JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Abstract

مربع المجموعة عالية التنقل 1 (HMGB1) البروتين هو بروتين المعماري غير بسيطة التي تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الهامة في الجينوم، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي. يربط HMGB1 على الحمض النووي مشوهة هيكليا مع ارتفاع تقارب من لالكنسي B-DNA. على سبيل المثال، وجدنا أن HMGB1 يربط الحمض النووي interstrand crosslinks (ICLS)، التي تربط تساهمي فروع اثنين من الحمض النووي، وتسبب تشويه الحلزون، وإذا تركت دون اصلاح يمكن أن يسبب موت الخلايا. نظرا لقدرتها السامة للخلايا، وتستخدم العديد من وكلاء ICL الذي يحفز حاليا وكلاء العلاج الكيميائي في العيادة. بينما تظهر وكلاء ICL تشكيل تفضيلات لبعض متواليات قاعدة (على سبيل المثال، 5'-TA-3 "هو موقع يشابك المفضل لالسورالين)، فإنها تحفز إلى حد كبير التلف في الحمض النووي بطريقة عشوائية. ومع ذلك، من خلال اقتران تساهميا وكيل ICL الذي يحفز إلى النوكليوتيد تشكيل ثلاثي (TFO)، الذي يربط الحمض النووي في تسلسل محددالطريقة الحمض النووي من التلف المستهدفة يمكن أن يتحقق. هنا، ونحن نستخدم TFO مترافق تساهميا على 'نهاية ل4'-hydroxymethyl-4،5' 5 (همت) السورالين trimethylpsoralen-8، لتوليد ICL في مواقع محددة على البلازميد الطفرة مراسل لاستخدام أداة لدراسة تعديل المعماري ومعالجة وإصلاح آفات الحمض النووي المعقدة التي HMGB1 في الخلايا البشرية. وصفنا تقنيات تجريبية لإعداد ICLS موجهة TFO على البلازميدات مراسل، واستجواب جمعية HMGB1 مع ICLS موجهة TFO في سياق الخلوي باستخدام فحوصات مناعي لونين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف فحوصات الحمض النووي supercoiling لتقييم تعديل المعماري معين من الحمض النووي التالف عن طريق قياس كمية من الأدوار superhelical أدخلت على البلازميد-السورالين crosslinked بواسطة HMGB1. هذه التقنيات يمكن استخدامها لدراسة دور البروتينات الأخرى المشاركة في تجهيز وإصلاح ICLS موجهة TFO أو غيرها من الأضرار الحمض النووي المستهدفة في أي خط من الخلايا في المصالح.

Introduction

ثلاثي تشكيل أليغنوكليوتيد] (TFOs) مأزق مزدوج الحمض النووي بطريقة تسلسل معين عن طريق الربط Hoogsteen الهيدروجين لتشكيل هياكل الثلاثي حلزونية 1-5. وقد استخدمت تقنية ثلاثي لاستجواب مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية البيولوجية، مثل النسخ، وإصلاح الحمض النووي من التلف، واستهداف الجين (إعادة النظر في المراجع 6-8). وقد استخدمت على نطاق واسع TFOs للحث على الضرر في مواقع محددة على البلازميدات مراسل 9،10. مختبرنا وغيرها قد استخدمت سابقا TFO، AG30، مربوط الى جزيء السورالين للحث على crosslinks DNA interstrand في مواقع محددة (ICLS) في الجين supF على pSupFG1 البلازميد 5،10-12. ICLS هي السامة للخلايا للغاية حيث أن هذه الآفات تشعبي تساهميا اثنين من خيوط الحمض النووي، وإذا تركت دون اصلاح، يمكن منع النسخ الجيني وتعيق آلية تكرار الحمض النووي 13،14. بسبب قدرتها السامة للخلايا، وقد استخدمت وكلاء ICL الذي يحفز كما أدوية العلاج الكيميائي في علاجمن السرطان وأمراض أخرى 15. ومع ذلك، وتجهيز وإصلاح ICLS في الخلايا البشرية ليست مفهومة جيدا. وبالتالي، فهم أفضل من الآليات التي تشارك في تجهيز ICLS في الخلايا البشرية يمكن أن تساعد على تحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي على أساس ICL. ICLS يسببها TFO وسيطة إصلاح لهم لديها القدرة على التسبب في تشوهات هيكلية مهمة لولب الحمض النووي. هذه التشوهات هي أهداف محتملة للبروتينات المعمارية، الذي ربط الحمض النووي مشوهة مع تقارب أعلى من لالكنسي B-شكل مزدوج الحمض النووي 16-20. هنا، درسنا جمعية بروتين المعماري وفيرة للغاية، HMGB1 مع ICLS في الخلايا البشرية عبر مناعي لونين (رقاقة) فحوصات على البلازميدات-السورالين crosslinked والتعرف على دور HMGB1 في تحوير طوبولوجيا من البلازميد-السورالين crosslinked في الإنسان لست] الخلايا السرطانية.

HMGB1 هو وفيرة للغاية، وأعرب عن بتواجد مطلق غير لهلهجة البروتين المعماري الذي يربط الحمض النووي التالف وركائز الحمض النووي منظم بدلا من ذلك مع تقارب أعلى من الكنسي B-شكل الحمض النووي 17-20. وتشارك HMGB1 في العديد من عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي 16،21-23. لقد أثبتنا سابقا أن HMGB1 بربط ICLS موجهة TFO في المختبر مع قابلية عالية 20. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن عدم وجود HMGB1 زيادة تجهيز مطفرة من ICLS موجهة TFO وحددت HMGB1 بمثابة إصلاح النوكليوتيدات الختان (NER) المشارك عامل 23،24. مؤخرا، وجدنا أن HMGB1 يرتبط ICLS موجهة TFO في الخلايا البشرية والتوظيف لمثل هذه الآفات يعتمد على بروتين معدل الالتحاق الصافي، XPA 16. وقد تبين supercoiling السلبي من الحمض النووي للترويج لإزالة فعالة من آفات الحمض النووي التي كتبها NER 25، وقد وجدنا أن HMGB1 يدفع supercoiling سلبي تفضيلي على إخراج TFO اصق ICL التي تحتوي علىركائز منتصف (نسبة إلى ركائز غير التالفة البلازميدات) 16، توفير فهم أفضل للدور المحتمل (ق) من HMGB1 باعتبارها NER المشارك عامل. ليست مفهومة تجهيز ICLS تماما في الخلايا البشرية. وبالتالي، يمكن للتقنيات والمقايسات وضعت على أساس الأدوات الجزيئية الموصوفة هنا يؤدي إلى التعرف على البروتينات إضافية تشارك في إصلاح ICL، والتي بدورها قد تخدم أهدافا الدوائية التي يمكن استغلالها لتحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي للسرطان.

هنا، نهج فعال لتقييم كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO في البلازميد من تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام تم مناقشتها. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام البلازميدات التي تحتوي على ICLS موجهة TFO، تقنيات لتحديد جمعية HMGB1 مع البلازميدات التالفة ICL في سياق الخلوي باستخدام المقايسات رقاقة تعديل تم وصفها. بالإضافة إلى ذلك، وهي طريقة سطحي لدراسة التعديلات التي أدخلها الطوبوغرافية عشروقد تم تحديد ه البروتين المعماري HMGB1، وتحديدا على ركائز البلازميد التالفة ICL في الخلية لست] الإنسان عن طريق إجراء فحوصات supercoiling عبر ثنائية الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. وصف تقنيات يمكن استخدامها لتعزيز فهم إشراك إصلاح الحمض النووي والبروتينات المعمارية في معالجة التلف في الحمض النووي المستهدفة على البلازميدات في الخلايا البشرية.

وصفنا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتشكيل ICLS السورالين موجهة TFO-مواقع محددة على DNA البلازميد، ورقاقة البلازميد لاحق وsupercoiling فحوصات لتحديد البروتينات التي ترتبط بها مع الآفات، والبروتينات التي تغير طوبولوجيا الحمض النووي، على التوالي. يمكن تعديل هذه المقايسات لأداء مع غيرها من العوامل الحمض النووي المدمر، TFOs، ركائز البلازميد، وخطوط الخلايا الثديية من الفائدة. في الواقع، لقد أظهرنا أن هناك إمكانية فريدة وعالية تقارب موقع واحد على الأقل ملزم TFO داخل كل الجينات المشروح في الجينوم البشري (26). كيفمن أي وقت مضى، من أجل الوضوح، وصفنا هذه التقنيات لاستخدام TFO مترافق السورالين محددة (pAG30) على البلازميد الطفرة مراسل معين (pSupFG1) في خلايا U2OS الإنسان كما أننا قد تستخدم في موخرجي وفاسكيز، 2016 16.

Protocol

1. إعداد ICLS موجهة TFO على البلازميد ركائز

  1. احتضان كميات متساوي المولية من pSupFG1 البلازميد 10،11 الحمض النووي (5 ميكروغرام DNA البلازميد هو نقطة انطلاق جيدة) مع السورالين مترافق TFO AG30 في 8 ميكرولتر من ثلاثي العازلة ملزمة [50٪ الجلسرين، 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 10 ملي MgCl 2] وO 2 درهم إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر في أنبوب العنبر. مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 12 ساعة.
  2. الاحماء مصباح الأشعة فوق البنفسجية لضمان انتاج الطاقة الكاملة. ضع رد فعل ثلاثي على الفيلم البارافين، ووضع الفيلم البارافين على الجليد تحت (نانومتر 365) مصباح الأشعة فوق البنفسجية. وضع مرشح مايلر بين مصباح وردود الفعل.
  3. UVA أشرق لجرعة من مجموع 1.8 J / سم 2. تخزين العينات في 4 درجات مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
    الحذر: ارتداء النظارات الواقية المناسبة والملابس مع UVA التشعيع.
  4. خطي 200 نانوغرام من البلازميد أعد أعلاه مع إعادةانزيم striction ايكو R1 في إجمالي حجم 20 ميكرولتر باستخدام زودت الشركة المصنعة 10X العازلة. الحرارة تفسد الانزيم لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. تدور العينات لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  5. إعداد 50X عازلة القلوية [1.5 م هيدروكسيد الصوديوم، 50 ملي Ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA)]. إضافة 0.5 ملغ من الاغاروز إلى 50 مل درهم 2 O. يغلي لإذابة الاغاروز ووضعه في 50 ° C حمام الماء.
  6. بعد درجة حرارة الاغاروز حل وصولا الى 50 درجة مئوية، إضافة 1 مل من العازلة 50X قلوية، ومزجها ثم صب جل في علبة الجل. إتاحة الوقت لهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  7. إضافة 4 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي خطي واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة 6X القلوية عازلة هلام تحميل (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم، 6 ملي EDTA، 18٪ (ث / ت) ارتفاع الوزن الجزيئي السكاريد، 0.06٪ خضرة البروموكريزول في DH 2 O) للعينات و1 كيلو بايت سلم الحمض النووي.
    ملاحظة: من المهم استخدام العازلة هلام تحميل القلوية 6X، يرجى الاطلاع على المناقشة.
  9. نماذج تحميل على هلام في الغرفة الباردة وتشغيل بين عشية وضحاها في المخزن القلوية 1X (12-16 ساعة) عند 3.2 فولت لكل سم. مرة واحدة العينات دخلت هلام، وضع لوحة من الزجاج على الجزء العلوي من هلام لمنعها من العائمة.
  10. تحييد العينات عن طريق نقع هلام العازلة في تحييد [1 M تريس الكلورين (الرقم الهيدروجيني 7.6)، و 1.5 M كلوريد الصوديوم، 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)] لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. وصمة عار في هلام لالحمض النووي مع 4 ميكرولتر من 1٪ بروميد إيثيديوم (EtBr) في 50 مل من الماء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يزيل اللون مع الماء لمدة 15 دقيقة. تصور الحمض النووي باستخدام نظام التصوير.
    تحذير: EtBr هو المغير قوية ويمكن استيعابها من خلال الجلد. تجنب الاتصال المباشر مع EtBr.

2. ترنسفكأيشن ومناعي من إخراج TFO-ICL التي تحتوي على البلازميدات في الخلايا البشرية

  1. لوحة 400،000 خلايا الثدييات (على سبيل المثال، U2OS سخلايا steosarcoma) في 60 طبق مم في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) بدون المضادات الحيوية 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. قبل ترنسفكأيشن، وسائط النمو الدافئ والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. تدفئة كاشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان 30 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع 500 ميكرولتر من وسائط النمو 1X (مزيج 1) و 2 ميكروجرام من TFO الموجه ICL التي تحتوي على البلازميدات في 500 ميكرولتر من 1X وسائط النمو (مزيج 2) في منفصلة 14 مل أنابيب أسفل جولة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة مزيج 1 إلى مزيج 2، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان لمدة 25-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الدافئ. يضاف مزيج ترنسفكأيشن بطريقة الإفلات من الحكمة توزيع بالتساوي في جميع أنحاء لوحة من الخلايا. إضافة 1 مل من وسائط النمو إلى لوحة وجلب الحجم النهائي إلى 2 مل. خلط نحنليرة لبنانية. وضع لوحات الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة.
  6. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام 3 مل النمو تستكمل مع FBS 10٪، واحتضان مزيد لمدة 16 ساعة. لا تستخدم المضادات الحيوية.
  7. علاج الخلايا مع 80 ميكرولتر من الفورمالديهايد العذبة 37٪ لكل لوحة لتركيز النهائي من ما يقرب من 1٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غياب الضوء.
    تحذير: الفورمالديهايد السامة، وينبغي التعامل وفقا لتعليمات السلامة بها. تعرض الفورمالديهايد يمكن أن يسبب ضرر للجلد والعين والجهاز التنفسي.
  8. إخماد الفورمالديهايد يشابك بإضافة 300 ميكرولتر من الجلايسين المبردة (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا) في لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق. إزالة وسائل الإعلام ويغسل مرتين مع المثلجة PBS، ثم جمع الخلايا عن طريق كشط في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني في أنبوب microcentrifuge. الحفاظ على عينات على الجليد في جميع الأوقات.
  9. إعداد الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لر 13400 x ج باستخدام الطاولة المبردة الطرد المركزي. الماصة من طاف ووضع بيليه الخلية على الجليد.
  10. و resuspend متجانس بيليه في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) العازلة ألف (المتوفرة في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. مزيج من حين لآخر عن طريق أنبوب للقلب. بيليه الخلايا كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  11. و resuspend متجانس بيليه في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) B الاحتياطي (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان من قبل قلب. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  12. resuspend الخلايا مرة أخرى في 200 ميكرولتر برود العازلة B. إضافة 2 ميكرولتر من Micrococcal نوكلياز (MNase)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. خلط رد فعل من حين لآخر من قبل عبها الأنبوب. وقف رد فعل MNase عن طريق وضع أنبوب على الجليد وإضافة 40 ملي EDTA. بيليه الخلايا كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  13. Resuspend الخلايا في 100 immunopr لونين 1X ميكرولترecipitation عازلة (رقاقة) عازلة (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا) تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز.
  14. وضع الخلايا معلق في أنبوب microfuge رقيقة الجدران. يصوتن العينات من خلال تعويم لهم على sonicator باث الماء لمدة 20 ثانية تليها 20 ثانية حضانة على الجليد. كرر صوتنة الخطوات من 9 مرات لتوليد ~ 800-1،200 شظايا مضت.
    1. إلى 20 ميكرولتر من العينات sonicated إضافة 3 ميكرولتر 5 M كلوريد الصوديوم و 1 ميكرولتر ريبونوكلياز A. مزيج جيد من قبل vortexing واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وفي وقت لاحق، إضافة 2 ميكرولتر بروتين K واحتضان لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية. تنقية العينات باستخدام طقم تنقية PCR. تشغيل العينات على 1٪ هلام الاغاروز وتصور مع EtBr.
      ملاحظة: كثافة القصوى من الناتج الحمض النووي ينبغي أن تكون عند أو تحت 1000 سنة مضت.
  15. في ثلاثة أنابيب منفصلة، ​​إضافة 30 ميكرولتر من المحللة في أنبوب siliconized وقبل المبردة ثم إضافة 70 ميكرولتر من العازلة الشذرة 1X المبردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني المضافة. إضافة 1 μز المضادة للالمناعي G (مفتش)، H3 مكافحة هيستون (كما تحكم إيجابية)، أو أضداد HMGB1 للأنابيب منها. احتضان بين عشية وضحاها في غرفة باردة مع دوران مستمر.
  16. Resuspend الخرز بروتين G متجانس في غرفة باردة. إضافة 4 ميكرولتر من بروتين G حبات في أنبوب واحتضان لمدة 2-4 ساعة أخرى في غرفة باردة مع دوران.
  17. استخدام الحامل المغناطيسي، بيليه الخرز وإزالة طاف. إضافة 200 ميكرولتر 1X الشذرة العازلة مختلطة مع الكوكتيل مثبط البروتياز لبيليه ويغسل لمدة 5 دقائق في غرفة باردة مع دوران. تكرار غسل مرتين.
  18. أداء غسيل إضافي واحد مع الملح العالية العازلة 1X الشذرة (التي تحتوي على 70 ملي كلوريد الصوديوم).
  19. Resuspend والكريات مع شطف العازلة 160 ميكرولتر (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع دوران لمدة 30 دقيقة.
  20. بيليه الخرز وجمع طاف في أنبوب جديد. إضافة 6 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم و 2 ميكرولتر من بروتين كاف، واحتضان بين عشية وضحاها في 65° C.
  21. تنقية الحمض النووي باستخدام PCR عدة تنقية المنتجات وأزل الحمض النووي باستخدام 50 ميكرولتر درهم 2 O.
  22. أداء PCR 16 ردود الفعل باستخدام مجموعات التمهيدي إلى المنطقة (ق) من الفائدة، وحل المنتجات على هلام الاغاروز 1٪ ملطخة EtBr.

3. Supercoiling الفحص و2-الأبعاد الاغاروز جل الكهربائي

  1. تحضير الحمض النووي عازلة التوليف إصلاح (45 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.8 و 70 ملي بوكل، 7.4 ملي MgCl 2؛ 0.9 ملي DTT؛ 0.4 ملي EDTA، 2 ملم ATP و 20 ميكرومتر dNTPs، 3.4٪ الجلسرين و 18 ألبومين المصل ميكروغرام البقري) . تخزين في -80 درجة مئوية. ذوبان الجليد على الجليد، وقبل استخدام إضافة 40 فسفوكرياتين ملي و 2.5 ميكروغرام فسفوكيناز الكرياتين.
  2. إعداد العازلة 10X supercoiling [500 ملي تريس (8.0 درجة الحموضة)، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA]، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. خطي 300 نانوغرام من supercoiled البلازميد pSupFG1 الحمض النووي تماما باستخدام 1 ميكرولتر الوقس Topoisomerase الأول (5-15 U / ميكرولتر) مع 1Xعازلة supercoiling في رد فعل 10 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. ذوبان الجليد هيلا خالية من الخلايا استخراج 24 على الجليد. لالبلازميدات استرخاء تماما، إضافة 25 ميكرولتر هيلا خالية من الخلايا استخراج وعازلة إصلاح الحمض النووي التوليف. اخلط جيدا. إضافة 1 ميكرولتر إضافية من الوقس Topoisomerase الأول لهذا المزيج، واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
  5. إنهاء ردود الفعل بإضافة كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) (تركيز النهائي 1٪) وبروتين كاف (0.25 ملغ / مل تركيز النهائي). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. يلقي هلام الاغاروز 1٪ مع 1X تريس بورات EDTA عازلة (TBE). إضافة الحمض النووي صبغ التحميل وتحميل ردود فعل مباشرة على هلام لا يقل عن 4 حارات على حدة. تشغيل هلام لمدة 8-10 ساعة في 2 V / سم في 1X TBE (البعد 1) في درجة حرارة الغرفة لحل topoisomers.
    ملاحظة: إعداد محلول المخزون 5X TBE في 1 لتر من O 2 درهم من خلال إضافة 54 غرام من قاعدة تريس. 27.5 غرام من حمض البوريك و 20 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة).
  7. إعداد 2 لتر من 1XTBE مع 3 ميكروغرام / مل الكلوروكين فوسفات. نقع الهلام في 200 مل من هذا المحلول لمدة 20 دقيقة. تغطية علبة هلام مع رقائق الألومنيوم.
  8. لelectrophorese جل في البعد الثاني، وتحويل جل 90 ° بطريقة اتجاه عقارب الساعة وتشغيله لمدة 4-6 ساعة في 2 V / سم في الكلوروكين التي تحتوي على 1X TBE لحل supercoils الإيجابية والسلبية.
  9. وصمة عار الجل مع EtBr لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز. يزيل اللون هلام مع DH 2 O لمدة 15 دقيقة وبعد ذلك تصور التوزيع الحراري للtopoisomers باستخدام تصوير.

النتائج

تشكيل ICL موجهة TFO-هو أمر حاسم لفحوصات البلازميد مقرها، والتي تستخدم لاستجواب الأدوار من البروتينات المعمارية في معالجة ICL في الخلايا البشرية. تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة السطحية لتحديد كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO. البلازميدات إيواء ICLS...

Discussion

تشكيل كفاءة ICLS موجهة TFO هو يعتمد على عاملين هامين: أولا، مكونات عازلة الصحيح (على سبيل المثال، MgCl 2) وتستغرق وقتا من حضانة TFO مع الركيزة الحمض النووي هدفه (تعتمد على تقارب ملزمة للTFO إلى هدفه على الوجهين، وتركيزات المستخدمة). والثانية، والجرعة المناسبة للأشعة...

Disclosures

The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء فاسكيز المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للسرطان [CA097175، CA093279 إلى KMV]. والوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس [RP101501]. تمويل مقابل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان [CA093279 إلى KMV].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5'HMT Psoralen-AG30Midland Certified Reagent Co., Midland, TXCustom orderHPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP KitCell signaling Inc.9003Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq GreenPromegaM7122PCR master mix
HMGB1 antibodyAbcamAb18256
Wizard Gel and PCR cleanup kitPromegaA9281
Chloroquine-diphosphate saltSigmaC6628-50GFor two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRINew England BioLabsR0101S
GenePORTER transfection reagentGenlantisT201015
Vaccinia Topoisomerase IInvitrogen38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lampUpland, CAB 100 APUVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100EpigentekEQC-1100Water bath sonicator
Mylar filterGE Healthcare Life Sciences80112939
AgaroseSigma-AldrichA6111
BIO-RAD ChemidocBIO-RADXRS+ systemDNA imaging system
GlycineFisher ScientificBP381-500
37% FormaldehydeSigma-AldrichF8775-25MLUsed for crosslinking 
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
DMEMThermoFisher11965092Cell culture media
PBSThermoFisher70013073Cell culture
Trypsin-EDTAThermoFisher25200056Cell culture
Bromocresol greenSigma-Aldrich114-359DNA loading dye
Siliconized tubesFisher Scientific 02-681-320Low retention microfuge tube
Tris baseFisher ScientificBP152-1
Boric AcidFisher ScientificA74-1
EDTAFisher ScientificBP24731
PhotometerInternationalLight TechnologiesILT1400-AUVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcomaATCCATCC HTB-96Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLaATCCATCC-CCL-2Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117 interstrand crosslinks 2D supercoiling HMGB1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved