسكو والفرنسي تييري Berney (مركز زرع جزيرة الإنسان، مستشفى جامعة جنيف) لتوفير الجزر الإنسان. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل رقم الوطني السويسري منحة مؤسسة العلوم 31003A_146475 / 1، وسيnergia العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة منحة رقم CRSII3-154405، مؤسسة الروماندية صب لا بحوث سور Diabète، مؤسسة بو Hjelt، مؤسسة إرنست وآخرون لوسي شميدهيني، وسوسيتيه Académique دو جنيف (CD).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesiumInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021For myoblasts culture
FBSInvitrogen10270Supplement to culture medium
Penicillin-StreptomycinSigmaP0781-100Supplement to culture medium
GentamycinAxon A1492.0001Supplement to culture medium
FungizoneInvitrogen15290-026Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax Invitrogen21885-025For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamaxInvitrogen11880-028Recording medium for LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRLGibco21530-027Culture medium for islet cells
Sodium PyruvateGibco11360-039Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical TubeFalcon352096
F75 flaskBD Falcon353136
3.5 cm Petri dish BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
LuciferinProlume LTD260150Supplement to recording medium
OptiMEM Invitrogen51985-026Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagentInvitrogen13778-150Transfection reagent
HiPerFect reagentQiagen301705Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69504For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104For myotubes RNA extraction
QIAshredder Qiagen79654For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubesAxygen311-10-051To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 WellBD Falcon 353046To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit Qiagen74034For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit eBioscience88-7066-22
Human Insulin Kit MercodiaMercodia10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a.Acros organics124630010Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%)Fluka Analytical02860-1LUsed for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for ResearchProdo Laboratories
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment:
CentrifugeHeraeusMegafuge 1.0R
Water bathVWR1112A at 37 °C
Tissu culture hoodFaster SafeFastElite
Tissu culture incubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubatorThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 at 37 °C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010For agitation of the siRNA mix
LumiCycleActimetrics
LumiCycle softwareActimetrics
CosinorJ softwareEPFLFreely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHControl software that controls the timing of the automated switch

References

  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117 myotubes lentiviral perifusion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved