Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell'ormone in colture cellulari primarie umane

Riepilogo

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Abstract

orologi circadiani sono funzionali in tutti gli organismi sensibili alla luce, consentendo un adattamento al mondo esterno anticipando cambiamenti ambientali giornalieri. Notevoli progressi nella nostra comprensione della stretta connessione tra l'orologio circadiano e la maggior parte degli aspetti della fisiologia è stato fatto nel settore negli ultimi dieci anni. Tuttavia, dipanando la base molecolare che sottende la funzione dell'oscillatore circadiano nell'uomo rimane di massima sfida tecnica. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un approccio sperimentale a lungo termine (2-5 giorni) di registrazione bioluminescenza e la raccolta media deflusso in cellule primarie umane in coltura. A questo scopo, abbiamo trasdotte cellule primarie con un reporter luciferasi lentivirale che è sotto il controllo di un gene promotore core clock, che consente la valutazione parallela della secrezione ormonale e bioluminescenza circadiani. Inoltre, si descrivono le condizioni per interrompere l'orologio circadiano in prcellule umane imary di transfezione siRNA OROLOGIO targeting. I nostri risultati sulla regolazione circadiano della secrezione di insulina da isole pancreatiche umane, e Myokine la secrezione da parte delle cellule muscolari scheletriche umane, sono qui presentati per illustrare l'applicazione di questa metodologia. Queste impostazioni possono essere utilizzati per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e di analizzare il loro impatto funzionale su cellule primarie in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.

Introduzione

Il sistema di distribuzione circadiano (dal latino "Circa diem") è emerso in tutti gli organismi sensibili alla luce, come un meccanismo di adattamento alla rotazione della Terra. Nei mammiferi, è organizzato in modo gerarchico, che comprende l'orologio centrale, che si trova nel nucleo soprachiasmatico dell'ipotalamo ventrale e periferico (o slave) oscillatori che sono operativi in ​​diversi organi. Inoltre, queste cellule autonome oscillatori auto-sostenuta sono funzionali in quasi ogni cellula del corpo ^1. Segnali fotica rappresentano un segnale di sincronizzazione dominante (Zeitgeber) per i neuroni SCN, mentre segnali neurali e umorali provenienti dal SCN ripristinati gli orologi periferici. Inoltre i ritmi di attività-riposo, che guidano in cicli di alimentazione-digiuno di direzione, sono ulteriori sincronizzatori per orologi periferici ^2. Secondo la nostra conoscenza attuale, la composizione molecolare del core clock si riferiscono al trascrizionale e TRADUCEanelli di retroazione zionali, che sono conservati tra gli organismi. Questo comprende gli attivatori trascrizionali Bmal1 e orologio, che insieme attivare la trascrizione dei geni negativi core clock PER and Cry. Alti livelli di PER e proteine ​​CRY inibiscono la propria trascrizione attraverso l'inibizione del complesso / CLOCK BMAL1. Un circuito ausiliario è costituito dai recettori nucleari REV-erbs e specchi, che regolano anche la trascrizione di BMAL1 e CLOCK. Inoltre, gli eventi post-traduzionali tra fosforilazione, sumoylation, acetilazione, O-GlcNAcylation, il degrado e l'ingresso nucleare delle proteine core clock rappresentano un importante livello normativo aggiuntivo che istituisce la 24 ore ciclo di oscillazione ^3.

Prove accumulando deriva da studi in modelli di roditori e mette in evidenza il ruolo fondamentale del sistema circadiano nel coordinamento delle funzioni metaboliche ed endocrine ^4-5. Un certo numero di large-scala analisi del trascrittoma suggeriscono che l'alimentazione - cicli di digiuno svolgono un ruolo centrale nella sincronizzazione degli oscillatori periferici ^6-8. In un accordo con questi studi, analisi metabolomica e lipidomico nei roditori e nell'uomo hanno rivelato che un gran numero di metaboliti oscillare nei tessuti, plasma, e saliva in modo circadiano ^9-11. È importante sottolineare che la maggior parte degli ormoni mostrano ritmi circadiani in ^5,12-13 sangue. Inoltre, gli orologi circadiani del corrispondente ormone che produce tessuti periferici potrebbero regolare la secrezione dell'ormone a livello locale. Oscillatori circadiani cellule autonome sono stati descritti in roditori e pancreatiche umane isolotto cellule ^14-16. Questi oscillatori svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del trascrittoma di isole pancreatiche e la funzione ^15,17-18. Inoltre, Myokine secrezione da miotubi scheletrici umani è stato recentemente dimostrato di esibire un ritmo circadiano, che è regolata da oscillato cellula-autonomars operative in queste cellule ^19.

Diversi approcci per studiare ritmi circadiani nell'uomo in vivo sono stati ampiamente utilizzati. Per esempio, la melatonina plasma o livelli di cortisolo, così come la temperatura superficiale della pelle del torace (rivisto in riferimenti ^3,20) sono stati studiati per valutare gli orologi circadiani endogeni. Anche se questi metodi consentono lo studio delle oscillazioni circadiani sistemica in vivo, sono lungi dal fornire una valutazione affidabile dei ritmi circadiani autonome free-running in diversi organi e tessuti. Tuttavia, tale dissezione dalla regolazione sistemica sarebbe uno strumento indispensabile per comprendere l'effetto specifico di orologi molecolari intracellulari sulla funzione di queste cellule. Di conseguenza, un notevole sforzo è stato intrapreso per sviluppare approcci affidabili per lo studio orologi umane in cellule in coltura immortalizzate o primari sincronizzati in vitro. Importante, è stato dimostrato checaratteristiche di clock misurata in cellule primarie di fibroblasti cutanei riflettono da vicino le singole proprietà di clock di tutto l'organismo ^21. Lo sviluppo di giornalisti circadiani fluorescenti e bioluminescenti è notevolmente avanzato questo approccio ^22-27. Inoltre, studiando gli orologi cellulari primarie che sono derivati da diversi organi periferici consente per lo studio delle proprietà molecolari di orologi specifici tessuti umani ^{3,5,16,19-20,28.} Quindi, la valutazione di orologi circadiani in espianti primari sincronizzati in vitro o cellule, utilizzando reporter bioluminescenti, rappresenta un metodo molto utile per studiare la composizione molecolare di orologi periferici umani e il loro impatto sulla funzione degli organi.

In questo articolo, vi presenteremo protocolli dettagliati per valutare l'espressione genica circadiani nelle cellule delle isole primaria e muscolo scheletrico umano sincronizzati in vitro, così come l'impatto di orologio cellulare autonomainterruzione sulla funzione secretoria di queste cellule.

Protocollo

Dichiarazione etica: Manipolazioni incluse in questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico del Policlinico Universitario di Ginevra e dal Comitato Etico SUD EST IV (Accordo 12/111) ^19. Isole umane sono state isolate dal pancreas di morte cerebrale donatori multiorgano nel trapianto Centro Isolotto presso l'Ospedale Universitario di Ginevra (Svizzera), come descritto da noi in riferimenti ^16,18, o ottenuti da una fonte commerciale.

1. Preparazione di colture primarie

1. Delle isole pancreatiche umane isolamento, dissociazione e la cultura
   NOTA: Cappotto ogni tubo, punta di plastica o pipetta con Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) media al fine di prevenire o isolotti isolotto cellule di attaccarsi alla superficie di plastica, che può portare a una significativa perdita di materiale cellulare.
   1. Un giorno prima isolotto dissociazione delle cellule aggiungere 1 ml di matrice extracellulare ricca laminina-5-(derivato da 804G cellule come descriletto in riferimento ²⁹⁾ per 3,5 centimetri piatto. Prima di placcatura cellule, aspirare la matrice e lavare il piatto 3 volte con acqua bi-distillata sterile. Lasciare che il piatto ad asciugare sotto la cappa a flusso laminare per 5 min.
   2. All'interno della cappa a flusso laminare, distribuire le isolette ottenuti con medie CMRL in 15 ml di tubo (s). Centrifugare a 272 xg per 5 min.
   3. Aspirare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile di Dulbecco (DPBS) pre-riscaldato a 37 ° C senza calcio e magnesio. Centrifugare a 272 xg per 5 min.
   4. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di DPBS.
   5. Per contare il numero totale di isolotti, pipetta 10 ml di sospensione isolotto 1 ml in un nuovo piatto 3,5 centimetri. Contare il numero di isole nella goccia 10 microlitri al microscopio e da questa calcolare il numero totale di isolotti nella sospensione isolotto 1 ml. Aggiungere 14 ml di DPBS e centrifugare la sospensione cellulare un'altratempo a 272 xg per 5 min.
   6. Per la dissociazione delle cellule insulari, aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di soluzione il distacco delle cellule per un massimo di 1.000 equivalenti di isole (IEQ). Porre il tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C e mescolare delicatamente gli isolotti pipettando su e giù parecchie volte ogni minuto, durante 6-10 min.
      NOTA: Per controllare la qualità della digestione, pipettare una goccia 2 ml di sospensione su un vetrino e controllare sotto il microscopio che tutte le cellule sono ben separati, e che non doppiette o grumi di cellule sono rimaste.
   7. Arrestare la reazione aggiungendo 14 ml di freddo CMRL con i supplementi (10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% di penicillina-streptomicina (P / S), 1% di gentamicina, 1 % piruvato di sodio). Centrifugare a 425 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 15 ml di terreno CMRL al pellet.
   8. Risospendere il pellet in un piccolo volume di CMRL con supplementi. Contare il numero di cellule al microscopio utilizzando un hemocytometro, regolare il volume CMRL in modo da ottenere una concentrazione cellulare di ~ 650, 000 cellule / ml.
   9. Pipettare 3 separato gocce di 100 microlitri ciascuno dalla sospensione cellulare dispersa ottenuto nello stadio 1.1.8 in 3,5 centimetri piatto pre-rivestito con laminina.
      NOTA: Le cellule allegare al piatto in circa 24 ore.
   10. Incubare le cellule (Figura 1A) in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C in una camera umida. Cambiare il mezzo della cella scende ogni 2-3 giorni aspirando 100 microlitri da ogni goccia e sostituendolo con lo stesso volume di mezzo fresco.
2. Primari umani mioblasti, Cultura e differenziazione in miotubi
   1. Biopsia del tessuto, l'isolamento delle cellule satellite e cultura mioblasti
      Nota: Le biopsie muscolari sono stati ottenuti dal gruppo di Etienne Lefai (INSERM, Lione, Francia) ^19.
      1. Purificare mioblasti scheletrici primarie secondo la procedura descritta in precedenza ^30.
   2. differenziando pmioblasti umani rimary in miotubi
      1. Prendere una fiala (1 x 10 ⁶ cellule) di mioblasti umani conservati in azoto liquido e scongelamento cellule rapidamente ponendo la fiala per 30 sec per 1 min in un bagno d'acqua a 37 ° C con agitazione.
      2. cellule Pipettare (1 ml) in 24 ml di mezzo di crescita composti HAM F-10 supplementato con 20% FBS, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B.
      3. Centrifugare 5 min a 150 x g.
      4. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere con 15 ml di terreno di coltura fresco per 2,5 x 10 ⁵ cellule.
      5. Piastra di almeno 2,5 x 10 ⁵ cellule per F75 pallone aderente. Mantenere i mioblasti in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO _2.
      6. Una volta che le cellule raggiungono 60-80% di confluenza, dissociare cellule con tripsina-EDTA 0,05% per 1-2 min e piastra in 2 ml di mezzo di crescita su aderenti 3,5 cm piatti petri.
      7. Dopo aver raggiunto confluenza, rimuovere il mezzo di crescita.
      8. Avviare il proto differenziazionecolle di mioblasti umani in miotubi da loro coltura in 2 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 1 g / L di glucosio, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamicina e 0,2% amfotericina B (terreno di differenziamento) in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO _2. Cambiare la media ogni 2 o 3 giorni.
         NOTA: miotubi sono di solito formate entro 7-10 giorni.
      9. Controllare il differenziamento delle cellule muscolari al microscopio (Figura 2A) osservando la fusione dei mioblasti in miotubi polynucleated ^19.

2. small interfering RNA (siRNA) Transfection

1. siRNA Transfection di cellule insulari umana
   NOTA: Il protocollo di trasfezione viene eseguito in gocce di 100 ml il giorno successivo dopo la dissociazione delle cellule (passi 1.1.1-1.1.10).
   1. Aspirare 100 microlitri di terreno CMRL da ogni goccia e sostituirlo con lo stesso volume di privo di siero Minimal Essential Medium (MEM) 2 hrprima di trasfezione pipettando.
   2. Preparare un mix MEM a base di reagente di trasfezione e 50 Nm di destinazione siRNA (SICLOCK) o 50 nm di non-targeting siControl secondo le istruzioni del produttore.
      1. Per un piatto con 3 gocce preparare due provette da 1,5 ml con 200 ml di MEM ciascuno.
      2. Aggiungere a uno di questi tubi 4 microlitri di reagente di trasfezione.
      3. Aggiungere al secondo tubo 1 ml di soluzione di appropriata siRNA magazzino (20 micron).
      4. Agitare questi due tubi lentamente l'agitatore orbitale per 5 minuti e poi mescolare il contenuto dei tubi insieme e agitare per altri 20 min.
   3. Aspirare 100 ml di MEM da ogni goccia e sostituirlo con lo stesso volume di miscela di trasfezione ottenuto nel passaggio precedente pipettando.
   4. Sostituire la soluzione trasfezione con il mezzo CMRL dopo 4 ore di incubazione a 37 ° C. Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 il giorno seguente per cella ri-trasfezione.
2. siRNA Transfection di miotubi umani
   1. Prima di trasfezione, sostituire il supporto (vedi punto 1.2.2.8), con 2 ml di terreno differenziazione fresca per 3,5 cm piatto di Petri.
   2. In una provetta sterile da 1,5 ml, preparare una miscela di 20 nM siRNA (siControl o SICLOCK), che corrisponde a 2,4 ml di una soluzione 20 mM siRNA, e 12 ml di reagente di trasfezione diluiti in 100 ml di terreno di differenziamento. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti con agitazione.
   3. Cellule trasfezione con 114,4 ml di miscela siRNA per 3,5 cm di Petri cellule piatto e posto in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 24 ore.

3. continua a lungo termine circadiano bioluminescenza registrazione Eseguita in parallelo con la valutazione della secrezione dell'ormone nelle cellule viventi umane primarie

1. L'introduzione di circadiani Bioluminescenza Reporter in cellule primarie umane dilentivirali trasduzione
   NOTA: Tutte le procedure con le particelle lentivirali devono essere eseguite in un impianto di biosicurezza di livello 2 di prendere ulteriori precauzioni per il lavoro con gli agenti che rappresentano un potenziale pericolo moderata per il personale e per l'ambiente.
   1. Preparare particelle lentivirali giornalista dal co-trasfezione del vettore di interessi pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc o pLV156-Per2-dLuc (chiamato Bmal1-Luc e Per2-Luc, rispettivamente) plasmide ³¹ con vettori lentivirali pMD2G e psPAX in cellule 293T con il metodo polietilenimmina (per la procedura dettagliata vedi riferimento ^16).
   2. Titolare le particelle lentivirali ottenuti (i dettagli sulla titolazione sono disponibili presso http://lentilab.unige.ch/). Per ulteriori esperimenti, utilizzare lentivirus con titoli che vanno 10 ⁴ 10 ⁵ unità di trasduzione [TU / ml].
   3. Luogo piatti con cellule delle isole umane o mioblasti umani (al 30-50% di confluenza) all'interno della cabina a flusso laminareet e sostituire il supporto con 2 ml di mezzo fresco INTEGRAZIONI CMRL (vedi punto 1.1.7) o mezzo di crescita (vedi punto 1.2.2.2), rispettivamente.
   4. Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) (cioè particelle infettive (unità di trasduzione) / numero di cellule).
   5. Trasdurre la coltura cellulare primaria pipettando soluzione lentivirus al piatto in modo da ottenere un MOI = 3 (ad esempio, per 65.000 cellule attaccate aggiungono 3 ml di soluzione di virus con il titolo di 6,5 x 10 ⁴ a 100 l medie goccia).
   6. Incubare per una notte in un incubatore di coltura tissutale. Cambiare media il giorno successivo.
      NOTA: trasdurre cellule insulari umane almeno 4 giorni prima della registrazione bioluminescenza per conseguire sufficiente espressione del costrutto giornalista. Mioblasti sono trasdotti durante la fase di espansione, quindi cresciuto a confluenza, e successivamente differenziate in miotubi.
2. In Vitro sincronizzazione delle cellule primarie umane
   1. Aggiungi 10 micron di ciclasi attivatore in 2 ml di terreno per 3,5 cm piatto di Petri contenente le cellule primarie precedentemente trasdotte nella fase 3.1.5.
   2. Incubare per 60 min a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
   3. Modificare il mezzo contenente la ciclasi attivatore ciclasi con 2,5 ml del supporto di registrazione contenente 100 micron luciferina.
      NOTA: per cellule insulari umani usano CMRL supplementato con 10% FBS, 1% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 1% di gentamicina; per miotubi umani usano rosso fenolo - DMEM senza con 1 g / L di glucosio integrato con il 2% FBS, 2% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B.

4. Valutazione parallela di circadiano bioluminescenza Registrazione e secrezione dell'ormone profili in cellule sincronizzate umana secretoria primarie

1. Impostazione a lungo termine La perfusione costante e registrazione bioluminescenza per le cellule primarie umane.
   NOTA: Quando si lavora outide la cappa a flusso laminare, pulire tutte le superfici di contatto e limitare l'esposizione delle culture o mezzo per l'aria per evitare la contaminazione.
   1. Per preparare il mezzo perifusione, aggiungere 100 mM di luciferina al mezzo.
      NOTA: per cellule insulari umani usano CMRL supplementato con 10% FBS, 1% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 1% di gentamicina; per miotubi umani usano rosso fenolo - DMEM senza con 1 g / L di glucosio integrato con il 2% FBS, 2% L-alanil-L-glutammina dipeptide, 1% P / S, 0,5% e 0,2% gentamicina amfotericina B.
   2. All'interno della cappa a flusso laminare, aprire i 3,5 cm piatti contenenti le trasdotte, trasfettate e sincronizzati colture cellulari primarie (cellule delle isole o miotubi) come descritto sopra. Inserire tappi metallici sterili (sviluppati in casa) (Figura 1B2) nei piatti da 3,5 cm che sono dotate di afflusso silicone / tubi di efflusso di collegamento (Figura 1B1 / B5).
   3. Porre le capsule sulla piattaforma di misurazione nel 37 ° C light a tenuta incubatore. Fissare i piatti alla piattaforma utilizzando un adattatore a vite (Figura 1B3). Inserire i tubi afflusso / efflusso del sistema perifusione nei tubi silicone appropriate del tappo (Figura 1B1 / B5) e impostare la velocità della pompa ad una portata di ~ 0,5 ml di terreno per 1 ora.
   4. Aprire il software Drip-biolumicorder sviluppato in casa che registra i segnali dal rivelatore tubo fotomoltiplicatore (PMT). Ha scelto la directory in cui verranno memorizzati e iniziare a bioluminescenza continua la registrazione da ogni piatto facendo clic sull'icona "start" i dati.
      NOTA: in alternativa al software Drip-biolumicorder, altri programmi (ad esempio LumiCycle), può essere utilizzato per registrare i segnali di rivelatore PMT.
   5. Posizionare sterile 6 pozzetti piastre di coltura tissutale nella scatola di raccolta sul ghiaccio.
   6. Aprire il software di controllo che controlla la temporizzazione dell'interruttore automatico tra i pozzetti di raccolta. Impostare il tempo window di raccolta media (sec). Inizia la raccolta del mezzo deflusso ogni 4 ore (14.400 secondi; ~ 2 ml per time-point) facendo clic sull'icona "run".
   7. Trasferire e misurare la media deflusso per ogni collezione e in sterili 2 ml tubi pipettando. Mantenere provette in un -20 ° C freezer prima di iniziare la fase successiva. Ripetere i passaggi 4.1.5-4.1.6 ogni 24 ore.
   8. Interrompere la registrazione bioluminescenza e il flusso medio facendo clic sull'icona "stop" sul software corrispondente. Rimuovere i tappi metallici e aspirare il terreno residui dai piatti.
   9. Al fine di normalizzare i valori di proteina secreta ottenuti in esperimenti diversi, o estrarre il DNA (normalizzazione dal contenuto di DNA genomico per miotubi ^19), o aggiungere 1 ml di tampone di lisi acido-etanolo (normalizzazione dal contenuto totale ormonale per le cellule delle isole ¹⁸⁾ al piatti.

5. misurazione dei livelli ormonali e Islet Myokine nel deflussoMedia Ottenuto da La perfusione continua di cellule umane endocrini primaria

1. Insulina
   1. Quantificare i livelli di insulina basale nel medio deflusso di volta in punti raccolti utilizzando un kit umano insulino enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Normalizzare i dati per il volume assoluto del mezzo raccolte in ciascun pozzetto e al contenuto totale di insulina, estratto da cellule trattate con acido etanolo al termine dell'esperimento (fase 4.1.9) ^18.
2. L'interleuchina-6 (IL-6)
   1. Quantificare basale di IL-6 livelli nel medio deflusso di volta in punti raccolti utilizzando un IL-6 kit ELISA umano seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Normalizzare i dati per il volume assoluto del mezzo raccolte in ciascun pozzetto e contenuto di DNA genomico alla fine dell'esperimento (fase 4.1.9).

6. Le analisi dataset circadiani per Bioluminesscenza e secrezione dell'ormone profili

1. Analisi bioluminescenza
   1. Analizzare profilo bioluminescenza utilizzando il software in dotazione ^19.
2. Analisi JTK-ciclo
   1. Analizzare i profili secrezione dell'ormone e risultati di registrazione bioluminescenza utilizzando l'algoritmo JTK_CYCLE ^32.
   2. Impostare la larghezza periodo circadiano in 20-24 ore.
      NOTA: Nel caso in cui sono state registrate le condizioni sperimentali in parallelo, l'analisi statistica accoppiato può essere eseguita per confrontare gli esperimenti.
3. Analisi CosinorJ
   1. In alternativa, analizzare la secrezione ormonale e profili di bioluminescenza circadiani utilizzando il software CosinorJ ^28.

Risultati

La valutazione della secrezione dell'ormone Isolotto con Parallel circadiano bioluminescenza Registrazione da cellule Perifused Islet umana

Dopo aver fornito una prima caratterizzazione molecolare dell'orologio circadiano, operativa in cellule delle isole umane ^16, si propone di studiare l'impatto di orologio interruzione sulla funzione isolotto e la trascrizione ^18. Abbiamo istituito un effic...

Discussione

Le impostazioni sperimentali qui descritte sono composti di consegna lentivirale di reporter bioluminescenza circadiani in cellule primarie umane coltivate, seguita da successiva sincronizzazione in vitro e registrazione continua della bioluminescenza per diversi giorni, e analisi parallela della secrezione dell'ormone dalle stesse cellule. Essi rappresentano un approccio efficace per esplorare i meccanismi molecolari e gli aspetti funzionali di orologi circadiani nelle cellule primarie umane.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	For muscle biopsy digestion
DPBS no calcium no magnesium	Invitrogen	14190-094
HAM F-10	Invitrogen	41550-021	For myoblasts culture
FBS	Invitrogen	10270	Supplement to culture medium
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P0781-100	Supplement to culture medium
Gentamycin	Axon	A1492.0001	Supplement to culture medium
Fungizone	Invitrogen	15290-026	Amphotericin B, supplement to culture medium
DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax	Invitrogen	21885-025	For myotubes culture
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax	Invitrogen	11880-028	Recording medium for LumiCycle
Glutamax	Invitrogen	35050-028	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	Cell detachment solution, for islet cell dissociation
CMRL	Gibco	21530-027	Culture medium for islet cells
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-039	Supplement to culture medium
15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube	Falcon	352096
F75 flask	BD Falcon	353136
3.5 cm Petri dish	BD Falcon	353001
Foskolin	Sigma	F6886	Adenylyl cyclase activator, used for synchronization
Luciferin	Prolume LTD	260150	Supplement to recording medium
OptiMEM	Invitrogen	51985-026	Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection
Lipofectamine RNAiMAX reagent	Invitrogen	13778-150	Transfection reagent
HiPerFect reagent	Qiagen	301705	Transfection reagent
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool	Dharmacon	L-008212-00
ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl)	Dharmacon	D-001810-01
DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	For myotubes DNA extraction
RNeasy Plus Mini kit	Qiagen	74104	For myotubes RNA extraction
QIAshredder	Qiagen	79654	For myotubes RNA extraction
2 ml collecting tubes	Axygen	311-10-051	To collect the medium with the perifusion
Tissue culture Plate, 6 Well	BD Falcon	353046	To collect the medium with the perifusion
RNeasy Plus Micro kit	Qiagen	74034	For islet RNA extraction
Human IL-6 Instant ELISA kit	eBioscience	88-7066-22
Human Insulin Kit Mercodia	Mercodia	10-1113-01
Hydrochloric acid, min,37%,p.a.	Acros organics	124630010	Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Ethanol (>99.8%)	Fluka Analytical	02860-1L	Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O)
Human Islets for Research	Prodo Laboratories
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment:
Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R
Water bath	VWR	1112A	at 37 °C
Tissu culture hood	Faster	SafeFastElite
Tissu culture incubator	Heraeus	HeraCell 150	5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator	Heraeus	HeraCell 150	5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation
Tissu culture incubator	Thermo Scientific	Hera Cell 150i	5% CO2 at 37 °C
Shaker	Heidolph Instruments	Unimax 1010	For agitation of the siRNA mix
LumiCycle	Actimetrics
LumiCycle software	Actimetrics
CosinorJ software	EPFL		Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX	ERC GmbH		Control software that controls the timing of the automated switch