Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

Resumen

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Resumen

cuadro de grupo de alta movilidad 1 proteína (HMGB1) es una proteína de arquitectura no histonas que está implicado en la regulación de muchas funciones importantes en el genoma, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN. HMGB1 se une al ADN estructuralmente distorsionado con mayor afinidad que a B-DNA canónica. Por ejemplo, se encontró que la HMGB1 se une al ADN enlaces cruzados (ICL), que enlazan covalentemente las dos hebras del ADN, provocar una distorsión de la hélice, y si se deja sin reparar puede causar la muerte celular. Debido a su potencial citotóxico, varios agentes inductores de ICL se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos en la clínica. Mientras que los agentes formadores de ICL muestran preferencias por determinadas secuencias de bases (por ejemplo, 5'-TA-3 'es el sitio preferido para la reticulación de psoraleno), inducen daños en el ADN en gran medida de forma indiscriminada. Sin embargo, acoplando covalentemente el agente ICL-inducir a un oligonucleótido formador de triplex-(TFO), que se une al ADN en una secuencia específicamanera, el daño del ADN objetivo se puede lograr. Aquí, nosotros usamos una TFO conjugado covalentemente en 'extremo a un 4'-hidroximetil-4,5 '5 el psoraleno trimetilpsoraleno-8, (HMT) para generar una ICL específica de sitio en un plásmido reportero mutación para su uso como una herramienta de para estudiar la modificación de arquitectura, el procesamiento, y la reparación de las lesiones del ADN complejos por HMGB1 en las células humanas. Se describen las técnicas experimentales para preparar ICL dirigidas-TFO en plásmidos informadores, y para interrogar a la asociación de HMGB1 con los dirigidos ICL-TFO en un contexto celular utilizando ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, se describen ensayos de superenrollamiento del ADN para evaluar la modificación de arquitectura específica del ADN dañado mediante la medición de la cantidad de vueltas superhelical introducidas en el plásmido psoraleno reticulado por HMGB1. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar los papeles de otras proteínas implicadas en el procesamiento y la reparación de ICL dirigidas-TFO u otros daños en el ADN objetivo en cualquier línea celular de interés.

Introducción

Triplex de formación de oligonucleótidos (TFOs) de ADN se unen dúplex de una manera específica de secuencia a través de enlaces Hoogsteen-hidrógeno para formar estructuras de triple helicoidal ^1-5. Tecnología Triplex se ha utilizado para interrogar a una variedad de mecanismos biomoleculares, tales como la transcripción, daño en el DNA de reparación, y la orientación de genes (revisado en las referencias ^6-8). TFOs se han utilizado ampliamente para inducir daño de sitio específico en plásmidos informadores ^9,10. Nuestro laboratorio y otros han utilizado previamente un TFO, GA30, atado a una molécula de psoraleno para inducir reticulaciones entre cadenas de ADN específicas de sitio (ICL) en el gen su p F en el plásmido pSupFG1 ^5,10-12. ICL son altamente citotóxicos ya que estas lesiones se entrecruzan covalentemente las dos hebras de ADN, y si se deja sin reparar, puede bloquear la transcripción de genes e impedir la maquinaria de replicación del ADN ^13,14. Debido a su potencial citotóxico, agentes inductores de ICL-han sido utilizados como fármacos quimioterapéuticos en el tratamientode cáncer y otras enfermedades ^15. Sin embargo, el tratamiento y la reparación de ICL en las células humanas no se entiende bien. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el procesamiento de ICL en las células humanas puede ayudar a mejorar la eficacia de los regímenes quimioterapéuticos basados ​​en ICL. ICL inducidos por TFO y sus intermedios de reparación tienen el potencial de causar distorsiones estructurales importantes para la hélice de ADN. Estas distorsiones son objetivos probables para las proteínas de arquitectura, que se unen a ADN distorsionada con mayor afinidad que a forma canónica B dúplex de ADN ^16-20. Aquí, se estudió la asociación de una proteína de arquitectura muy abundante, HMGB1 con ICL en las células humanas a través de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayos en plásmidos de psoraleno-reticulada y se identificaron un papel para la HMGB1 en la modulación de la topología del ADN plasmídico psoraleno reticulado en humanos lisados ​​celulares de cáncer.

HMGB1 es un muy abundantes y de expresión ubicua no suarquitectónico de proteínas tono que se une al ADN dañado y sustratos de ADN, alternativamente, estructurados con mayor afinidad que forma canónica B ADN ^17-20. HMGB1 participa en varios procesos metabólicos de ADN, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN ^16,21-23. Hemos demostrado previamente que la HMGB1 se une a ICL dirigidas-TFO in vitro con alta afinidad ^20. Además, hemos demostrado que la falta de HMGB1 aumenta el procesamiento mutagénico de ICL dirigidas-TFO y HMGB1 identificado como una reparación por escisión de nucleótidos (NER) co-factor ^23,24. Recientemente, hemos encontrado que la HMGB1 se asocia con ICL dirigidas-TFO en las células humanas y su reclutamiento a tales lesiones depende de la proteína NER, XPA ^16. Superenrollamiento negativo del ADN se ha demostrado que la promoción de la eliminación eficaz de las lesiones del ADN por NER ^25, y hemos encontrado que HMGB1 induce superenrollamiento negativo preferentemente en plas ICL contienen dirigidas-TFOmediados de sustratos (en relación con los plásmidos sustratos no dañado) ^16, que proporcionan una mejor comprensión de la función (s) potencial de HMGB1 como un co-factor de NER. El procesamiento de ICL no se entiende completamente en las células humanas; por lo tanto, las técnicas y ensayos desarrollados en base a las herramientas moleculares descritos en este documento podrían conducir a la identificación de nuevas proteínas implicadas en la reparación ICL, que a su vez pueden servir como dianas farmacológicas que pueden ser explotados para mejorar la eficacia de los regímenes de quimioterapia del cáncer.

Aquí, un enfoque eficaz para evaluar la eficacia de la formación dirigida ICL-TFO en el ADN plásmido mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante se ha discutido. Además, el uso de los plásmidos que contienen las ICL dirigidas-TFO, las técnicas para determinar la asociación de HMGB1 con plásmidos dañadas-ICL en un contexto celular utilizando ensayos de chip modificados se han descrito. Además, un método fácil para el estudio de modificaciones topológicas introducidas por THe proteína HMGB1 arquitectónico, específicamente en sustratos plásmido dañados-ICL en lisados ​​de células humanas se ha determinado mediante la realización de ensayos de superenrollamiento a través de electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones. Las técnicas descritas se pueden utilizar para favorecer la comprensión de la implicación de la reparación del ADN y las proteínas de arquitectura en el procesamiento de daño del ADN objetivo en los plásmidos en las células humanas.

Describimos protocolos detallados para la formación de ICL de psoraleno específicas de sitio dirigidas-TFO en el ADN plásmido, y la posterior ChIP plásmido y superenrollamiento ensayos para identificar proteínas que se asocian con las lesiones, y proteínas que alteran la topología del ADN, respectivamente. Estos ensayos pueden ser modificados para llevar a cabo con otros agentes que daña el ADN, TFOs, sustratos de plásmidos, y las líneas de células de mamíferos de interés. De hecho, hemos demostrado que hay al menos un potencial afinidad único y de alta sitio TFO vinculante dentro de cada gen anotado en el genoma humano ^26. Cómonunca, para mayor claridad, describimos estas técnicas para el uso de un conjugado TFO-psoraleno específico (pAG30) en un plásmido reportero mutación específica (pSupFG1) en células U2OS humanas como hemos utilizado en Mukherjee y Vasquez, 2016 ^16.

Protocolo

1. Preparación de ICL dirigidas-TFO en el plásmido Sustratos

1. Incubar cantidades equimolares de plásmido pSupFG1 ^10,11 ADN (plásmido ADN 5 mg es un buen punto de partida) con psoraleno conjugado TFO GA30 en 8 l de tampón de unión triplex [glicerol al 50%, Tris 10 mM (pH 7,6), MgCl 10 mM _2] y dH ₂ O hasta un volumen final de 40 l en un tubo de color ámbar. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 ° C baño de agua durante 12 hr.
2. Calentar la lámpara de rayos UVA para garantizar la máxima potencia de salida. Coloque la reacción triplex en la película de parafina, y colocar la lámina de parafina en el hielo bajo el (365 nm) de la lámpara UVA. Colocar un filtro Mylar entre la lámpara y la reacción.
3. UVA irradiar para una dosis total de 1,8 J / cm ^2. Almacenar las muestras a 4 ° C para su uso posterior.
   Precaución: Use gafas de protección adecuado y ropa con irradiación UVA.
4. Linealizar 200 ng del plásmido preparado anteriormente con el reenzima restricción Eco R1 en un volumen total de 20 l usando el fabricante suministra 10x tampón. Heat desnaturalizar la enzima durante 20 min a 65 ° C. Girar las muestras durante 10 minutos a 10.000 xg y almacenar a 4 ° C.
5. Preparar 50x tampón alcalino [NaOH 1,5 M, ácido etilendiaminotetraacético 50 mM (EDTA)]. Añadir 0,5 mg de agarosa a 50 ml _{de dH2O} Hervir para disolver la agarosa y colocarlo en un baño de agua a 50 °.
6. Después de que la temperatura de la agarosa disuelta se ha reducido a 50 ° C, añadir 1 ml del tampón 50x alcalino, se mezcla y luego verter el gel en la bandeja de gel. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente antes de su uso.
7. Añadir 4 l de 0,5 M EDTA a los 20 l de muestra de ADN linealizado y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
8. Añadir tampón de carga de gel alcalino 6x (NaOH 300 mM, EDTA mM 6, 18% (w / v) de alto peso molecular polisacárido, 0,06% verde de bromocresol en dH ₂ O) a las muestras y a una escalera de ADN de 1 kb.
   NOTA: Es importante usar un tampón de carga de gel 6x alcalina, por favor véase el debate.
9. Cargar las muestras en el gel en la cámara frigorífica y correr durante la noche en tampón alcalino 1x (12-16 h) en 3,2 voltios por cm. Una vez que las muestras han entrado en el gel, colocar una placa de vidrio en la parte superior del gel para evitar que se flotante.
10. Neutralizar las muestras por inmersión del gel en tampón de neutralización [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, acetato de sodio 3 M (pH 5,2)] durante 45 min a temperatura ambiente.
11. Tinción del gel para el ADN con 4 l de 1% de bromuro de etidio (EtBr) en 50 ml de agua durante 1 hora a temperatura ambiente. Destain con agua durante 15 minutos. Visualizar el ADN mediante el uso de un sistema de imagen.
    Precaución: EtBr es un potente mutágeno y puede ser absorbido por la piel. Evitar el contacto directo con EtBr.

2. Transfección e inmunoprecipitación de los plásmidos que contienen ICL-dirigidos-TFO en las células humanas

1. Placa de 400.000 células de mamíferos (por ejemplo, U2OS océlulas steosarcoma) por placa de 60 mm en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) sin antibióticos 24 h antes de la transfección. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C con 5% de CO _2.
2. Antes de la transfección, el medio de crecimiento caliente y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C en un baño de agua. Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente.
3. Incubar 30 l de reactivo de transfección con 500 l de medio de crecimiento 1x (mezcla 1) y 2 g de tubos de fondo redondo-dirigidas TFO ICL que contiene plásmidos en 500 l de 1x medio de crecimiento (mezcla 2) en separadas 14 ml durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Añadir la mezcla de 1 a 2 mezclar, mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Incubar durante 25-30 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavar las células dos veces con PBS caliente. Añadir la mezcla de transfección de una manera gota a gota distribuir uniformemente a través de la placa de células. Añadir 1 ml de medio de crecimiento a la placa y llevar el volumen final a 2 ml. mezclar nosll. Colocar las placas de cultivo en el incubador a 37ºC con 5% de _CO2 durante 4 horas.
6. Reemplazar los medios de comunicación con los medios 3 ml de crecimiento suplementado con FBS al 10%, y se incuba durante 16 horas más. No utilice antibióticos.
7. Tratar las células con 80 l de 37% de formaldehído fresca por placa a una concentración final de aproximadamente 1% y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente en ausencia de luz.
   Precaución: El formaldehído es tóxico y debe ser manejado de acuerdo con sus instrucciones de seguridad. La exposición al formaldehído puede causar daño a la piel, los ojos y el tracto respiratorio.
8. Se detiene la reticulación de formaldehído mediante la adición de 300 l de glicina enfriada (suministrado en kits disponibles en el mercado) por placa y la incubación durante 5 min. Retire el medio y lavar dos veces con PBS enfriado, y luego recoger las células por raspado en 1 ml refrigerado (4 ° C) de PBS en un tubo de microcentrífuga. Mantener las muestras en hielo en todo momento.
9. Preparar los sedimentos celulares por centrifugación a 4 ° C durante 5 min unat 13.400 xg utilizando una centrífuga de mesa refrigerada. Pipetear a cabo el sobrenadante y coloque el sedimento de células en hielo.
10. Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón A (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min. Mezclar ocasionalmente invirtiendo el tubo. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9).
11. Homogéneamente resuspender el precipitado en 1 ml enfriado (4 ° C) Tampón B (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba en hielo durante 10 min con mezcla ocasional por inversión. Precipitar las células por centrifugación como antes (véase el paso 2.9).
12. Resuspender las células de nuevo en 200 l refrigerados Tampón B. Añadir 2 l de nucleasa microcócica (MNasa) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Mezcla de reacción de vez en cuando con un movimiento rápido del tubo. Detener la reacción MNase colocando el tubo en hielo y añadiendo EDTA 40 mM. Precipitar las células como antes (véase el paso 2.9).
13. Resuspender las células en 100 l 1x immunopr cromatinatampón de memoria intermedia (ChIP) ecipitation (suministrado en kits disponibles en el mercado) suplementado con cóctel inhibidor de la proteasa.
14. Colocar las células resuspendidas en un tubo de microcentrífuga de pared delgada. Sonicar las muestras por ellos flotando en el agua baño de ultrasonido durante 20 segundos, seguido de 20 segundos de incubación en hielo. Repita los pasos del tratamiento con ultrasonidos 9 veces para generar ~ 800-1.200 pb fragmentos.
    1. A 20 l de las muestras sonicadas añadir 3 l 5 M NaCl y 1 l de RNasa A. Mezclar bien por agitación e incubar a 37 ° C durante 30 min. Posteriormente, añadir 2 l de proteinasa K y se incuba durante 2 horas a 65 ° C. Purificar las muestras usando un kit de purificación de PCR. Ejecutar las muestras en gel de agarosa al 1% y visualizar con EtBr.
       NOTA: Intensidad máxima del ADN resultante debe estar en o por debajo de 1.000 pb.
15. En tres tubos separados, añadir 30 l de lisado en un tubo de silicona previamente enfriada y luego añadir 70 l de tampón 1x chip refrigerado con inhibidores de la proteasa añadido. Añadir 1 μg de anti-inmunoglobulina G (IgG), H3 anti-histona (como control positivo), o anticuerpos anti-HMGB1 a los respectivos tubos. Incubar toda la noche en una habitación fría con la rotación continua.
16. perlas de proteína G Resuspender homogéneamente en la habitación fría. Añadir 4 l de proteína G cuentas por tubo y se incuba durante otra 2-4 hr en la cámara fría con la rotación.
17. El uso de un bastidor magnético, sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante. Añadir 200 l de tampón 1x ChIP mezclado con cóctel inhibidor de proteasa para el sedimento y se lava durante 5 minutos en la cámara fría con la rotación. Repetir el lavado dos veces.
18. Realizar un lavado adicional con alto contenido de sal tampón 1x chip (que contenía NaCl 70 mM).
19. Resuspender los sedimentos con tampón de elución 160 l (suministrado en kits disponibles en el mercado) y se incuba a 37 ° C con rotación durante 30 min.
20. Sedimentar las perlas y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. Añadir 6 l de NaCl 5 M y 2 l de proteinasa K, y se incuba durante la noche a 65DO.
21. Se purifica el ADN utilizando un kit de purificación de productos de PCR y se eluye el ADN utilizando 50 l dH ₂ O.
22. Realizar PCR ¹⁶ reacciones que usan conjuntos de cebadores para la región (s) de interés, y resolver los productos en un gel de agarosa al 1% teñido con EtBr.

3. Ensayo de superenrollamiento y 2-dimensional en gel de agarosa La electroforesis

1. Preparar tampón de síntesis de reparación de ADN (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; mM KCl 70; 7,4 mM MgCl _2; TDT 0,9 mM; EDTA 0,4 mM; ATP 2 mM, 20 mM dNTPs, 3,4% de glicerol y 18 mg albúmina de suero bovino) . Almacenar a -80 ° C. Descongelar en hielo y antes de su uso añadir fosfocreatina 40 mM y 2,5 g de creatina fosfoquinasa.
2. Preparar tampón 10x superenrollamiento [500 mM de Tris (pH 8,0), NaCl 500 mM, 25 mM de _MgCl2, EDTA 1 mM], y se almacena a temperatura ambiente.
3. Linealizar 300 ng de ADN plásmido superenrollado pSupFG1 por completo con 1 l de vaccinia topoisomerasa I (5-15 U / l) con 1 monitortampón de superenrollamiento en una reacción de 10 microlitros. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 1 hr.
4. Descongelar HeLa extracto libre de células ²⁴ en el hielo. Para los plásmidos completamente relajado, añadir 25 l HeLa extracto libre de células y el tampón de la síntesis de reparación del ADN. Mezclar bien. Añadir 1 l adicionales de la vacuna topoisomerasa I a la mezcla, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C.
5. Terminar las reacciones mediante la adición de dodecil sulfato de sodio (SDS) (1% de concentración final) y proteinasa K (0,25 mg / ml de concentración final). Incubar a 65 ° C durante 2 hr.
6. Reparto de un gel de agarosa al 1% con tampón 1x Tris Borato EDTA (TBE). Añadir colorante de carga de ADN y cargar las reacciones directamente sobre el gel de al menos 4 carriles separados. Ejecutar el gel de 8-10 horas a 2 V / cm en TBE 1x (dimensión 1) a temperatura ambiente para resolver los topoisomers.
   NOTA: Preparar una solución madre 5x TBE en 1 l de _dH2O mediante la adición de 54 g de base Tris. 27,5 g de ácido bórico y 20 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0).
7. Preparar 2 L de 1xTBE con 3 mg / ml de cloroquina-fosfato. Remojar el gel en 200 ml de esta solución durante 20 min. Cubra la bandeja de gel con papel de aluminio.
8. Para a electroforesis el gel en la segunda dimensión, gire el gel a 90 ° en un sentido horario y ejecutarlo para 4-6 horas a 2 V / cm en la cloroquina que contiene 1x TBE para resolver los supercoils positivos y negativos.
9. Teñir el gel con bromuro de etidio durante 1 hora en un agitador. Destain el gel con dH ₂ O durante 15 min y posteriormente visualizar la distribución térmica de los topoisomers utilizando un generador de imágenes.

Resultados

La formación de la ICL dirigida TFO es crítico para los ensayos basados ​​en plásmidos, que se utilizan para interrogar a las funciones de las proteínas de arquitectura en el procesamiento de ICL en células humanas. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa es una manera fácil de determinar la eficacia de la formación ICL dirigida TFO. Los plásmidos que albergan ICL dirigidas-TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de gel de agarosa (Fig...

Discusión

La formación eficiente de ICL dirigidas-TFO depende de dos factores cruciales: En primer lugar, los componentes del tampón adecuado (por ejemplo, MgCl ₂₎ y el tiempo de incubación de la TFO con su sustrato de ADN diana (depende de la afinidad de unión del TFO a su diana dúplex y las concentraciones se utiliza); y segundo, la dosis apropiada de UVA (365 nm) de irradiación para formar entrecruzamientos de psoraleno de manera eficiente. la formación de triplex óptimo se puede lograr mediante el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Custom order	HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 antibody	Abcam	Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit	Promega	A9281
Chloroquine-diphosphate salt	Sigma	C6628-50G	For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER transfection reagent	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp	Upland, CA	B 100 AP	UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Water bath sonicator
Mylar filter	GE Healthcare Life Sciences	80112939
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ system	DNA imaging system
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Used for crosslinking
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Cell culture media
PBS	ThermoFisher	70013073	Cell culture
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cell culture
Bromocresol green	Sigma-Aldrich	114-359	DNA loading dye
Siliconized tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Low retention microfuge tube
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
Boric Acid	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma	ATCC	ATCC HTB-96	Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc