JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.

Abstract

קבוצת תיבת 1 ניידות גבוהה (HMGB1) חלבון הוא חלבון אדריכלי הלא היסטון כי הוא מעורב בויסות תפקידים חשובים רבים בגנום, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, ותיקון דנ"א. HMGB1 נקשר מעוות מבחינה מבנית DNA עם זיקה חזקה יותר מאשר ב-דנ"א הקנונית. לדוגמה, מצאנו כי HMGB1 נקשר ל- DNA interstrand crosslinks (ICLs), אשר קוולנטית לקשר בין שני גדילי הדנ"א, לגרום לעיוות של הסליל, וכל עוד יוסיפו מתוקנות יכול לגרום מוות של תאים. בשל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, כמה סוכנים וישכנע כיל משמשים כיום תרופות כימותרפיות במרפאה. בעוד יוצרי כיל סוכנים להראות העדפות עבור רצפים בסיס מסוים (למשל, 5'-TA-3 "הוא האתר crosslinking המועדף psoralen), הם בעיקר לגרום נזק לדנ"א באופן בלתי מבוקר. עם זאת, על ידי קוולנטית צימוד הסוכן וישכנע כיל על oligonucleotide יוצרי טריפלקס (TFO), אשר נקשר ל- DNA בתוך ספציפי ברצףבאופן, נזק לדנ"א ממוקד יכולה להיות מושגת. כאן, אנו משתמשים TFO מצומדות קוולנטית על 'קץ 4'-hydroxymethyl-4,5' 5, 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen ליצור כיל אתר ספציפי על פלסמיד מוטציה-הכתב להשתמש ככלי ללמוד את שינוי, עיבוד, ותיקון אדריכלי של נגעים DNA מורכב על ידי HMGB1 בתאים אנושיים. אנו מתארים טכניקות ניסוי להכין ICLs TFO-מכוון על פלסמידים כתב, וכדי לחקור את הקשר בין HMGB1 עם ICLs המכוונת TFO בהקשר הסלולר באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, אנו מתארים מבחני supercoiling DNA להעריך שינוי אדריכלי מסוים של דנ"א פגום על ידי מדידת כמות פניות superhelical הציג על פלסמיד psoralen-crosslinked ידי HMGB1. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אחרים המעורבים בעיבוד ותיקון ICLs TFO מכוונת או נזק לדנ"א ממוקדים אחרים בכל שורת תאים של עניין.

Introduction

טריפלקס יוצרי oligonucleotides (TFOs) לאגד דופלקס DNA בצורה רצף ספציפי באמצעות מליטה מימן Hoogsteen ליצירת מבנים משולשת הסליל 1-5. הטכנולוגיה טריפלקס נעשה שימוש כדי לחקור מגוון של מנגנונים biomolecular, כגון שעתוק, תיקון נזק DNA, גן מיקוד (הנסקרת ב אזכור 6-8). TFOs נעשה שימוש נרחב כדי לגרום נזק לאתר ספציפי על פלסמידים כתב 9,10. המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בעבר TFO, AG30, קשור מולקולה psoralen לגרום crosslinks interstrand DNA ספציפיים לאתר (ICLs) בגן supF על פלסמיד pSupFG1 5,10-12. ICLs הם ציטוטוקסיים מאוד כשהפצעים קוולנטית crosslink שני גדילי דנ"א, וכל עוד יוסיף מתוקן, יכול לחסום שעתוק גנים ומסכל מכונות שכפול הדנ"א 13,14. בגלל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, סוכנים וישכנע כיל שימשו תרופות כימותרפיות לטיפולשל סרטן ומחלות אחרות 15. עם זאת, העיבוד ותיקון ICLs בתאים אנושיים אינו מובן היטב. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בעיבוד של ICLs בתאים אנושיים עשוי לעזור לשפר את היעילות של משטרי כימותרפיות מבוססי כיל. TFO-induced ICLs ביניים תיקון שלהם יש פוטנציאל לגרום לעיוותים מבניים משמעותיים סליל הדנ"א. עיוותים כאלה הן מטרות סבירות עבור חלבונים אדריכליים, אשר נקשרים ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר מאשר ה- DNA דופלקס B-צורה הקנונית 16-20. הנה, למדנו את שיוכה של חלבון אדריכלי בהיקף הנרחב ביותר, HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים באמצעות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים על פלסמידים-crosslinked psoralen וזיהיתי לחיקוי עבור HMGB1 בויסות את הטופולוגיה של DNA פלסמיד-crosslinked psoralen ב אנושי lysates תאים סרטניים.

HMGB1 הוא שופע מאוד בכל מקום בגוף לידי ביטוי שאינו שלוהטון חלבון אדריכלי הנקשרת דנ"א פגום מצעים DNA מובנים לחילופין עם זיקה חזקה יותר מאשר DNA B-הצורה הקנונית 17-20. HMGB1 מעורב בתהליכים מטבוליים כמה DNA, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, תיקון דנ"א 16,21-23. אנחנו הוכחנו בעבר כי HMGB1 נקשר TFO המכוונת ICLs במבחנה עם זיקה גבוהה 20. יתר על כן, אנו הוכחנו כי חוסר HMGB1 הגדיל את עיבוד מוטגנים של ICLs TFO-ביים HMGB1 מזוהה תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) שיתוף גורם 23,24. לאחרונה, מצאנו כי HMGB1 קשור TFO המכוונת ICLs בתאים אנושיים והגיוס שלה נגעים כאלה תלוי חלבון NER, XPA 16. Supercoiling השלילי של DNA הוכח לקדם את ההסרה היעילה של נגעי DNA על ידי נר 25, ומצאנו כי HMGB1 גורם supercoiling השלילי מועדף על יציקה המכילה כיל מכוון TFOמצעים באמצע (יחסית מצעים פלסמידים שאינם פגומים) 16, מתן הבנה טובה יותר של פוטנציאל התפקיד (ים) של HMGB1 בתור גורם שיתוף NER. העיבוד של ICLs לא מובן לחלוטין בתאים אנושיים; וכך, טכניקות המבחנים שהפותחים מבוססות על הכלים המולקולריים המתוארים כאן יכולים להביא לזיהויו של חלבונים נוספים המעורבים תיקון כיל, אשר בתורו עשוי לשמש מטרות תרופתיות כפי שאפשר לנצל כדי לשפר את היעילות של כימותרפיה לסרטן.

הנה, גישה יעילה כדי להעריך את היעילות של היווצרות כיל TFO מכוונת ב- DNA פלסמיד על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose נדונה. יתר על כן, באמצעות פלסמידים המכילים את ICLs TFO-המכוון, טכניקות כדי לקבוע את הקשר של HMGB1 עם פלסמידים פגועים כיל בהקשר הסלולר באמצעות מבחני שבב שונים תואר. בנוסף, שיטה קלילה ללמוד שינויי טופולוגי הציגו ידי הדואר אדריכלי חלבון HMGB1, במיוחד על מצעים פלסמיד פגועי כיל lysates התא האנושי נקבע על ידי ביצוע מבחני supercoiling באמצעות דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה agarose. הטכניקות המתוארות ניתן להשתמש כדי לקדם את ההבנה של המעורבות של תיקון דנ"א וחלבונים אדריכליים בעיבוד של ניזק לדנ"א ממוקד על פלסמידים בתאים אנושיים.

אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להקמת ICLs psoralen אתר ספציפי TFO-מכוון על פלסמיד דנ"א, וצ'יפ פלסמיד עתידי supercoiling מבחני לזהות חלבונים מקשרים עם הנגעים, וחלבונים אשר משנים את הטופולוגיה DNA, בהתאמה. מבחנים אלה יכולים להיות שונים כדי לבצע עם סוכנים מזיקים אחרים לדנ"א, TFOs, מצעים פלסמיד, שורות תאים יונקות עניין. למעשה, הראינו כי יש לפחות פוטנציאל אחד זיקה ייחודית גבוהה TFO מחייב אתר בתוך מכל גן מבואר בגנום האנושי 26. אֵיךפעם, לבהירות תיארנו טכניקות אלה לשימושם של psoralen מצומדות TFO ספציפיים (pAG30) על פלסמיד מוטציה-עיתונאי ספציפי (pSupFG1) בתאים אנושיים U2OS כפי שכבר מנוצל מוקהרג'י & ואסקז 2016 16.

Protocol

1. הכנת ICLs מכוונת TFO על מצעים פלסמיד

  1. דגירה כמויות equimolar של pSupFG1 פלסמיד 10,11 DNA (DNA פלסמיד 5 מיקרוגרם הוא נקודת התחלה טובה) עם psoralen מצומדות TFO AG30 ב 8 μl של חיץ מחייב טריפלקס [גליצרול 50%, 10 מ"מ טריס (pH 7.6), 10 מ"מ MgCl 2] ו dH 2 O לנפח סופי של 40 μl בצינור ענבר. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירת התגובה על אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
  2. לחמם את מנורת UVA כדי להבטיח פלט מלוא העוצמה. מניח את התגובה טריפלקס על סרט פרפין, ומניח את סרט פרפין על קרח תחת מנורת UVA (365 ננומטר). מקום מסנן מיילר בין מנורת התגובה.
  3. UVA מקרין על מינון כולל של 1.8 J / cm 2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C לשימוש נוסף.
    זהירות: תלבש משקפי מגן נאותים ובגדים עם הקרנת UVA.
  4. Linearize 200 ננוגרם של פלסמיד מוכן לעיל עם מחדשאנזים הִצָרוּת R1 אקו בהיקף כולל 20 μl באמצעות היצרן סיפק חיץ 10x. חום לפגל האנזים במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. ספין את הדגימות למשך 10 דקות ב XG 10,000 ולאחסן ב 4 ° C..
  5. כן 50x חיץ אלקליין [1.5 M NaOH, 50 חומצת המ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)]. הוסף 0.5 מ"ג של agarose 50 מ"ל DH 2 O. מרתיחים לפזר את agarose ולמקם אותו באמבט מים C ° 50.
  6. לאחר הטמפרטורה של agarose מומס הוא עד 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מ"ל של חיץ 50x אלקליין, לערבב אותו ואז לשפוך את הג'ל לתוך מגש ג'ל. לאפשר זמן הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  7. הוסף 4 μl של 0.5 מ 'EDTA אל 20 μl של דגימת DNA לינארית דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסף חוצץ טעינת ג'ל אלקליין 6x (300 מ"מ NaOH, 6 מ"מ EDTA, 18% (w / v) פוליסכריד משקל מולקולרי גבוה, 0.06% Bromocresol הירוק ב DH 2 O) על דגימות וכדי סולם DNA 1 kb.
    הערה: חשוב להשתמש חיץ טעינת ג'ל 6x אלקליין, אנא ראה דיון.
  9. דגימות טענו על ג'ל בחדר הקר ולהפעיל לילה חיץ אלקליין 1x (12-16 שעות) בשעה 3.2 וולט לסנטימטר. לאחר דגימות נכנסו ג'ל, מניחים צלחת זכוכית על גבי ג'ל כדי למנוע ממנה צף.
  10. לנטרל את דגימות על ידי השריית את הג'ל במאגר נטרול [1 M טריס-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCl, 3 נתרן אצטט M (pH 5.2)] במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. הכתם ג'ל עבור DNA עם 4 μl של ברומיד ethidium 1% (EtBr) ב 50 מ"ל מים עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. Destain עם מים במשך 15 דקות. דמיינו את ה- DNA באמצעות מערכת הדמיה.
    זהירות: EtBr הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. יש להימנע ממגע ישיר עם EtBr.

2. Transfection ו- Immunoprecipitation של מכוונת TFO כיל מוצרים המכילים פלסמידים בתאים אנושיים

  1. פלייט 400,000 בתאי יונקים (למשל, U2OS oתאי steosarcoma) לכל 60 צלחת מ"מ הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS) ללא אנטיביוטיקה 24 שעות לפני transfection. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2.
  2. לפני transfection, תקשורת צמיחה חמה בופר פוספט (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר.
  3. דגירת 30 μl של מגיב transfection עם 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 1) ו -2 מיקרוגרם של פלסמידים TFO מכוונות המכיל כיל 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 2) צינורות תחתיים עגול 14 מיליליטר נפרד עבור 10 דקות ב טמפרטורת חדר.
  4. להוסיף תערובת 1 לערבב 2, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה של 25-30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שטוף תאים פעמים עם PBS החם. מוסיף את תערובת transfection בצורת טיפה חכמה הפצה באופן שווה על פני הצלחת של תאים. הוסף 1 מ"ל של התקשורת צמיחה לצלחת ולהביא את נפח סופי 2 מ"ל. מערבבים אנחנוll. מניחים את הצלחות תרבות 37 ° C חממה עם 5% CO 2 למשך 4 שעות.
  6. החלף את המדיה עם התקשורת צמיחה 3 מ"ל בתוספת 10% FBS, דגירה נוספת עבור 16 שעות. אין להשתמש באנטיביוטיקה.
  7. פנקו את התאים עם 80 μl של פורמלדהיד טריים 37% לכל צלחת לריכוז סופי של כ 1% ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בהיעדר אור.
    זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל צריך להיות מטופלים על פי הוראות הבטיחות שלה. פורמלדהיד החשיפה יכול לגרום נזק לעור, לעיניים ולדרכי הנשימה.
  8. להרוות crosslinking פורמלדהיד על ידי הוספת 300 μl של גליצין המצונן (מסופק ערכות זמינות מסחרי) לכל צלחת הדוגרים במשך 5 דקות. הסר את המדיה ולשטוף פעמיים עם PBS קר, ולאחר מכן לאסוף תאים על ידי גירוד ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) PBS לתוך צינור microcentrifuge. שמור על דגימות קרח בכל עת.
  9. כן כדורי תא על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 't 13,400 XG באמצעות צנטריפוגות שולחן בקירור. Pipet את supernatant ומניח התא גלול על קרח.
  10. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מיליליטר צונן (4 ° C) הצפה (מסופק ערכות זמינות מסחרי) דגירה על קרח למשך 10 דקות. מערבבים מדי פעם על ידי צינור היפוך. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  11. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) מאגר B (מסופק ערכות זמינים מסחרית) דגירה על קרח למשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך. תאים גלולה ידי צנטריפוגה כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  12. Resuspend התאים שוב 200 μl מקורר הצפת B. הוסף 2 μl של nuclease Micrococcal (MNase) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מערבבים התגובה מדי פעם על ידי מצליף את הצינורית. עצור את התגובה MNase על ידי הנחת הצינור על הקרח והוספת 40 mM EDTA. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
  13. תאים Resuspend ב 100 immunopr הכרומטין 1x μlחיץ ecipitation (שבב) חיץ (מסופק ערכות זמינות מסחרי) השלים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל.
  14. מניחים את התאים resuspended בתוך שפופרת microfuge בעלי קירות דקים. Sonicate הדגימות ידי צפת אותם על sonicator באמבט מים במשך 20 שניות ואחריו 20 דגירה שנייה על קרח. sonication חוזר על שלבי 9 פעמים כדי ליצור ~ 800-1,200 שברים נ"ב.
    1. עד 20 μl של דגימות sonicated להוסיף 3 μl 5 M NaCl ו 1 μl RNase א ומערבבים היטב על ידי vortexing ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בהמשך לכך, להוסיף 2 μl proteinase K דגירה במשך שעה 2 ב 65 מעלות צלזיוס. לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR. הפעל דגימות על ג'ל 1% agarose ולדמיין עם EtBr.
      הערה: עצמה המקסימלית של ה- DNA וכתוצאה מכך צריכה להיות או פחות מ -1,000 נקודות בסיס.
  15. בשלושה צינורות נפרדים, להוסיף 30 μl של lysate בתוך שפופרת siliconized מראש צוננת ולאחר מכן להוסיף 70 μl של חיץ שבב 1x המצונן עם מעכבי פרוטאז הוסיפו. הוסף 1 μגרם של אימונוגלובולינים נגד G (IgG), H3 אנטי היסטון (כביקורת חיובית), או נוגדנים נגד HMGB1 אל צינורות בהתאמה. דגירת הלילה בחדר קר עם סיבוב רציף.
  16. חרוזי החלבון G Resuspend הומוגנית בחדר הקר. הוסף 4 μl של חרוזי חלבון G לכל צינור דגירה במשך 2-4 אחר hr בחדר הקר עם סיבוב.
  17. באמצעות מתלה מגנטית, גלולת החרוזים ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μl חיץ 1x שבב מעורבבים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על הגלולה ולשטוף במשך 5 דקות בחדר הקר עם סיבוב. חזור על לשטוף פעמיים.
  18. בצע אחת לשטוף נוסף עם חיץ 1x שבב מלח גבוה (המכיל 70 המ"מ NaCl).
  19. Resuspend את הכדורים עם חיץ elution 160 μl (מסופק ערכות זמינות מסחרי) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך 30 דקות.
  20. גלולת החרוזים ולאסוף את supernatant בצינור טרי. הוסף 6 μl של 5 M NaCl ו -2 μl של proteinase K, ו דגירה לילה בשעה 65מעלות צלזיוס.
  21. לטהר את הדנ"א בעזרת ערכת טיהור מוצר PCR ו elute את ה- DNA באמצעות 50 μl DH 2 O.
  22. בצע PCR 16 תגובות באמצעות ערכות פריימר לאזור (ים) של עניין, ולפתור את המוצרים על ג'ל 1% agarose מוכתם EtBr.

Agarose ג'ל אלקטרופורזה 3. Assay Supercoiling ו -2 ממדי

  1. הכן חיץ סינתזה תיקון דנ"א (45 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8; 70 מ"מ KCl; 7.4 מ"מ MgCl 2; 0.9 מ"מ DTT; 0.4 mM EDTA; 2 מ"מ ATP, 20 מיקרומטר dNTPs, גליצרול 3.4% ו -18 אלבומין מיקרוגרם שור) . חנות ב -80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח לפני השימוש להוסיף 40 phosphocreatine מ"מ ו 2.5 מיקרוגרם פוספוקינאז קריאטין.
  2. הכן 10x חיץ supercoiling [500 מ"מ טריס (pH 8.0), 500 מ"מ NaCl, 25 מ"מ 2 MgCl, 1 mM EDTA], ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  3. Linearize 300 ננוגרם של DNA pSupFG1 פלסמיד supercoiled לחלוטין באמצעות 1 μl אני topoisomerase Vaccinia (5-15 U / μl) עם 1xחיץ supercoiling בריאקציה 10 μl. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. להפשיר תמצית תא ללא הלה 24 על קרח. כדי פלסמידים רגוע לחלוטין, להוסיף 25 μl הלה תא ללא לחלץ תיקון DNA חיץ סינתזה. לערבב היטב. הוסף 1 μl נוסף של Vaccinia topoisomerase שאני לתערובת, דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לסיים את התגובות על ידי הוספת סודיום דודציל סולפט (SDS) (1% ריכוז סופי) ו proteinase K (0.25 מ"ג / הריכוז הסופי מ"ל). לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  6. עופרת ג'ל agarose 1% עם 1x טריס Borate EDTA חיץ (TBE). להוסיף צבע טעינת דנ"א לטעון את התגובות ישירות על גבי ג'ל לפחות זה מזה 4 נתיבים. הרץ את הג'ל במשך 8-10 שעות ב 2 V / ס"מ TBE 1x (מימד 1) בטמפרטורת החדר כדי לפתור את topoisomers.
    הערה: כן פתרון מניות 5x TBE ב 1 ליטר של DH 2 O על ידי הוספת 54 גרם של טריס בסיס. 27.5 גרם של החומצה הבורית 20 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0).
  7. כן 2 ליטר של 1xTBE עם 3 מיקרוגרם / מ"ל-פוספט chloroquine. משרים את הג'ל 200 מ"ל של פתרון זה עבור 20 דקות. מכסים את המגש ג'ל עם רדיד אלומיניום.
  8. כדי electrophorese הג'ל במימד השני, להפוך את הג'ל 90 ° בצורה כיוון השעון ולהפעיל אותו במשך 4-6 שעות ב 2 V / ס"מ chloroquine המכיל 1x TBE לפתור את supercoils חיוביות ושליליות.
  9. כתם ג'ל עם EtBr במשך שעה 1 על כיסא נדנדה. Destain ג'ל עם DH 2 O למשך 15 דקות ולאחר מכן לדמיין את ההפצה התרמית של topoisomers באמצעות תרמי.

תוצאות

כינונה של כיל מכוון TFO הוא קריטי עבור המבחנים מבוססים פלסמיד, אשר משמשים כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אדריכליים בעיבוד כיל בתאים אנושיים. Denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose הוא דרך קלילה כדי לקבוע את היעילות של היווצרות כיל מכוונת TFO. פלסמידים מחסה ICLs TF...

Discussion

ההיווצרות היעילה של ICLs TFO המכוונת תלויה בשני גורמים מכריעים: ראשית, רכיבי חיץ נכון (למשל, MgCl 2) וזמן דגירה של TFO עם מצע DNA היעד שלה (תלוי הזיקה המחייבת של TFO למטרתה דופלקס, ועל ריכוזי בשימוש); ושנית, את המינון הנכון של UVA (365 ננומטר) הקרנה לגבש crosslinks psoralen ביעילות. הי...

Disclosures

The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדה ואסקז לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים מכון הסרטן בריאות / לאומי [CA097175, CA093279 כדי KMV]; ואת מניעת סרטן מכון המחקר של טקסס [RP101501]. מימון תשלום גישה פתוחה: מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן [CA093279 כדי KMV].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5'HMT Psoralen-AG30Midland Certified Reagent Co., Midland, TXCustom orderHPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP KitCell signaling Inc.9003Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq GreenPromegaM7122PCR master mix
HMGB1 antibodyAbcamAb18256
Wizard Gel and PCR cleanup kitPromegaA9281
Chloroquine-diphosphate saltSigmaC6628-50GFor two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRINew England BioLabsR0101S
GenePORTER transfection reagentGenlantisT201015
Vaccinia Topoisomerase IInvitrogen38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lampUpland, CAB 100 APUVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100EpigentekEQC-1100Water bath sonicator
Mylar filterGE Healthcare Life Sciences80112939
AgaroseSigma-AldrichA6111
BIO-RAD ChemidocBIO-RADXRS+ systemDNA imaging system
GlycineFisher ScientificBP381-500
37% FormaldehydeSigma-AldrichF8775-25MLUsed for crosslinking 
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
DMEMThermoFisher11965092Cell culture media
PBSThermoFisher70013073Cell culture
Trypsin-EDTAThermoFisher25200056Cell culture
Bromocresol greenSigma-Aldrich114-359DNA loading dye
Siliconized tubesFisher Scientific 02-681-320Low retention microfuge tube
Tris baseFisher ScientificBP152-1
Boric AcidFisher ScientificA74-1
EDTAFisher ScientificBP24731
PhotometerInternationalLight TechnologiesILT1400-AUVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcomaATCCATCC HTB-96Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLaATCCATCC-CCL-2Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117oligonucleotideDNADNA interstrand crosslinksassayassay supercoiling 2DHMGB1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved