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Resumen

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Resumen

Los relojes circadianos son funcionales en todos los organismos sensibles a la luz, lo que permite una adaptación al mundo exterior mediante la previsión de los cambios ambientales diarios. considerables progresos en la comprensión de la estrecha conexión entre el reloj circadiano y la mayoría de los aspectos de la fisiología se ha hecho en el campo durante la última década. Sin embargo, desentrañar la base molecular que subyace a la función del oscilador circadiano en los seres humanos se mantiene más alta de desafío técnico. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de un enfoque experimental para el largo plazo (2-5 días) de grabación de bioluminiscencia y la recogida de medio de salida en células primarias humanas cultivadas. Para este propósito, hemos transducidas células primarias con un indicador de luciferasa lentiviral que está bajo control de un promotor del gen de reloj del núcleo, lo que permite la evaluación paralela de la secreción de la hormona y la bioluminiscencia circadiano. Además, se describen las condiciones para interrumpir el reloj circadiano en primary células humanas mediante la transfección de siRNA RELOJ de orientación. Nuestros resultados en la regulación circadiana de la secreción de insulina por los islotes pancreáticos humanos, y Myokine secreción de las células del músculo esquelético humanos, se presentan aquí para ilustrar la aplicación de esta metodología. Estos ajustes se pueden utilizar para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y analizar su impacto funcional en las células primarias en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.

Introducción

El sistema de sincronización circadiano (del latín "circa diem") se ha convertido en todos los organismos sensibles a la luz, como un mecanismo de adaptación a la rotación de la Tierra. En los mamíferos, está organizado de una manera jerárquica, que abarca el reloj central, que está situado en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo ventral, y periférica (o esclavo) osciladores que son operativos en diferentes órganos. Además, estas células osciladores autónomas autosostenidas son funcionales en casi todas las células del cuerpo 1. Fóticos señales representan una señal de sincronización dominante (Zeitgeber) de las neuronas del SCN, mientras que las señales neurales y humorales que emanan del SCN reajustar los relojes periféricos. Se incrementan los ritmos de descanso-actividad, que impulsan en ciclos de alimentación-ayuno a su vez, son otros sincronizadores para relojes periféricos 2. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, la composición molecular del reloj central se basa en la transcripción y translabucles de retroalimentación cionales, que se conservan entre los organismos. Esto comprende los activadores de la transcripción BMAL1 y el reloj, que en conjunto activan la transcripción de los genes negativos de reloj de núcleo PER y llorar. Los altos niveles de PER y proteínas Cry inhibirán su propia transcripción a través de la inhibición del complejo / RELOJ BMAL1. Un bucle auxiliar consta de los receptores nucleares REV-ERB y Rors, que también regulan la transcripción de BMAL1 y el reloj. Por otra parte, los acontecimientos posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación, sumoylation, acetilación, O-GlcNAcylation, la degradación y la entrada en el núcleo de las proteínas del reloj del núcleo representan una capa adicional reguladora importante en el establecimiento del ciclo de oscilación de 24 horas 3.

La acumulación de pruebas se deriva de estudios en modelos de roedores y pone de relieve el papel fundamental del sistema circadiano en la coordinación de las funciones metabólicas y endocrinas 4-5. Un número de large-escala de análisis del transcriptoma indican que la alimentación - ayuno ciclos juegan un papel central en la sincronización de osciladores periféricos 6-8. En un acuerdo con estos estudios, el análisis metabolomic y lipidomic en roedores y seres humanos han revelado que un gran número de metabolitos oscile en el tejido, plasma, saliva y de una manera circadiano 9-11. Es importante destacar que, la mayoría de las hormonas exhiben ritmos circadianos en 5,12-13 sangre. Por otra parte, los relojes circadianos de la correspondiente hormona que produce el tejido periférico podrían regular la secreción de la hormona localmente. Osciladores circadianos células autónomas se han descrito en roedores y células de los islotes pancreáticos humanos 14-16. Estos osciladores juegan un papel esencial en la regulación del transcriptoma de los islotes pancreáticos y la función 15,17-18. Por otra parte, la secreción Myokine por miotubos esqueléticos humanos se ha demostrado recientemente para exhibir un patrón circadiano, que está regulada por oscillato de células autónomasrs operativos en estas células 19.

Varios enfoques para el estudio de los ritmos circadianos en los seres humanos in vivo se han usado ampliamente. Por ejemplo, la melatonina plasma o los niveles de cortisol, así como temperatura de la superficie de la piel torácica (revisado en referencias 3,20) han sido estudiados para evaluar los relojes circadianos endógenos. Aunque estos métodos permiten el estudio de las oscilaciones circadianas sistémicos en vivo, que están lejos de proporcionar una evaluación fiable de los ritmos circadianos autónomos de funcionamiento libre en diferentes órganos y tejidos. Sin embargo, como la disección de la regulación sistémica sería una herramienta indispensable para la comprensión de los efectos específicos de los relojes moleculares intracelulares de la función de estas células. Por lo tanto, se ha realizado un esfuerzo considerable para desarrollar enfoques fiables para el estudio de los relojes humanos en cultivos celulares inmortalizadas o primarios sincronizados in vitro. Es importante destacar que se ha demostrado quecaracterísticas de reloj medidos en células de fibroblastos de piel cultivados primaria reflejan estrechamente las propiedades del reloj individuales de todo el organismo 21. El desarrollo de los reporteros fluorescentes y bioluminiscentes circadianos ha avanzado en gran medida este enfoque 22-27. Por otra parte, el estudio de los relojes de células primarias que se derivan de diferentes órganos periféricos permite la investigación de las propiedades moleculares de los relojes específicos de tejidos humanos 3,5,16,19-20,28. Por lo tanto, la evaluación de los relojes circadianos en in vitro de explantes o células primarias sincronizados, mediante el uso de los reporteros bioluminiscentes, representa un método muy útil para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y su impacto en la función del órgano.

En este artículo, presentaremos los protocolos detallados para la evaluación de la expresión de genes circadianos en las células de los islotes primaria y el músculo esquelético humano sincronizados in vitro, así como el impacto de reloj celular autónomala interrupción de la función secretora de estas células.

Protocolo

Declaración de la ética: Manipulaciones incluidas en este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Ginebra y por el Comité Ético SUD EST IV (Acuerdo 12/111) 19. Islotes humanos se aislaron a partir de páncreas de donantes múltiples órganos con muerte cerebral en el Centro de Trasplante de islotes en el Hospital Universitario de Ginebra (Suiza) como se ha descrito por nosotros en las referencias 16,18, u obtenida de una fuente comercial.

1. Preparación del cultivo de células primarias

  1. Aislamiento humanos islote pancreático, disociación y Cultura
    NOTA: Capa cada tubo, punta de plástico o una pipeta con Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medio con el fin de evitar islotes o células de los islotes se pegue a la superficie de plástico, que puede conducir a una pérdida significativa de material celular.
    1. Un día antes de la disociación celular de los islotes añadir 1 ml de matriz extracelular laminina-5-rica (derivado de las células 804G como descricama en la referencia 29) por 3,5 cm plato. Antes de placas células, aspirar la matriz y se lava el plato 3 veces con agua bi-destilada estéril. Dejar que la cápsula se seque bajo la cabina de flujo laminar durante 5 min.
    2. Dentro de la cabina de flujo laminar, distribuir los islotes obtenidos con medio CMRL en 15 tubo (s) ml. Centrifugar a 272 g durante 5 min.
    3. Aspirar el sobrenadante, y luego volver a suspender el sedimento en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) previamente calentada a 37 ° C sin calcio y magnesio. Centrifugar a 272 g durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de DPBS.
    5. Para contar el número total de islotes, de pipeta 10 l de la suspensión de islotes 1 ml en un nuevo plato 3,5 cm. Contar el número de islotes en la caída de 10 l bajo el microscopio y de esta calcular el número total de islotes en la suspensión de islotes 1 ml. Añadir 14 ml de DPBS y centrifugar la suspensión celular una mástiempo en 272 xg durante 5 min.
    6. Para la disociación de células de islote, aspirar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células durante un máximo de 1,000 equivalentes de islotes (IEQ). Se coloca el tubo en un baño de agua a 37 ° C y mezclar suavemente los islotes pipeteando arriba y abajo varias veces cada minuto, durante 6-10 minutos.
      NOTA: Para verificar la calidad de la digestión, pipetear una caída de 2 l de suspensión en un portaobjetos de vidrio y se les presentarán bajo el microscopio que todas las células están bien separadas, y que no hay dobletes o grupos de células se han mantenido.
    7. Detener la reacción mediante la adición de 14 ml de CMRL frío con suplementos (10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 1% de gentamicina, 1 piruvato de sodio%). Centrifugar a 425 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 15 ml de medio CMRL al sedimento celular.
    8. Resuspender el precipitado en un pequeño volumen de CMRL con suplementos. Contar el número de células en el microscopio utilizando una hemocytometro, ajustar el volumen CMRL con el fin de obtener una concentración de células de ~ 650, 000 células / ml.
    9. Pipetear 3 separa gotas de 100 l cada una de la suspensión celular dispersada obtenida en la etapa 1.1.8 en una placa de 3,5 cm pre-recubiertas con laminina.
      NOTA: Las células se adhieren al plato en aproximadamente 24 horas.
    10. Se incuban las células (Figura 1A) en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C en una cámara húmeda. Cambiar el medio de la célula gotas cada 2-3 días por aspiración de 100 l de cada gota y su sustitución por el mismo volumen de medio fresco.
  2. Primaria humana mioblastos cultura y diferenciación en miotubos
    1. biopsia de tejido, el aislamiento de células satélite y la cultura de mioblastos
      Nota: Las biopsias musculares se obtuvieron del grupo de Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Francia) 19.
      1. Purificar mioblastos esqueléticos primaria de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito 30.
    2. diferenciando pmioblastos en miotubos humanos rimary
      1. Tomar un vial (1 x 10 6 células) de mioblastos humanos almacenados en nitrógeno líquido y descongelar las células rápidamente poniendo el vial durante 30 segundos a 1 minuto en un baño de agua a 37 ° C con agitación.
      2. células de pipeta (1 ml) en 24 ml de medio de crecimiento compuestas de HAM F-10 suplementado con 20% FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B.
      3. Centrifugar 5 min a 150 x g.
      4. Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 15 ml de medio de crecimiento fresco por 2,5 x 10 5 células.
      5. Placa de al menos 2,5 x 10 5 células por matraz F75 adherente. Mantener los mioblastos en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2.
      6. Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, se disocian las células con tripsina-EDTA al 0,05% durante 1-2 minutos y la placa en 2 ml de medio de crecimiento sobre platos adherentes 3,5 cm de Petri.
      7. Después de alcanzar la confluencia, se elimina el medio de crecimiento.
      8. Iniciar el proto diferenciacióncol de mioblastos humanos en miotubos cultivando en 2 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 1 g / L de glucosa, 2% de FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B (medio de diferenciación) en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días.
        NOTA: Myotubes se forman generalmente dentro de 7-10 días.
      9. Consultar la diferenciación de células de músculo bajo el microscopio (figura 2A) mediante la observación de la fusión de mioblastos en miotubos polinucleadas 19.

2. pequeños ARN de interferencia (siRNA) Transfección

  1. siRNA transfección de células de islotes humanos
    NOTA: El protocolo de transfección se realiza en gotas de 100 l en el día siguiente, después de disociación de células (pasos 1.1.1-1.1.10).
    1. Aspirado de 100 l de medio CMRL de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de suero libre de medio esencial mínimo (MEM) 2 hantes de la transfección mediante pipeteo.
    2. Prepare una mezcla a base de MEM de reactivo de transfección y 50 nM de objetivo siRNA (Siclock) o 50 nM de no director siCONTROL de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      1. Por un plato con 3 gotas preparar dos tubos de 1,5 ml con 200 l de MEM cada uno.
      2. Añadir a uno de estos tubos de 4 l de reactivo de transfección.
      3. Añadir a la segunda tubo de 1 l de la solución de siRNA de la correspondiente (20 M).
      4. Agitar estos dos tubos lentamente en el agitador orbital durante 5 min y luego mezclar el contenido de los tubos juntos y agitar durante 20 min más.
    3. Aspirar 100 l de MEM de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de mezcla de transfección obtenida en el paso anterior con la pipeta.
    4. Vuelva a colocar la solución de transfección con medio CMRL después de 4 horas de incubación a 37 ° C. Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 al día siguiente para celular re-transfección.
  2. siRNA transfección de miotubos humanos
    1. Antes de la transfección, sustituir el medio (véase la etapa 1.2.2.8) con 2 ml de medio de diferenciación fresca por 3,5 cm plato petri.
    2. En un tubo estéril de 1,5 ml, preparar una mezcla de 20 nM siRNA (siCONTROL o Siclock), que corresponde a 2,4 l de una solución 20 mM siRNA, y 12 l de reactivo de transfección diluidos en 100 l de medio de diferenciación. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 15 min con agitación suave.
    3. Transfectar células con 114,4 l de la mezcla de siRNA por 3,5 cm células plato de petri y lugar en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C y CO 2 durante 24 horas al 5%.

3. continuo a largo plazo circadiano bioluminiscencia de grabación a cabo en paralelo con la Evaluación de la secreción de la hormona en las células vivas humanas primarias

  1. La introducción circadianos Los reporteros de bioluminiscencia en células humanas primarias porLa transducción lentiviral
    NOTA: Todos los procedimientos con partículas de lentivirus se deben realizar en una instalación de bioseguridad de nivel 2 para tomar precauciones adicionales para el trabajo con los agentes que representan un peligro potencial moderado para el personal y el medio ambiente.
    1. Preparar partículas reportero lentivirales por co-transfección del vector de pLenti6.4 interés / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc o pLV156-Per2-dLuc (llamado Bmal1-luc y Per2-luc, respectivamente,) plásmido 31 con vectores lentivirales pMD2G y pspax en células 293T utilizando el método de polietilenimina (para el procedimiento detallado véase la referencia 16).
    2. Valorar las partículas lentivirales obtenidos (detalles en la valoración se pueden obtener en http://lentilab.unige.ch/). Para otros experimentos, utilizar lentivirus con títulos que van 10 4 a 10 5 unidades de transducción [TU / l].
    3. Coloque los platos con células de islotes humanos o mioblastos humanos (en el 30-50% de confluencia) en el interior de la cabina de flujo laminaret y reemplazar el medio con 2 ml de medio CMRL suplementado fresco (ver paso 1.1.7) o medio de crecimiento (véase la etapa 1.2.2.2), respectivamente.
    4. Calcular la multiplicidad de infección (MOI) (es decir, partículas infecciosas (unidades de transducción) / número de células).
    5. Transducir el cultivo de células primarias pipeteando solución lentivirus para el plato con el fin de obtener una MOI = 3 (por ejemplo, para 65.000 células unidas añaden 3 l de la solución de virus con el título de 6,5 x 10 4-100 gota l de medio).
    6. Incubar toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambio de medio el día siguiente.
      NOTA: transducir células de los islotes humanos al menos 4 días antes de la grabación de bioluminiscencia con el fin de lograr la expresión suficiente de la construcción indicadora. Los mioblastos se transdujeron durante la fase de expansión, entonces crecer hasta confluencia, y posteriormente se diferenciaron en miotubos.
  2. In Vitro La sincronización de las células humanas primarias
    1. Añadir 10 M de ciclasa activador de ciclasa en 2 ml de medio por 3,5 cm plato de Petri que contiene las células primarias transducidas con anterioridad en el paso 3.1.5.
    2. Incubar durante 60 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.
    3. Cambiar el medio que contiene el activador de la adenilato ciclasa con 2,5 ml del medio de grabación que contiene 100 mM de luciferina.
      NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B.

4. Evaluación paralela de bioluminiscencia circadiano de grabación y Hormona perfiles en células sincronizadas humana secretora primarias

  1. Configuración de largo plazo perifusion constante y la bioluminiscencia de Grabación en células humanas primarias.
    NOTA: Cuando outs de trabajoide la campana de flujo laminar, limpiar todas las superficies de contacto y limitar la exposición de las culturas o medio para el aire para evitar la contaminación.
    1. Para preparar el medio de perfusión, añadir 100 mM de luciferina al medio.
      NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B.
    2. Dentro de la cabina de flujo laminar, abrir los 3,5 cm platos que contienen los cultivos transducidos, transfectadas y sincronizados primarios de células (células de los islotes o miotubos) como se ha descrito anteriormente. Insertar tapas metálicas estériles (desarrollados en casa) (Figura 1B2) en los platos de 3,5 cm que están equipadas con afluencia de silicona / tubos de flujo de salida de conexión (Figura 1B1 / B5).
    3. Colocar los recipientes en la plataforma de medición en el 37 ° C light estanca incubadora. Fijar los platos a la plataforma mediante el uso de un adaptador atornillable (Figura 1B3). Introducir los tubos de afluencia / flujo de salida del sistema de perifusion en los tubos de silicona apropiados de la tapa (Figura 1B1 / B5) y ajustar la velocidad de la bomba a una velocidad de flujo de ~ 0,5 ml de medio por 1 hr.
    4. Abra el software de goteo biolumicorder de desarrollo propio que registra las señales del detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Elegir el directorio donde se almacenarán y comienzan bioluminiscencia continua la grabación desde cada plato haciendo clic en el icono "Inicio" los datos.
      NOTA: Como alternativa al software Drip-biolumicorder, otros programas (por ejemplo LumiCycle), se pueden utilizar para grabar señales de detector PMT.
    5. Colocar las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos estériles en la colecta en hielo.
    6. Abra el software de control que controla la sincronización del interruptor automático entre los pocillos de recogida. Configurar el tiempo window de la recogida de medio (seg). Iniciar la recogida del medio de salida de cada 4 horas (14.400 segundos; ~ 2 ml por punto de tiempo) haciendo clic en el icono "run".
    7. Transferir y medir el medio de salida de cada colección bien en recipientes estériles de tubos de 2 ml con la pipeta. Mantenga tubos en un congelador a -20ºC antes de comenzar el siguiente paso. Repita los pasos 4.1.5-4.1.6 cada 24 horas.
    8. Detener la grabación bioluminiscencia y el flujo del medio haciendo clic en el icono de "stop" en el software correspondiente. Retire las tapas metálicas y aspirar el medio residual de los platos.
    9. Con el fin de normalizar los valores de proteínas secretadas obtenidos en diferentes experimentos, o bien extraer el ADN (normalización por el contenido de ADN genómico para miotubos 19), o añadir 1 ml de tampón de lisis ácido-etanol (normalización del contenido total de la hormona para las células de los islotes 18) a la platos.

5. Medición de los Niveles hormonales Islet y Myokine en el flujo de salidaSe obtiene por medio de perfusión continua de células humanas endocrino primario

  1. Insulina
    1. Cuantificar los niveles de insulina basales en el medio de salida de puntos de tiempo recogidos por el uso de un kit de insulina humana ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido total de insulina, extraído de células tratadas con ácido-etanol al final del experimento (etapa 4.1.9) 18.
  2. La interleucina-6 (IL-6)
    1. Cuantificar basales de IL-6 en el medio de salida desde los puntos temporales recogidos mediante el uso de un IL-6 humana kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido de ADN genómico en el final del experimento (etapa 4.1.9).

6. Los análisis del conjunto de datos circadianos para Bioluminescencia y Hormona Perfiles

  1. Análisis bioluminiscencia
    1. Analizar el perfil de bioluminiscencia utilizando el software suministrado 19.
  2. Análisis de ciclo JTK
    1. Analizar los perfiles de secreción de hormonas y registrar los resultados de bioluminiscencia utilizando el algoritmo JTK_CYCLE 32.
    2. Establecer el ancho período circadiano a 20-24 h.
      NOTA: En caso de que se registraron las condiciones experimentales en paralelo, un análisis estadístico de dos puede llevar a cabo para comparar los experimentos.
  3. Análisis CosinorJ
    1. Por otra parte, analizar la secreción de hormonas y perfiles circadianos bioluminiscencia utilizando el software de CosinorJ 28.

Resultados

La evaluación de los islotes con Hormona paralelo circadiano bioluminiscencia de grabación a partir de células de islotes humanos Perifused

Después de proporcionar una primera caracterización molecular del reloj circadiano, operativo en las células de los islotes humanos 16, que apunta a estudiar el impacto de la interrupción del reloj en función de los islotes y la transcripción 18. Hemos creado...

Discusión

Los parámetros experimentales descritos aquí se componen de entrega lentiviral de reporteros de bioluminiscencia circadianos en células humanas primarias cultivadas, seguido de la posterior sincronización in vitro y el registro continuo de la bioluminiscencia durante varios días, y el análisis paralelo de la secreción de hormona por las mismas células. Representan un enfoque eficaz para explorar los mecanismos moleculares y los aspectos funcionales de los relojes circadianos en células humanas primaria...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a nuestros colegas de la Universidad de Ginebra: Jacques Philippe de comentarios constructivos sobre este trabajo, Ueli Schibler por su inestimable ayuda con el desarrollo del sistema de perfusión y para la inspiración científica, André Liani para el haber concebido el diseño, fabricación y puesta en servicio de el sistema de perfusión, la compañía de Lesa-Technology LTD para la asistencia en el sistema de perfusión y desarrollo de software de goteo biolumicorder, George Severi para obtener ayuda con los experimentos de perfusión, Ursula Loizides-Mangold para la lectura crítica del manuscrito, y Anne-Marie Makhlouf para las preparaciones de lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon y Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para la preparación de mioblastos humanos primarios; y para Domenico Bosco y Thierry Berney (Centro de trasplante de islotes humanos, Hospital Universitario de Ginebra) para proporcionar islotes humanos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencia de Suiza No. Nacional de Grant 31003A_146475 / 1, el Sinergia Swiss National Science Foundation Grant N º CRSII3-154405, Fondation Romande para la Investigación sobre la Diabetes, en Fundación Bo Hjelt, Fundación Ernst y Lucie Schmidheiny, y Société Académique de Genève (CD).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesiumInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021For myoblasts culture
FBSInvitrogen10270Supplement to culture medium
Penicillin-StreptomycinSigmaP0781-100Supplement to culture medium
GentamycinAxon A1492.0001Supplement to culture medium
FungizoneInvitrogen15290-026Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax Invitrogen21885-025For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamaxInvitrogen11880-028Recording medium for LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRLGibco21530-027Culture medium for islet cells
Sodium PyruvateGibco11360-039Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical TubeFalcon352096
F75 flaskBD Falcon353136
3.5 cm Petri dish BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
LuciferinProlume LTD260150Supplement to recording medium
OptiMEM Invitrogen51985-026Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagentInvitrogen13778-150Transfection reagent
HiPerFect reagentQiagen301705Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69504For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104For myotubes RNA extraction
QIAshredder Qiagen79654For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubesAxygen311-10-051To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 WellBD Falcon 353046To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit Qiagen74034For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit eBioscience88-7066-22
Human Insulin Kit MercodiaMercodia10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a.Acros organics124630010Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%)Fluka Analytical02860-1LUsed for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for ResearchProdo Laboratories
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment:
CentrifugeHeraeusMegafuge 1.0R
Water bathVWR1112A at 37 °C
Tissu culture hoodFaster SafeFastElite
Tissu culture incubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubatorHeraeusHeraCell 1505% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubatorThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 at 37 °C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010For agitation of the siRNA mix
LumiCycleActimetrics
LumiCycle softwareActimetrics
CosinorJ softwareEPFLFreely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHControl software that controls the timing of the automated switch

Referencias

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